專利名稱：抗原特異性活化t淋巴細(xì)胞，其檢測和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及引起自體免疫反應(yīng)的肽、這些肽與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子的復(fù)合物、與這些肽或/和肽和MHC的分子的復(fù)合物反應(yīng)的T細(xì)胞亞群，以及這些化合物的診斷和治療用途。
近年來在自體免疫疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和青年期糖尿病(IDDM)的發(fā)展過程的分子間相互作用關(guān)系的探索方面進(jìn)展迅速，同時揭示了這種探索在這些疾病的早期診斷和病因治療中的實(shí)際應(yīng)用。
現(xiàn)在可以肯定，在這些疾病的發(fā)展中除遺傳傾向外，環(huán)境因素也起作用。例如在IDDM中，在遺傳危險(xiǎn)因素方面，只有幾個MHCⅡ型抗原的等位基因與該疾病密切相關(guān)。因此，可能通過分析這些等位基因確定IDDM的高危人群(參見，如Thomson等，Am.J.Hum.Genet.43(1988)，799-816，或Todd等，Nature 329(1987)，599-604)。
在IDDM發(fā)展中涉及的環(huán)境因素可能是作為免疫原的外源性肽序列。關(guān)于這一點(diǎn)還討論了病毒性抗原，其與內(nèi)源性結(jié)構(gòu)有部分同源性。在特別的情形下，特別是產(chǎn)后時期，通過食物吸收的抗原如牛血清白蛋白可產(chǎn)生免疫反應(yīng)，由于與內(nèi)源性結(jié)構(gòu)的同源性，此免疫反應(yīng)可引發(fā)自身攻擊過程。
胰島β細(xì)胞被細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞逐步破壞在IDDM病程中是很典型的。此過程在出現(xiàn)葡萄糖代謝明顯失調(diào)前很長時間就開始了。當(dāng)出現(xiàn)可檢測的糖尿病表現(xiàn)時，90%以上的β細(xì)胞已被破壞。因此，為了對感染者提供病因治療，在高險(xiǎn)人群中早期檢測這些自身攻擊T細(xì)胞就非常重要。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在自身免疫疾病中對內(nèi)源性組織的破壞在開始進(jìn)行得非常慢。在此過程的起始階段，自身攻擊T細(xì)胞可能僅識別一個或幾個自身抗原。Kaufman等(Nature 368(1993)，69-72)和Tisch等(Nature 368(1993)，72-78)在Ⅰ型糖尿病的動物模型(NOD鼠)方面的工作表明，在此鼠系中自發(fā)糖尿病的實(shí)例中，起始T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)定向于谷氨酸脫羧酶。在此情形中，在NOD鼠中開始時只有谷氨酸脫羧酶(GAD)C末端的1-2個表位被識別。在此時還不可能檢測到葡萄糖代謝的變化(如上所述)，但已可以檢測到胰島周炎(perinsulitis)。只是在該病的進(jìn)展期，自身攻擊性T細(xì)胞識別的GAD肽譜才擴(kuò)大。糖尿病變得明顯后，還可能檢測到抗其它胰島細(xì)胞抗原如peripherin、熱休克蛋白HSP65和羧肽酶H的預(yù)活化T細(xì)胞。
有證據(jù)表明在人體中Ⅰ型糖尿病發(fā)展的病因還與對GAD的免疫反應(yīng)有關(guān)。例如，在80%以上的前驅(qū)糖尿病患者中可以檢測到抗GAD自身抗體，但據(jù)認(rèn)為這些自體抗體的病因?qū)W作用小。相反，認(rèn)為在Ⅰ型糖尿病中存在著T淋巴細(xì)胞逐步破壞胰島β細(xì)胞的過程。這些定向于GAD的T淋巴細(xì)胞已被幾個研究組檢測到(Harrison等，J.CLin.Invest，89(1992)，1161;Honeyman等，J.Exp，Med.177(1993)，535)。這些研究組發(fā)現(xiàn)的自身抗體與由GAD 67kd分子的208-404氨基酸組成的肽片段反應(yīng)。
