專利名稱：一種從蛇毒中純化神經生長因子的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用疏水材料、離子交換材料和凝膠排組材料組合的三步法從蛇毒中純化神經生長因子(Nerve Growth Factor，NGF)的方法。
神經生長因子是目前唯一得到鑒定的能夠促進神經細胞生長的生長因子，是交感神經元和某些感覺神經元的生長發(fā)育所必需的一種蛋白質。在臨床上，神經生長因子主要療效表現在以下幾個方面(1)促進修復神經損傷。主要適用臨床病癥有神經炎、原發(fā)性癲癇、神經衰弱、血管神經性頭痛、腦膜炎、腦外科手術后遺癥、農藥中毒性腦病后遺癥、腦中風后遺癥、神經性耳聾，小兒麻痹癥、腦萎縮、肌肉硬索硬化癥等疾?。?2)治療和緩解Alzheimer型老年性癡呆癥、老年性舞蹈癥、帕金森氏綜合癥、格林巴利綜合癥等老年性退行性病癥；(3)能有效地抑制某些腫瘤的有絲分裂，促使其向良性分化，如NGF對黑色素瘤，結腸癌等腫瘤有一定的療效；(4)促進皮膚組織的愈合，特別是對長期性潰爛具有較好療效；(5)促進胚胎早期發(fā)育和調節(jié)抗體免疫功能；(6)具有防止學習和記憶功能缺陷的功能。
目前，盡管在文獻上有許多從蛇毒中提取NGF的層析方法報導，如文獻1[Siigur，G.，etal.，Comp.Biochem.Physiol.，BComp.Biochem，1987，87B(2)，329-34]應用單克隆抗體免疫親合層析法純化了10種不同種類蛇毒中的NGF；文獻2[Kilmon，J.，Am.Biotechnol.Lab.，1992，110(11)，18-20]報道了一種由硅膠和聚氨丙烯構成的、能夠用不同離子交換和親合配體活化的、稱作Acti-Disk Cartridge的微孔纖維床來純化蛇毒中NGF的方法；文獻3[Stoeckel，K.，et al.，J.Neurochem，1976，26(6)1207-11]報道了一種將2.5S NGF通過CNBr連接到Sepharose 4B上，利用親合層析方法從羊血清中提取NGF抗體的方法；文獻4[Khamidor，D.K.，Khim.Prir.Soedim，1985，(4)546-51]和文獻5[Siigur，J.，et al.，Comp.Biochem.Physiol.，Bcomp.Biochem.，1986，83B(3)，621-5]分別報導了用凝膠排組+離子交換+等電聚焦/層析聚焦的方法從蛇毒中提取NGF的方法；文獻6[Koyama，J.，et al.，Biophys.Acta，1992，1160(3)287-92]采用了凝膠過凝+離子交換+親合層析(Blue-Sepharose CL-6B)的方法從蝰蛇(Vipera russelli resselli)中提取了NGF；而最近，文獻7[Kostiza，T.，et al.，Toxico，1995，33(10)，1249-61]報導了用弱陽離子交換+反相液相層析的方法從中華眼鏡蛇蛇毒中提取NGF的方法，等等。但是，從分離介質的化學穩(wěn)定性和商品可獲得性，以便及從純化工藝的可靠性和穩(wěn)定性方面考慮，真正具有實際用途的從蛇毒中提取NGF的方法則是比較經典的、且目前在文獻上大量使用的凝膠過濾+離子交換+凝膠過濾模式[文獻8Hogue-Angeleui，R.A.，et al.，Biochemistry，15(1976)，26；文獻9劉一平等，中華生化藥物雜志，199415(1)]。但這種方法存在以下兩個致命弱點(1)在第一步的凝膠排阻過程中一般都需要100多個小時，不但操作時間太長，而且蛋白與介質的長時間接觸，使得所需的目標蛋白的活性有可能降低。(2)在第一步采用凝膠排組方法，由于凝膠介質吸附容量較小，使得樣品處理量很小，因此，只能用于實驗室少量樣品的制備，很難放大到中試和規(guī)模生產上。
本發(fā)明的目的在于克服上述現有技術的缺點，提出一種用疏水材料、離子交換材料和凝膠排組材料組合的三步法從蛇毒中純化神經生長因子的方法，所用時間為傳統(tǒng)方法的1/10，且?guī)缀蹩删€性地從實驗室放大到中試規(guī)模直至規(guī)模生產化。


圖1是實現本發(fā)明所需的裝置。
