專利名稱：鳥類抗體的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用抗傳染性抗原的鳥類抗體治療和/或預(yù)防呼吸道感染。所述抗體在口腔和/或咽通過局部用藥給予。
背景技術(shù)：
和現(xiàn)有技術(shù)眾所周知，例如母雞的家禽物種在其蛋中針對它們已對其免疫的因子產(chǎn)生高效價抗體，對所述馴養(yǎng)鳥類物種進(jìn)行抗所述因子的免疫(4)。在幾個試驗中鳥類抗體已用于在不同動物的消化道中以期望的結(jié)果預(yù)防或治療細(xì)菌或病毒感染(12-17)，但在科學(xué)文獻(xiàn)中沒有證據(jù)說明鳥類抗體或任何其它起源的抗體，在哺乳動物和人類中都不能用于預(yù)防或治療呼吸道感染。傳統(tǒng)上用諸如抗生素治療的常規(guī)療法治療呼吸道感染。不使用抗體的原因是當(dāng)治療呼吸道感染時，沒有發(fā)現(xiàn)給予抗體的可能途徑。最令人意想不到的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在口腔和/或咽通過局部用藥給予抗體，可以用于治療呼吸道感染。
發(fā)明概述本發(fā)明首次提議，使用鳥類抗體和/或其抗原結(jié)合片段，生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療呼吸道感染的藥物。
最令人意想不到的是，本發(fā)明人首次提議，當(dāng)在口腔和/或咽通過局部用藥給予(最好是通過漱口和/或吞咽給予)鳥類抗體時，它可以用于預(yù)防和/或治療呼吸道感染。本發(fā)明人通過對人的臨床研究證明了這一點。
本發(fā)明涉及由例如假單胞菌(Pseudomonads)和/或涉及微生物引起的呼吸道感染的治療，所述呼吸道感染即在鼻腔、鼻旁竇、口咽部的淋巴性咽環(huán)(lymphatic ring)、喉(larinx)、氣管、支氣管、細(xì)支氣管和/或肺泡中的感染(即沿呼吸樹下行的所有感染)。
按照本發(fā)明治療和/或預(yù)防呼吸道感染特別適用于那些對感染敏感性增加或被感染風(fēng)險增加的個體，因為所述治療是溫和的，同時沒有不希望的副作用產(chǎn)生。發(fā)明詳述為檢驗用于治療呼吸道感染的抗體的用途，本發(fā)明人選取一組患有胰囊性纖維變性(CF)的患者患者。這些患者對復(fù)發(fā)性感染或銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)慢性呼吸道感染的敏感性增加。胰囊性纖維變性患者至今不得不依靠常規(guī)療法，諸如有時不成功且有不希望的副作用同時產(chǎn)生的抗生素治療。
在胰囊性纖維變性(CF)患者的呼吸道中，銅綠假單胞菌的慢性建群是這種疾病高發(fā)病率和高死亡率的主要原因。一旦從CF患者的痰中分離出銅綠假單胞菌，就很難除去它。只有在建群的很早期，通過強有力的抗生素治療，可以實現(xiàn)該病原體的暫時鏟除，但細(xì)菌很快將再出現(xiàn)(1-3)。至今報道的最好的結(jié)果來自哥本哈根的CF中心(2)，在那里當(dāng)14個CF患者首次出現(xiàn)銅綠假單胞菌陽性培養(yǎng)物時，3周內(nèi)每日口服環(huán)丙沙星和吸入粘桿菌素進(jìn)行治療。在治療后觀察這些CF患者最多達(dá)27個月(總共214個月；平均15.3個月)。在這段時間內(nèi)，所述患者中的兩個變成銅綠假單胞菌的慢性建群(定義為連續(xù)六個月的痰培養(yǎng)物為所述細(xì)菌陽性)，而在214個月中有49個月的痰培養(yǎng)物為銅綠假單胞菌陽性(＝23％)。另一項來自哥本哈根的研究報導(dǎo)，在98.3％的CF患者中，抗假單胞桿菌化學(xué)療程之后，已經(jīng)4個月在痰培養(yǎng)物中再次發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌(3)。
母雞的每個蛋含有超過100mg的抗體。這些抗體由母雞產(chǎn)生并轉(zhuǎn)運到它們的蛋中，在蛋中發(fā)現(xiàn)了高濃度的抗體。通過用殺死的特定細(xì)菌或其片段對母雞重復(fù)免疫，獲得抗細(xì)菌的高效價特異性抗體。通過用殺死的銅綠假單胞菌對母雞重復(fù)免疫，產(chǎn)生抗銅綠假單胞菌的特異性抗體。這些母雞的蛋用于生產(chǎn)高濃度特異性抗體的溶液。