EP-A-0519469中公開了一些來自人GAD 65kd分子且能引起自身免疫反應(yīng)的多肽。這些多肽的氨基酸序列為X-P-E-V-K-(T或E)-K-Z其中X代表由1-10個氨基酸組成的任選序列，Z代表由1-8個氨基酸組成的任選序列。
本發(fā)明的目的是提供新的自身反應(yīng)性肽，它與Ⅰ型糖尿病人的T細(xì)胞反應(yīng)，特別是與最近發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型糖尿病人的T細(xì)胞反應(yīng)，并這樣確定早期自身-表位。
本發(fā)明的目的是通過適合于對自身反應(yīng)性T細(xì)胞進(jìn)行檢測、分離、增殖、無反應(yīng)化或/和消除的肽、肽衍生物或可發(fā)生類似結(jié)合的分子來達(dá)到的。因此，本發(fā)明的主題為包括下列氨基酸序列的肽或肽衍生物(a)氨基酸序列(Ⅰ)G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A，
(b)氨基酸序列(Ⅱ)E-R-G-K-M-I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K，(c)

圖1或2所示的任何一種氨基酸序列，(d)至少6個氨基酸長度的在(a)、(b)或/和(c)所示氨基酸序列中存在的部分區(qū)域，或/和(e)具有與MHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力基本相當(dāng)于(a)、(b)、(c)或/和(d)中所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
本發(fā)明的肽或肽衍生物優(yōu)選包括(a)氨基酸序列(Ⅰ)，(b)氨基酸序列(Ⅱ)，(c)氨基酸序列(Ⅰ)或/和(Ⅱ)的部分區(qū)域，或/和(d)具有與(a)、(b)或/和(c)中氨基酸序列基本相當(dāng)?shù)模cMHC分子結(jié)合的特異性或/親合力的氨基酸序列。
本發(fā)明的肽或肽衍生物優(yōu)選含有氨基酸序列(Ⅰ)的部分區(qū)域L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F或由此衍生物的保留N-末端L-P序列和C-末端H-F序列的序列。
氨基酸序列(Ⅰ)相當(dāng)于人體GAD 65的氨基酸殘基266-290，氨基酸序列(Ⅱ)相當(dāng)于人GAD65的氨基酸序列306-325。圖1和2所示氨基酸序列也是人GAD65的部分序列。
令人驚異地發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)于人GAD65的氨基酸序列266-285和306-325的肽特異性地與從最近發(fā)現(xiàn)的Ⅰ型糖尿病人中分離到的T細(xì)胞亞群反應(yīng)。因此，本發(fā)明的肽為早期自身一表位，可用于Ⅰ型糖尿病非常早期的診斷。另外，本發(fā)明的肽還可通過滅活與此肽反應(yīng)的T細(xì)胞群而用于治療。
與具有氨基酸序列(Ⅰ)和(Ⅱ)的本發(fā)明肽發(fā)生反應(yīng)的T細(xì)胞亞群的優(yōu)選實(shí)例為T細(xì)胞系6/7和6/10，或具有相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特異性的T細(xì)胞。T細(xì)胞系6/7和6/10已按照Budapest條約的規(guī)定，以保藏號DSM ACC 2172(6/7)和DSM ACC 2173(6/10)，于1994年5月10日在“Deutche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH”(DSM)Mascheroder Wey 1b，38124Braunschweig，Germany保藏。
