專利名稱：來源于八棱絲瓜的核糖體失活蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的核糖體失活蛋白及其制備和應(yīng)用。
在本文中，核糖體失活蛋白可被定義為至少具有下列活性之一的蛋白質(zhì)RNA-N糖苷酶活性，引產(chǎn)蛋白活性，抗病毒特別是抗HIV的活性。該蛋白是寡聚的單肽鏈的簡單蛋白或糖蛋白。
來源于高等植物的核糖體失活蛋白基于它們的分子結(jié)構(gòu)主要分為兩類，類型I蛋白僅有單肽鏈和致核糖體失活活性，該蛋白典型的例子是來自葫蘆科的天花粉蛋白(Trichosanthin簡稱TCS)，苦瓜子蛋白(Momorcharin簡稱MOM)，絲瓜子蛋白(Luffin)，來自石竹科的肥皂草素(Saporin)。類型II蛋白具有二條肽鏈，A鏈具致核糖體失活活性，B鏈具凝集素類活性。該類蛋白的典型代表是蓖麻毒蛋白和相思子毒蛋白。雖然兩種類型蛋白所含肽鏈數(shù)不同，但它們都通過裂解核糖體內(nèi)28S rRNA的4324位腺嘌呤的N-糖苷鍵，而使真核生物細(xì)胞核糖體60S亞基失活(Endo and Tsurugi 1987，J.Biol.Chem.2628128-8130，Stirpe，F(xiàn).et al.1988，Nucl.Acid Res.161349-1357)。
已經(jīng)從葫蘆科，石竹科，商陸科，大戟科植物的不同組織分離到許多種核糖體失活蛋白。從葫蘆科植物的瓜蔞塊根中分離出天花粉蛋白和TAP29，從瓜蔞種子中分離出Trichokilin，從苦瓜子種子中分離出α-Momorcharin和β-Momorcharin(簡稱α，β-MOM)，從絲瓜(Luffa cylindrica)中分離出Luffin-a，b。目前Trichosanthin，α，β-Momorcharin和Luffin-a，b已經(jīng)測定了完整的氨基酸順序。
H.W.Yeung et al也曾從八棱絲瓜中分離出一種Luffaculin(H.W.Yeunget al.Int.J.Peptide Protein Res.38，1991，15-19)，但他們所獲得的八棱瓜蛋白產(chǎn)率低(120mg/Kg種子)活性低(只相當(dāng)于Luffin的1/9)。
本發(fā)明的目的在于尋找一種產(chǎn)率更高，而且純度更高的新的核糖體失活蛋白。
本發(fā)明從八棱絲瓜種子中分離出2種核糖體失活蛋白，SDS-PAGE顯示它們的分子量為28KD，等電點PI＞9。蛙卵活性測試(熊用周等，中國科學(xué)B輯，587-594，1992)表明它們具有強(qiáng)烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成活性。其中一種Luffaculin 1的N端5個氨基酸順序已被測定為Asp-Val-Ser-Phe-Ser-，并比較了它與同屬的Luffa cylindrica種子中分離的Luffin-a，b的頭幾個氨基酸順序以及TCS、α，β-MOM的頭幾個氨基酸順序皆有不同，見附錄。
本發(fā)明采用簡化、溫和的分離純化方法，包括鹽溶液抽提、硫酸銨沉淀、CM-纖維素梯度洗脫、DEAE-纖維素過濾、CM-纖維素再次梯度洗脫。本發(fā)明的方法比現(xiàn)在技術(shù)采用脫殼、有機(jī)試劑脫脂更簡化、更溫和。同時在第一次CM-纖維素梯度洗脫后增加了DEAE-纖維素過濾和CM-纖維素再次層析，獲得了高產(chǎn)率、高純度和高活性的蛋白。
本發(fā)明的核糖體失活蛋白可以用作引產(chǎn)藥物并用于治療滋養(yǎng)層細(xì)胞有關(guān)的腫瘤、惡性腫瘤疾病，如絨癌等，也可以作為天花粉蛋白的替代藥物，用于克服反復(fù)使用產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的核糖體失活蛋白可以用作抗病毒，特別是抗HIV的試劑，也可作為天花粉蛋白治療艾滋病的替代藥物，用于克服反復(fù)使用產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的核糖體失活蛋白可以作為N-糖苷酶用于分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下積極效果(1).可以利用來源豐富的八棱絲瓜種子，采用溫和的提取方法，收率高(可達(dá)500mg/Kg種子)，而且對細(xì)胞體內(nèi)蛋白質(zhì)合成活性比Heung獲得的蛋白高出8-9倍(蛙卵活性測試)。
(2).已經(jīng)檢測了八棱瓜蛋白1的N端5個氨基酸順序為DVSFS，與現(xiàn)有已知的核糖體失活蛋白的N端順序均不同，因此可以作為這類引產(chǎn)、抗病毒蛋白的替代品以克服核糖體失活蛋白(如TCS)反復(fù)使用產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。
現(xiàn)在對附圖作圖面說明

圖1.顯示對Luffaculin 1和2進(jìn)行純化的陽離子交換色譜。
圖2.顯示對Luffaculin 1進(jìn)行再純化的陽離子交換色譜。
圖3.顯示對Luffaculin 1進(jìn)行純度鑒定的毛細(xì)管色譜。
圖4.顯示圖1的Luffaculin 1和2的SDS-PAGE圖。
圖5.顯示圖2的Luffaculin 1的SDS-PAGE圖。