抗體包括兩部分Fab片段(是結(jié)合抗原的抗體部分)和缺乏抗原結(jié)合部分的Fc片段?？诜庖咔虻鞍椎幕驹硎且驗楦蓴_細(xì)菌的粘附和中和由所述病原體產(chǎn)生的毒性。所以應(yīng)當(dāng)通過或者完整的IgY分子或者其抗原結(jié)合片段提供保護(hù)效果，因為兩種物質(zhì)都具有上述功能。實際上Ahren和Svennerholm的工作(5)證明了這一點，Ahren和Svennerholm觀察到抗-CFA/I的Fab片段降低體液分泌(腹瀉)幾乎和血清的非切割的免疫球蛋白部分一樣有效。因此雞IgY的Fab片段具有同完整的IgY分子相似的抗細(xì)菌感染的保護(hù)功能。
相比于來自哺乳動物的(例如牛的)抗體，蛋中的抗體(6)不激活人類補體系統(tǒng)(7)。這具有極大的優(yōu)勢，因為激活的補體因子是非常有效的炎癥反應(yīng)的介質(zhì)。另外，蛋中的抗體同風(fēng)濕因子(rheumafactor)(8)、人Fc受體(9)、細(xì)菌Fc受體(10)或人抗小鼠IgG抗體(11)不反應(yīng)，這使得使用它們很安全。
提供下述實施例是為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，不具有限制性。實施例1制備抗銅綠假單胞菌的鳥類抗體。
通過甲醛固定殺死銅綠假單胞菌細(xì)菌。在0.9％NaCl中洗滌殺死的細(xì)菌，并在-20℃將其冷凍。將0.5ml細(xì)菌同0.5ml弗氏不完全佐劑混合，并用其肌內(nèi)免疫母家雞。以2周的免疫間隔對所述母雞免疫4次。在最初的8周免疫階段后收集蛋，然后繼續(xù)收集。以2-3個月的間隔對母雞進(jìn)行加強免疫，以使它們保持在超免疫狀態(tài)。按照Akita和Nakai，1993(18)的水稀釋法純化所述抗體。通過離心除去沉淀后，于-20℃以30-70ml部分冷凍上清液。
通過免疫印跡法檢驗最終制備物的抗體效價。實施例II病例報告當(dāng)銅綠假單胞菌在兩個CF患者的呼吸道中首次建群時，在3周內(nèi)用口服抗生素環(huán)丙沙星以及粘桿菌素或妥布拉霉素的抗生素吸入治療他們。在抗生素治療的同寸，他們開始用按照實施例1的溶液每日漱口(2分鐘)，此后吞咽抗銅綠假單胞菌的特異性抗體。在此3周階段之后，所述患者按照上述步驟連續(xù)接受抗體，但沒有抗生素，總共超過30個月(分別為26和4個月)。在治療過程中所有的痰培養(yǎng)物對銅綠假單胞菌都是陰性的。(在28個月中0個月陽性＝0％；這應(yīng)當(dāng)和以上提到的哥本哈根研究的結(jié)果對比，后者是214個月中49個月陽性＝23％p＜0.005)。因此，在CF患者的呼吸道中實現(xiàn)了銅綠假單胞菌的完全滅絕。這個結(jié)果強有力地表明，按照本發(fā)明用抗銅綠假單胞菌的抗體漱口和吞咽進(jìn)行治療有效防止了所述細(xì)菌的慢性建群。該效果可能都是由所述鳥類抗體在口腔和/或咽中的局部效果引起的，因為當(dāng)吞咽所述抗體時，其被腸蛋白水解酶降解，在血液中不含有所述抗體(bloodborne)。
對于這些患者，劑量最好為每天大約50mg IgY。采取預(yù)防措施以避免細(xì)菌污染溶液，隨后將所述溶液保持在-20℃。要求所述CF患者每天早晨從冰箱中取出一瓶30-70ml的所述溶液，并在晚上用此溶液漱口2分鐘，隨后吞下它。
病例1一個21歲的女性CF患者。在其出生時通過篩選胎便中的白蛋白(170mg白蛋白/克干重胎便)，隨后進(jìn)行汗測試(Na101，Cl122毫摩爾/千克汗)而診斷。在她生命的前三周已經(jīng)有嚴(yán)重的喂養(yǎng)問題。她頻繁大便，并嚴(yán)重嘔吐，盡管食欲旺盛，但她的體重還是由3430克降至2930克。進(jìn)行適當(dāng)治療之后(在每次呼吸感染時給予胰酶，母乳喂養(yǎng)、額外的維生素、濕帷(mist tent)、物理治療和抗葡萄球菌抗生素)，她開始增加體重，并且目前情況相當(dāng)好。她的身高穩(wěn)定，稍高于她這個年齡的平均高度，最終身高達(dá)169厘米；她的體重通常處于她這個年齡的平均值，但在她7-8歲時有嚴(yán)重的急降，直到15歲她才恢復(fù)到平均體重，在最近兩年，她的體重在53公斤左右，即BMI(體重指數(shù))為18.6。由7歲半開始，她的痰中經(jīng)常有金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，偶爾也有流感嗜血桿菌(Hemophilusinfluenzae)或奇異變形菌(Proteus mirabilis)。她的胸部X射線顯示有輕微但穩(wěn)定發(fā)展的典型CF變化，她的肺功能緩慢惡化至大約75％FVC(強制肺活量)，在19歲時FEV1(在1秒內(nèi)的強制呼氣儲備量(expiratory volume))降到預(yù)測值的大約50％。她的首次銅綠假單胞菌建群發(fā)生在1989年11月。這在兩個階段(每個階段14天)中每天用氨曲南和慶大霉素四號，并在第二個階段中另外口服環(huán)丙沙星，得到有效治療。此后她的痰培養(yǎng)物回復(fù)到較早時的金黃色葡萄球菌和流感嗜血桿菌型式，直至1994年8月。在ceftazidim和妥布拉霉素四號的14天療程后的這段時間，細(xì)菌消失了。