氨基酸序列(Ⅰ)和(Ⅱ)為人谷氨酸脫羧酶(GAD)的65kd異構(gòu)體的部分區(qū)域，其完整氨基酸序列已由Bu等描述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)，2115ff)。氨基酸序列(Ⅰ)和(Ⅱ)是這樣發(fā)現(xiàn)的從Ⅰ型糖尿病人外周血液建立T細(xì)胞系，然后用來自豬腦的GAD體外刺激，再用衍生自人GAD序列的合成肽序列在增殖試驗(yàn)中測試這些T細(xì)胞系。
本發(fā)明的肽可用熟知的合成方法用化學(xué)方法制得，或通過將編碼這些肽的DNA序列在適合的宿主細(xì)胞中(特別是大腸桿菌)克隆和表達(dá)，用遺傳工程方法制得。
另外，本發(fā)明還包括具有上述特別說明的氨基酸序列(Ⅰ)或(Ⅱ)或圖1和2所示氨基酸序列的部分區(qū)域的肽，其長度至少為6個氨基酸，優(yōu)選至少8個氨基酸，特別優(yōu)選至少10個氨基酸，最優(yōu)選至少15個氨基酸。
本發(fā)明肽的最小長度取決于其識別MHC分子、特異性地與其結(jié)合并與相應(yīng)的T細(xì)胞受體反應(yīng)的能力。
本發(fā)明肽中衍生自GAD并與MHC結(jié)合的區(qū)域最大長度優(yōu)選為100個氨基酸，特別優(yōu)選50個氨基酸，最優(yōu)選25個氨基酸。
除具有氨基酸序列(Ⅰ)和(Ⅱ)或其部分區(qū)段的肽外，本發(fā)明還涉及包含有與上述序列基本相當(dāng)?shù)呐cMHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力的氨基酸序列的肽，其優(yōu)選從氨基酸序列(Ⅰ)或(Ⅱ)或可發(fā)生類似結(jié)合的異源性物質(zhì)中通過取代、缺失或插入個別氨基酸殘基或氨基酸殘基短片段衍生而來的肽。
本發(fā)明還特別涉及這樣的肽變異體其序列與上述氨基酸序列不完全相同，但有相同的或密切相關(guān)的“錨位”(anchor position)。此處的專有名詞“錨位”指與MHC分子，特別是與DR3、DR4或DQ型的MHC分子結(jié)合所必需的氨基酸殘基。例如Hemmer等，在Cell 74(1993)，197-203中給出了與DRB10401發(fā)生起動結(jié)合的“錨位”。在本發(fā)明的肽中這種“錨位”得到保留，或用任選具有化學(xué)上密切相關(guān)的側(cè)鏈的氨基酸殘基代替相應(yīng)的氨基酸殘基(如，纈氨酸代替丙氨酸、異亮氨酸代替亮氨酸，反之亦然)?？捎煤唵畏椒ù_定本發(fā)明肽中的錨位即檢驗(yàn)上述特異肽的變異體與MHC分子結(jié)合的能力。本發(fā)明的肽，其特征在于它們具有與上述肽基本相當(dāng)?shù)?、與MHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力。從具有氨基酸序列(Ⅰ)或(Ⅱ)的肽或從圖1和2所示氨基酸序列衍生所得肽，優(yōu)選與母肽或其部分序列具有至少30%的序列同源性，特別優(yōu)選至少50%，最優(yōu)選至少有60%的同源性的肽。
這種已明確定義的肽的變異體的實(shí)例為來自人GAD67的相應(yīng)的同類肽片段，其完整氨基酸序列也已由Bu等，同上描述。
專用詞“與MHC分子結(jié)合的基本相當(dāng)?shù)奶禺愋曰?和親合力”還包括與氨基酸序列(Ⅰ)、(Ⅱ)或圖1和2所示氨基酸序列相比更高的特異性或/和親合力，這具體可在優(yōu)選長度為8-15個氨基酸的肽片段的例子中見到。