下面結(jié)合附圖通過實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明實施例1.從八棱瓜種子中純化Luffaculins取200g的八棱瓜種子(購自福建漳州菜籽店)，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后加500ml的0.2MNaCl溶液，置4℃浸泡，勻漿二次，用幾層紗布過濾或離心得濾液700ml，加1N HCl調(diào)pH3.8靜置2h，用濾紙過濾或離心得濾液600ml，加固體硫酸銨至40％飽和度，過濾去掉殘渣，上清液續(xù)加固體硫酸銨至95％飽和度，靜置后離心得硫酸銨沉淀，加10mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2 100ml溶解。裝入透析袋，然后對5mM磷酸鈉緩沖液pH6.5溶液透析24h，其間三次換透析外液。透析后粗提液離心(10,000rpm 15’，4℃)后上CM-纖維素-52柱(Backman產(chǎn)品)(28×2.6cm)(預(yù)先用5mM磷酸鈉緩沖液pH6.5平衡好)經(jīng)洗脫2個床體積平衡液后，用0～0.3MNaCl 5mM磷酸鈉緩沖液pH6.5作梯度洗脫，洗脫液通過實時測量于280nM吸收率而檢驗蛋白，見圖1。組分73-77即為Luffaculin 1，組分86、87即為Luffaculin 2。SDS-PAGE見附圖4，合并組分73-77，裝入透析袋，對10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2透析，透析液加入DEAE-纖維素-52(Backman產(chǎn)品)(預(yù)先用10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2平衡)攪拌后過濾，濾液上CM-纖維素-52(Backman產(chǎn)品)(11×1.6cm)(預(yù)先用10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2平衡)，然后用0～0.5MNaCl于10mM磷酸鈉緩沖液pH7.2梯度洗脫，洗脫液通過實時測量于280nM吸收率而檢驗蛋白，見附圖2，組分103和104即為純化的Luffaculin 1，見附圖5。實施例2.Luffaculin 1純度分折經(jīng)二次CM-纖維素-52純化的Luffaculin 1用PF公司的ABI173 MicroBlotte Capillary HPLC System PE-173毛細(xì)管色譜儀C18柱，洗脫液A液(0.1％三氟乙酸)，B液(100％乙腈+0.086％三氟乙酸)以15％B-65％B作為梯度洗脫(140分鐘)并于210nM檢測蛋白，在保留時間84分鐘處獲得單一蛋白峰，見附圖3。毛細(xì)管色譜分析表明本發(fā)明的提取方法獲得的蛋白純度高，同時還可以從實施例3中可以看出，經(jīng)二次CM-纖維素-52分離純化的Luffaculin 1已達(dá)N端一致。實施例3.Luffaculin 1N端氨基酸順序分析經(jīng)二次CM-纖維素-52純化的Luffaculin 1用PE公司的AppliedBiosysterns 476A Protein Sequencer分析N端氨基酸順序，結(jié)果如下Asp-Val-Ser-Phe-Ser-實施例4.
本發(fā)明的八棱瓜蛋白1和2經(jīng)蛙卵活性測試表明其活性比Heung獲得的蛋白高出8-9倍。該項測試表明本發(fā)明的Luffaculin 1和2可以作為TCS、Luffin類高效的引產(chǎn)蛋白和抗病毒蛋白及其替代物。
附錄八棱瓜蛋白1與Luffin-a.b、TCS、α，β-MOM，N端氨基酸順序比較Luffaculin 1DVSFSLuffin-aDVRFSLSGSSLuffin-bANVSFSLSGADTCS DVSFRLSGATα-MOM DVSFRLSGATβ-MOM DVNFDLSTAT
權(quán)利要求
1.一種來源于八棱絲瓜的核糖體失活蛋白——八棱瓜蛋白1(Luffaculin 1)，其特征在于N端氨基酸順序為Asp-Val-Ser-Phe-Ser-，分子量(SDS-PAGE檢測)為28KD。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的八棱瓜蛋白1，其特征在于，它具有強(qiáng)烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成活性。
3.一種來源于八棱絲瓜的核糖體失活蛋白——八棱瓜蛋白2(Luffaculin 2)，其特征在于，它的分子量(SDS-PAGE檢測)為28KD。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的八棱瓜蛋白2，其特征在于，它具有強(qiáng)烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成活性。
5.一種來源于八棱絲瓜的核糖體失活蛋白的分離純化方法，包括鹽溶液抽提、硫酸銨沉淀、CM-纖維素梯度層析、DEAE-纖維素過濾、CM-纖維素二次層析，其特征在于通過DEAE-纖維素過濾和CM-纖維素二次層析。
6.一種來源于八棱絲瓜的核糖體失活蛋白——八棱瓜蛋白，其特征在于，它能作為引產(chǎn)蛋白用于引產(chǎn)，治療相關(guān)腫瘤病、癌癥和病毒性感染疾病，特別是艾滋病毒感染。
全文摘要
從葫蘆科植物八棱絲瓜種子中分離出2種核糖體失活蛋白—八棱瓜蛋白1和2,其分子量都是28KD(SDS－PAGE檢測)。八棱瓜蛋白1的N端5個氨基酸殘基為DVSFS。采用了簡化的溫和的提取方法,獲得了高產(chǎn)率,高純度,高活性的蛋白。該蛋白具有作為引產(chǎn)藥物和抗病毒制劑的商業(yè)應(yīng)用,并可作為N－糖苷酶用于分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究。
文檔編號C07K7/06GK1199738SQ9711260
公開日1998年11月25日 申請日期1997年5月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月16日
發(fā)明者陳明晃, 林玉娟, 葉曉明 申請人:中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所