如圖1所示，該裝置包括兩個并聯的輸液泵1，輸液泵1的出口和混合器2的一端相連通，混合器的另一端與層析柱3相連通，層析柱3后配置一臺紫外檢測儀4和一臺記錄儀5。實際操作時，兩個輸液泵1用于將兩種溶液泵入層析柱3，混合器2用于將兩種溶液混合均勻，層析柱3用于目標蛋白和其它蛋白的分離，紫外檢測儀4和記錄儀5用于已分離樣品的檢測和記錄。
1、疏水材料、洗脫溶液和洗脫方式的選擇由于NGF具有較強的疏水性，因此所選擇的疏水介質既要有一定的疏水性，但又不能太強，以致NGF不能洗脫下來，如正乙基、聚醚鍵型、正丁基或苯基介質均可作為選擇之一。所選洗脫液既要使樣品中的NGF能完全溶解，又不因沉淀而破壞NGF的活性，如pH在6.0-9.0的緩沖溶液(如20-50mmol/L的含Na+、K+、Mg++、Ca++、NH4+、H2PO4-、HPO42-和SO42-離子的鹽溶液)。所選的洗脫方式以減低鹽濃度的方式進行為宜。
2、離子交換材料、洗脫溶液和洗脫方式的選擇由于NGF的等電點在7.0附近，因此所選擇的離子交換介質既可以按陽離子交換的形式進行，也可以按陰離子交換的形式進行。如苯甲基、磺酸基、磷酸基和二乙酸二乙胺基、季胺基均可作為選擇之一。所選洗脫液既要使樣品中的NGF能完全溶解，又不因沉淀而破壞NGF的活性，如pH在5.0-7.0和7.0-9.0的緩沖溶液(如20-50mmol/L的含Na+、K+、Mg++、Ca++、H2PO4-、HPO42-和Cl-離子的鹽溶液)。所選的洗脫方式以增加鹽濃度的方式進行為宜。
3、凝膠排組材料、洗脫溶液和洗脫方式的選擇由于NGF的分子量在30,000左右，因此所選擇的凝膠排組介質的線性范圍應在此范圍內，且具有良好的非特異性吸附性能。如瓊脂糖、葡聚糖或硅膠材料均可作為選擇之一。所選洗脫液既要使樣品中的NGF能完全溶解，又不因沉淀而破壞NGF的活性，如pH在5.0-9.0的緩沖溶液(如20-50mmol/L的含Na+、K+、Mg++、Ca++、H2PO4-、HPO42-和Cl-離子的鹽溶液)。所選的洗脫方式以等度方式進行為宜。
操作實例取30.0克粗粉狀蛇毒，溶于120ml 10mM的含Na+、K+、Mg++、Ca++、H2PO4-和HPO42-離子的pH＝7.0的緩沖液中，在4,000rpm離心30分鐘，取上清按下列順序純化。
(1)、疏水層析層析柱2.6×50cm填料一種含正丁基的疏水材料，265ml膠平衡液A20mM PBS+1.5M(NH)2SO4，pH＝7.0洗脫液B20mM PBS，pH＝7.0梯度洗脫液B從0～100％，線性梯度流速290cm/h(25ml/min)操作先以平衡液A平衡層析柱30min，再將用樣品上柱，用平衡液A沖洗20min后，開始100min梯度，再以洗脫液B維持20min，最后以平衡液A平衡層析柱以備下次再用。收集含NGF活性的峰約為180ml。
(2)、離子交換層析層析柱2.6×5.0cm填料一種含羧甲基的離子交換材料，265ml平衡液C20mM NaAc-HAc，pH＝5.0洗脫液D20mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH＝5.0梯度洗脫液D從0-100％，線性方式。
流速290cm/h(26ml/min)操作層析柱先以平衡液C平衡30min，再將上一步收集并經脫鹽柱脫鹽的樣品上樣(已轉化成NaAc-HAc溶液)，以平衡液C沖液20min，100min梯度后，繼續(xù)維持洗脫液D20min，再以30min平衡液C平衡層析柱。收集含NGF的活性峰約290ml。
(3)、凝膠排組層析層析柱2.6×125cm填料一種瓊脂糖凝膠材料，660ml洗脫液50mM PBS，pH＝7.0流速124cm/h(11ml/min)操作離子交換層析后的樣品分成三份，每次上樣約100ml。收集樣品約200ml用上述工藝從粗蛇毒中提取NGF，其純化結果總結在表1中。
表1 純化結果總結樣品量(g)回收率123平均 分步回收率 總回收率粗毒30.0 30.0 30.0 30.0100％ 100％疏水材料1.52 1.38 1.42 1.444.8％ 4.80％離子交換0.42 0.32 0.34 0.3625.0％ 1.20％凝膠材料0.130 0.120 0.128 0.126 35.0％ 0.42％各步測定活性和比活結果見表2。