另外，本發(fā)明還包括肽衍生物。此用語包括其中一個或幾個氨基酸已通過化學(xué)反應(yīng)衍生的肽。本發(fā)明所指的肽衍生物的例子具體為其中骨架或/和反應(yīng)性氨基酸側(cè)基如游離氨基、游離羧基或/和游離羥基被衍生的那些分子。氨基衍生物的具體例子為磺酸或羧酸酰胺、硫代氨基甲酸乙酯衍生物和銨鹽如鹽酸鹽。羧基衍生物的例子為鹽、酯和酰胺。羥基衍生物的例子為O-酰基或O-烷基衍生物。另外，本發(fā)明的肽衍生物還包括其中一個或幾個氨基酸被20個“標(biāo)準(zhǔn)”氨基酸的天然或非天然氨基酸同系物所代替的那些肽。這種同系物的例子有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、3-甲基組氨酸、高絲氨酸、鳥氨酸、β-丙氨酸和4-氨基丁酸。
特別優(yōu)選這樣的肽它們具有與氨基酸序列(Ⅰ)或(Ⅱ)的肽基本相當(dāng)?shù)摹⑴cMHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力，但與后者相反，它們不會使T細(xì)胞活化，但卻在T細(xì)胞中造成無反應(yīng)性狀態(tài)。
本發(fā)明還包括這樣的多肽其中與MHC結(jié)合的肽片段為更大多肽單元的組分，在這個大多肽單元中，與MHC結(jié)合的肽與多肽單元其余部分之間最好具有預(yù)定的斷裂點(diǎn)，如蛋白酶裂解點(diǎn)。
本發(fā)明的另一個主題是那些帶有能發(fā)出信號的物質(zhì)或標(biāo)記基團(tuán)的肽或肽衍生物，標(biāo)記基團(tuán)，例如有熒光標(biāo)記基團(tuán)(如若丹明、藻紅蛋白)、地高辛、生物素、放射性基團(tuán)或毒性基團(tuán)(如，蓖麻蛋白、霍亂毒素等)。本發(fā)明的肽與標(biāo)記基團(tuán)偶聯(lián)使得肽能夠用作體內(nèi)或體外(如成像)的診斷試劑或用作治療試劑。另外，本發(fā)明的肽還能以例如環(huán)化形式或寡聚形式存在，在這幾種形式中，那些在與MHC分子結(jié)合中具有重要作用的序列被間隔區(qū)分離。
本發(fā)明還涉及那些與前述肽或肽衍生物具有基本相當(dāng)?shù)?、與MHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力的肽模擬物。肽模擬物可以代替肽與MHC分子相互作用，并且與原肽相比，它們的代謝穩(wěn)定性增加、生物利用度提高以及作用時間延長。肽模擬物的產(chǎn)生方法由Giannis和Kolter在“Angew.Chem.”、105(1993)，1303-1326中，Lee等在Bull.Chem.Soc.Jpn.66(1993)，2006-2010中，及Dorsch等在“Kontakte”(Darmstadt)(1993)(2)，48-56中作了描述。參考這些文獻(xiàn)中公開的關(guān)于本發(fā)明肽模擬物的制備。
另外，本發(fā)明還涉及含有至少一種本發(fā)明的肽、肽衍生物或肽模擬物和至少一種MHC分子或MHC分子的肽結(jié)合衍生物的復(fù)合物。在此復(fù)合物中，肽、肽衍生物或肽模擬物與MHC分子或MHC分子的肽結(jié)合衍生物結(jié)合，結(jié)合常數(shù)優(yōu)選為至少10-7l/mol，特別優(yōu)選為10-8-10-9l/mol。另外，肽、肽衍生物或肽模擬物還可與MHC分子共價(jià)連結(jié)，例如通過光聯(lián)劑或共價(jià)遺傳肽-MHC融合。這樣的肽-MHC融合蛋白優(yōu)選含有HLA-DRβ鏈和遺傳融合到其上的自身反應(yīng)性肽的融合蛋白。該復(fù)合物特別優(yōu)選含有MHCⅡ型分子或其肽結(jié)合衍生物。