然而，已經(jīng)是1995年1月，又在她的痰中發(fā)現(xiàn)了銅綠假單胞菌。此時決定按照哥本哈根模式(2)給予她一個抗生素療程，即三周內(nèi)口服750mg×3環(huán)丙沙星并吸入200萬單位×2粘桿菌素，而同時開始每天用抗銅綠假單胞菌的鳥類抗體漱口和吞咽。從那時開始持續(xù)每天攝取抗體(至今已26個月)。沒有新出現(xiàn)的銅綠假單胞菌，她的痰中的細(xì)菌型式也回復(fù)正常。在她的血清中沒有任何沉淀素或抗銅綠假單胞菌抗體。在她的血液中還沒有發(fā)現(xiàn)治療的副作用(紅細(xì)胞或白細(xì)胞、血小板(trombocytes)、肝酶或肌酸酐值)。從1995年以來她的胸部X射線以及她的肺功能測試基本未變(FVC仍為75％，F(xiàn)EV1現(xiàn)在為預(yù)測的45％)。她是非?；顫姷呐耍退膰?yán)重疾病而論，必須認(rèn)為她的工作能力(working capacity)(150 Watt)很好。
病例2一個17歲的CF女孩。在她生命的最初兩年，她有復(fù)發(fā)性阻塞性支氣管炎、經(jīng)常油脂過多、氣味難聞、大便松散，并且體重增長很少(在兩歲時體重為9.5公斤)。此時進(jìn)行汗測試，并顯示(revelad)診斷為CF。然后開始加強治療。她的體重回復(fù)到平均值，但她的身高遵循-2 SD曲線，并終止在151厘米。她的主要問題是典型的“遠(yuǎn)端腸梗塞綜合癥(DIOS)”的復(fù)發(fā)性胃病。她的肺一直很好，胸部X射線顯示只有很小的變化，肺功能測試全部處于她這個年齡和身高的平均值或以上(RV(余氣量)是例外1，14＝預(yù)測的186％)。她的工作能力(120 Watt)接近正常。她的痰培養(yǎng)物總是顯示金黃色葡萄球菌和/或流感嗜血桿菌，直至1996年11月。在那時，所述培養(yǎng)物首次顯示銅綠假單胞菌。然后立即對她進(jìn)行三周的口服750mg×2環(huán)丙沙星和吸入320mg×2妥布拉霉素(得不到粘桿菌素)療程。同時她開始每日用抗銅綠假單胞菌的鳥類抗體漱口并吞咽，從那時起她連續(xù)使用它。消除了假單胞桿菌，從那時起(至今4個月)，她的痰中有普通細(xì)菌。她的情況持續(xù)良好。
對另外9個患者獲得了同樣好的結(jié)果，該結(jié)果強有力地顯示了按照本發(fā)明用抗銅綠假單胞菌的鳥類抗體治療銅綠假單胞菌呼吸道感染的預(yù)防和治療效果。在上述兩個患者的治療過程中，在30個痰培養(yǎng)物中沒有發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌陽性培養(yǎng)物。相反，在上文提到的哥本哈根研究中，有23％的陽性培養(yǎng)物，在同本發(fā)明相似的觀察階段中，這些患者中多達(dá)75％-100％的患者有至少一個陽性培養(yǎng)物。
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權(quán)利要求
1.鳥類抗體用于生產(chǎn)治療和/或預(yù)防呼吸道感染的藥物的用途。
2.按照權(quán)利要求1的用途，其中所述感染是細(xì)菌、真菌病毒感染。
3.按照權(quán)利要求1的用途，其中所述藥物用于人類使用。
4.按照權(quán)利要求1的用途，其中所述藥物適于通過局部用藥，在口腔和/或咽給予，最好通過漱口給予。
5.按照權(quán)利要求1的用途，其中所述呼吸道感染是支氣管和/或肺感染。
6.按照權(quán)利要求1的用途，其中所述呼吸道感染對口咽中的淋巴性咽環(huán)起作用。
7.用于治療人類呼吸道感染的方法，包括以下步驟提供一種抗引起所述感染的抗原的鳥類抗體的溶液，通過在口腔和/或咽向所述被感染人局部用藥，給予所述抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用鳥類抗體和/或其抗原結(jié)合片段生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防呼吸道感染的藥物。所述藥物在口腔和/或咽通過局部用藥給予。
文檔編號C07K16/12GK1255862SQ9880502
公開日2000年6月7日 申請日期1998年3月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月20日
發(fā)明者A·拉爾森, H·科爾貝里 申請人:免疫系統(tǒng)Ims公司