表2各步測定活性和比活結果產率 所得量 總活性 比活(mg) (mg/ml) (B.U.) (B.U./mg)粗毒 30,000 3.501.98×1076.60×102疏水材料 1,4200.453.69×1062.60×103離子交換3400.084.76×1061.40×104凝膠材料1280.012.94×1072.30×10權利要求
一種從蛇毒中純化神經生長因子的方法，其特征在于，取一定量的粗粉蛇毒，溶于PH＝7.0的緩沖液中，離心后取上清依次進行疏水層析，離子交換層析和凝膠排組層析，疏水層析所選擇的疏水介質為正乙基、聚醚鍵型、正丁基或苯基，所選擇的洗脫液為PH在6.0-9.0的緩沖溶液，所選擇的洗脫方式為減低鹽濃度的方式，離子交換層析所選擇的離子交換介質為苯甲基、磺酸基、磷酸基和二乙酸二乙胺基或季胺基，所選洗脫液為pH在5.0-7.0和7.0-9.0的緩沖溶液，所選的洗脫方式以增加鹽濃度的方式，凝膠排組層析所選擇的凝膠排組介質為瓊脂糖、葡聚糖或硅膠材料，所選洗脫液為pH在5.0-9.0的緩沖溶液，所選的洗脫方式為等度方式。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所說的疏水層析洗脫液為20-50mmol/L的含Na+、K+、Mg++、Ca++、NH4+、H2PO4-、HPO42-和SO42-離子的鹽溶液。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所說的離子交換洗脫液為20-50mmol/L的含Na+、K+、Mg++、Ca++、H2PO4-、HPO42-和Cl-離子的鹽溶液。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所說的離子交換洗脫液為20-50mmol/L的含Na+、K+、Mg++、Ca++、H2PO4-、HPO42-和Cl-離子的鹽溶液。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，取30.0克粗粉狀蛇毒，溶于120ml 10mM的含Na+、K+、Mg++、Ca++、H2PO4-和HPO42-離子的pH＝7.0的緩沖液中，在4,000rpm離心30分鐘，取上清按下列順序純化(1)疏水層析先以平衡液A平衡層析柱30min，再將用樣品上柱，用平衡液A沖洗20min后，開始100min梯度，再以洗脫液B維持20min，最后以平衡液A平衡層析柱以備下次再用。收集含NGF活性的峰約為180ml；其中層析柱2.6×50cm、填料為一種含正丁基的疏水材料，265ml膠、平衡液A為20mM PBS+1.5M(NH)2SO4，pH＝7.0、洗脫液B為20mM PBS，pH＝7.0、梯度洗脫液B從0～100％，線性梯度、流速290cm/h；(2)離子交換層析層析柱先以平衡液C平衡30min，再將上一步收集并經脫鹽柱脫鹽的樣品上樣，以平衡液C沖液20min，100min梯度后，繼續(xù)維持洗脫液D 20min，再以30min平衡液C平衡層析柱，其中層析柱2.6×5.0cm、填料一種含羧甲基的離子交換材料，265ml膠、平衡液C20mM NaAc-HAc，pH＝5.0、洗脫液D20mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH＝5.0、梯度洗脫液D從0-100％，線性方式、流速290cm/h(26ml/min)；(3)凝膠排組層析離子交換層析后的樣品分成三份，每次上樣約100ml，其中層析柱2.6×125cm、填料瓊脂糖凝膠材料，660ml、洗脫液50mMPBS，pH＝7.0、流速124cm/h(11ml/min)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用疏水材料、離子交換材料和凝膠排組材料組合的三步法從蛇毒中純化神經生長因子的新方法,可以使所得的神經生長因子純度在97%以上,最低比活為5ul/ml,所用時間為傳統(tǒng)方法的1/10,且所得神經生長因子的活性比傳統(tǒng)方法高一倍。本方法幾乎可線性從實驗室放大到中試規(guī)模直至規(guī)模生產。
文檔編號C07K1/14GK1255503SQ99115898
公開日2000年6月7日 申請日期1999年11月9日 優(yōu)先權日1999年11月9日
發(fā)明者邊六交, 祁淼 申請人:邊六交, 祁淼