MHCⅡ型分子優(yōu)選為DR型，例如DR1、DR2、DR3或DR4型。MHCⅡ型分子特別優(yōu)選為DR B1 101、DR B1 0301、DR B1 0401、DR B1 0402、DR B1 0404或DR B1 1601亞型。最優(yōu)選DR B1 0101或DR B1 0401亞型的MHCⅡ型分子。T細(xì)胞系6/7(DSM ACC2172)在DR B1等位基團(tuán)0401和0101或/和1601存在下，在含有氨基酸序列(Ⅰ)的自身反應(yīng)性肽的刺激下增殖。發(fā)現(xiàn)它在DR B1等位基團(tuán)0401存在下，在含有氨基酸序列(Ⅱ)的自身反應(yīng)性肽的刺激下增殖。T細(xì)胞系6/10(DSM ACC2173)在DR B1等位基團(tuán)0401存在下，在含有氨基酸序列(Ⅰ)和(Ⅱ)的自身反應(yīng)性肽的刺激下增殖。
編碼上述MHCⅡ型分子的亞型的基團(tuán)的核苷酸序列公開在Corell等(Mol.Immunol.28(1991)，533-543)中。此處可參考這些文獻(xiàn)。
“MHC分子的肽結(jié)合衍生物”包括天然MHC分子通過蛋白水解裂解或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的MHC分子的片段，其基本保留了它們的肽結(jié)合特性。另外此用語還應(yīng)理解為包括除與肽結(jié)合有關(guān)的MHC部分外還含有另外的多肽組分的融合蛋白。
本發(fā)明的肽-MHC復(fù)合物優(yōu)選通過無肽MHC分子或MHC分子衍生物與本發(fā)明的肽、肽衍生物或肽模擬物結(jié)合的方法而產(chǎn)生。無肽MHC分子可通過例如將天然MHC分子展開以解離結(jié)合肽，并將空的MHC分子再卷曲的辦法而產(chǎn)生(見Dornmair和McConnell，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87(1990)，4134-4138和WO91/14701)。
另一方面無肽的MHC分子還可以通過MHC分子或其衍生物的重組生產(chǎn)而制得。這樣的例子有MHCⅡ型分子在成纖細(xì)胞中表達(dá)(Germain和Malissan，Ann.Rev.Immunol.4(1990)，281-315)，和無膜錨(anchor)的可溶性MHCⅡ型分子衍生物在CHO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(Wettstein等J.Exp.Med，174(1991)，219-228，Buelow等，Eur.J.Immunol，23(1990)，69-76)，及通過在昆蟲細(xì)胞內(nèi)的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)MHCⅡ類分子(Stern和Wiley，Cell68(1992)，465-477;Scheirle等，J.Immunol，149(1992)，1994-1999)。MHCⅠ型分子也在CHO細(xì)胞中(Fahnestock等，Sicience258(1992)，1658-1662)，在昆蟲細(xì)胞中(Jackson等，Proc.Natl.Acad.Sic.USA 89(1992)，12117-12120;Matsamura等，J.Biol.Chem.267(1992)，23589-23595)及在成纖細(xì)胞中(Mage等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)，10658-10661)表達(dá)。
另外，還已知無肽MHC分子可以在大腸桿菌中表達(dá)(Parker等，Mol.Immunol，29(1992)，391-378;Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)，8403-8407;Garboczi等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992)，3429-3433;Altman等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90(1993)，10330-10334)。本發(fā)明參考了這些出版物中描述的MHC分子或MHC分子衍生物的重組表達(dá)技術(shù)。
本發(fā)明復(fù)合物的MHC組分優(yōu)選為重組MHC分子或其肽結(jié)合衍生物，特別優(yōu)選其中膜錨部分或完全缺失的可溶性MHC分子衍生物。
為了鑒別可以提呈本發(fā)明的自身反應(yīng)性肽的MHC分子，將供體的抗原提呈細(xì)胞與標(biāo)記形式的本發(fā)明肽一起孵育，最好先將天然MHC分子變性以解離結(jié)合肽。然后標(biāo)記的MHC-肽復(fù)合物可與亞型特異性抗體一起進(jìn)行免疫沉淀，后者是針對于MHC分子的構(gòu)架組織特異性決定簇，然后通過標(biāo)記肽的存在鑒別此MHC分子。
另外，供體的EBV(Epstein-Barr Virus)轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞可用作抗原提呈細(xì)胞。
例如可以這樣從重組MHC分子衍生物制備本發(fā)明復(fù)合物通過PCR技術(shù)從供體經(jīng)過EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系的CDNA之中分離MHC分子如MHC DR3、DR4或DQ分子的α和β鏈的可溶部分的DAN片段，作為表達(dá)相應(yīng)MHC分子的模板。在此步中，優(yōu)選通過適當(dāng)選擇PCR引物，在α和β鏈的C末端引入純化輔助段，例如寡聚組氨酸片段(如六聚組氨酸片段)。然后，PCR產(chǎn)物可亞克隆在大腸桿菌中，并表達(dá)為包涵體?？捎靡阎椒▽w穩(wěn)定化(參見，以上關(guān)于MHC分子在大腸桿菌中表達(dá)的參考文獻(xiàn))可用金屬螯合親合色譜法純化MHC蛋白。然后，α和β亞單位在肽存在下復(fù)活。
如上所述，本發(fā)明的肽-MHC復(fù)合物還可帶有標(biāo)記基團(tuán)，在此情形下，標(biāo)記基團(tuán)可用已知方法與復(fù)合物中的肽組分以及MHC組分結(jié)合。
本發(fā)明的另一主題為寡聚的肽-MHC復(fù)合物，其含有至少兩個MHC分子或MHC分子衍生物，它們通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用而連結(jié)。這種寡聚的肽-MHC分子復(fù)合物與已知的單體復(fù)合物(對MHC分子而言)相比，一個優(yōu)點(diǎn)是其親合力高，因此診斷或/和治療效力高。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，這種寡聚的復(fù)合物可按已知方法制備，單體肽-MHC復(fù)合物通過化學(xué)偶聯(lián)試劑共價(jià)交聯(lián)，化學(xué)偶聯(lián)劑如從琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶硫基)丙酸酯、3-馬來酰亞氨基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯、馬來酰亞氨基己?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯、二(馬來酰亞氨基甲基)醚、二琥珀酰亞胺基辛二酸酯、戊二醛等。任選地，也可能修飾肽組分或MHC組分的個別氨基酸使特異的偶聯(lián)試劑優(yōu)選進(jìn)攻該位置。這樣，蛋白組分用重組方法或肽組分用化學(xué)合成方法另外引入的半脫氨酸或賴氨酸就可以用SH聯(lián)結(jié)劑或通過氨基進(jìn)行偶聯(lián)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以這樣制備寡聚的肽-MHC復(fù)合物，使連結(jié)于MHC分了的肽組分作為寡聚體，即含有至少2個MHC連結(jié)區(qū)的肽分子，其中對連結(jié)MHC分子起重要作用的序列由間隔區(qū)相互分離。這些間隔區(qū)一般含10-15個氨基酸。使用小的親水氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸或其結(jié)合來構(gòu)成這些間隔區(qū)。當(dāng)無肽MHC分子在這些肽寡聚體存在下復(fù)活時，即形成了本發(fā)明的寡聚復(fù)合物，其所含MHC分子與寡聚肽組分通過非共價(jià)鍵作用交聯(lián)。
另外，可通過修飾重組產(chǎn)生的MHC分子來制備寡聚的肽-MHC復(fù)合物。在構(gòu)建表達(dá)重組的MHCⅡ型分子α或β鏈的載體時，可能在一基因段上進(jìn)行克隆，優(yōu)選在C-末端，該基因段編碼被抗體識別的表位。此抗體可為IgG型，但優(yōu)選為IgM型。然后復(fù)活的單體肽-MHC復(fù)合物與能識別所引入表位的抗體一起孵育，以形成非共價(jià)交聯(lián)的由幾個抗體和幾個肽MHC復(fù)合物組成的免疫復(fù)合物?？捎檬熘姆肿由飳W(xué)技術(shù)，如插入限制性位點(diǎn)或定點(diǎn)突變，將編碼表位的DNA段引入編碼MHC分子α或β鏈的DNA片段中。
本發(fā)明的寡聚的肽-MHC復(fù)合物優(yōu)選含有氨基酸序列(Ⅰ)、(Ⅱ)、圖1和2所示的氨基酸序列、它的部分區(qū)域或/和從中衍生的氨基酸序列的肽，或其肽衍生物或肽模擬物。優(yōu)選用寡聚復(fù)合物作為Ⅰ型糖尿病的診斷或治療試劑。
因此，本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明肽、肽衍生物、肽模擬物或/和肽-MHC復(fù)合物作為活性成分，必要時與一般藥物添加劑結(jié)合的藥物組合物。此組合物可以另外還有輔助刺激成分，如細(xì)胞因子，如IL-2和IL-4或/和表面抗原B7(Wyss-Coray等，Eur.J.Immunol，23(1993)，2175-2180);Freeman等，Science262(1993)，909-911)，它們能與T細(xì)胞表面分子CD-28結(jié)合。輔助刺激組分的存在可改進(jìn)或/和調(diào)節(jié)組合物的治療效果。
另外，本發(fā)明涉及含肽、肽衍生物、肽模擬物或/和肽-MHC復(fù)合物的藥物組合物在制備診斷試劑方面的用途，即用于診斷影響免疫系統(tǒng)的疾病或疾病素質(zhì)(predisposition)，或診斷腫瘤疾病或腫瘤疾病素質(zhì)，特別是診斷自身免疫疾病或自身免疫疾病素質(zhì)，如Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病，優(yōu)選Ⅰ型糖尿病。
然而也可以用類似的方法應(yīng)用于診斷其它自身免疫疾病。這種自身免疫疾病的例子有多發(fā)性硬化，其中可以檢測抗髓磷脂基質(zhì)蛋白或蛋白脂蛋白的活性T細(xì)胞;風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其中可檢測抗Ⅱ型膠原、細(xì)胞角蛋白和Hsp65的活性T細(xì)胞;Basedow病，其中可檢測抗甲狀腺過氧化酶的活性T細(xì)胞。
一般來說，對影響免疫系統(tǒng)的所有疾病的診斷應(yīng)用是可能的，如動脈硬化。在此情形下，已證明疾病與對熱休克蛋白Hsp 65的免疫應(yīng)答有關(guān)(Xu等，Lancet 341，8840(1993)，255-259)。
另一應(yīng)用是與腫瘤抗原反應(yīng)的T細(xì)胞的診斷檢測。例如抗黑色素瘤相關(guān)抗原MAGE1的T細(xì)胞，它是從黑色素瘤病人中分離到的(Vander Bruggen等，Science 254(1991)，1643-1647)。在用傳統(tǒng)方法由于細(xì)胞量不足而檢測不到腫瘤的階段，本發(fā)明的寡聚復(fù)合物，可用于檢測這些T細(xì)胞。另外，特異性反應(yīng)的T細(xì)胞的檢測還可用于監(jiān)測抗腫瘤接種反應(yīng)。
本發(fā)明因此還涉及檢測特異性T細(xì)胞亞群的方法，其特征在于將含T細(xì)胞的樣品，優(yōu)選來自體液如全血的樣品，與本發(fā)明的肽、肽衍生物、肽模擬物或/和本發(fā)明的復(fù)合物接觸，即可檢測T細(xì)胞與肽與復(fù)合物的反應(yīng)。T細(xì)胞與復(fù)合物或肽的特異性反應(yīng)可通過例如T細(xì)胞增殖的增加來檢測，后者可通過例如摻入的放射活性來測量。另一方面，還可用標(biāo)記肽或復(fù)合物直接測定與T細(xì)胞的反應(yīng)。在此方案中，優(yōu)選使用偶聯(lián)有熒光標(biāo)記的肽或復(fù)合物。例如可通過FACS分析進(jìn)行評價(jià)，就是使T細(xì)胞先與偶聯(lián)有T細(xì)胞特異性抗體的第一熒光標(biāo)記物接觸，然后與偶聯(lián)有第二熒光標(biāo)記物的肽-MHC復(fù)合物接觸，通過熒光圖譜分析檢定雙標(biāo)記細(xì)胞。這樣就測定出以那些與本發(fā)明肽或肽衍生物或/和與本發(fā)明肽-MHC復(fù)合物具有特征性反應(yīng)活性的T細(xì)胞亞群。由于特異性T細(xì)胞群在血中濃度低，作為此方法的第一步，應(yīng)該優(yōu)選選擇預(yù)活化的T細(xì)胞，如通過與IL-2孵育或/和與IL-2受體抗體孵育得到特定濃度的IL-2受體陽性T細(xì)胞，然后用例如免疫磁法分離抗體結(jié)合細(xì)胞。另外，可以在T細(xì)胞與肽或復(fù)合物接觸后進(jìn)行預(yù)活化T細(xì)胞的選擇。
在此方法的改進(jìn)中，還可以測定預(yù)活化自身反應(yīng)性T細(xì)胞(即有IL-2受體作為表面標(biāo)記的T細(xì)胞)與非活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞(即無IL-2受體的T細(xì)胞)的比例。
此方法可特別用于診斷Ⅰ型糖尿病，還可用于診斷影響免疫系統(tǒng)的其它疾病，或用于診斷這些疾病的素質(zhì)。
本發(fā)明另外涉及含本發(fā)明肽、肽衍生物、肽模擬物或/和肽-MHC復(fù)合物的藥物組合物在制備治療或預(yù)防影響免疫疾病的試劑方面的用途。關(guān)于本發(fā)明的肽和本發(fā)明的肽-MHC復(fù)合物的治療用途，可以使用例如與毒素偶聯(lián)的肽或肽-MHC復(fù)合物來治療疾病，另外還可以把肽單獨(dú)使用或作為復(fù)合物的成分來治療疾病，雖然它們與T細(xì)胞受體結(jié)合，但不引起T細(xì)胞活化，即具有無反應(yīng)化作用。
這種無反應(yīng)化肽類似物的治療作用是由于這樣的事實(shí)T細(xì)胞受體(TCR)必需與被Ⅰ型或Ⅱ型MHC抗原提呈的肽相互作用，才能活化T細(xì)胞。在此過程中，肽的錨位氨基酸具體負(fù)責(zé)與MHC分子結(jié)合，而肽中的其它氨基酸的貢獻(xiàn)是與TCR相互作用從而對T細(xì)胞產(chǎn)生刺激。因此有可能在肽中由于氨基酸的取代而產(chǎn)生肽類似物，由于存在錨位點(diǎn)，它們?nèi)阅芘cMHC份子結(jié)合，但僅產(chǎn)生部分T細(xì)胞活化或不活化(參見，如Sloan-Lancaster等，Nature 363(1993)，156-159)。這樣，肽類似物有例如使特異表面分子的表達(dá)達(dá)到更高水平(如IL-2受體，LFA-1)的作用，但不發(fā)生增殖或細(xì)胞因子的表達(dá)。與這樣的肽類似物作用的T細(xì)胞被轉(zhuǎn)化成所謂的無反應(yīng)性狀態(tài)，即既使接下來用免疫原性肽常規(guī)刺激后，它們也不再增殖。該無反應(yīng)性狀態(tài)持續(xù)至少7天，因此可用于治療自身免疫疾病。
本發(fā)明的另一治療應(yīng)用是此肽或肽和MHC分子的復(fù)合物可用作抗原。在此情形下，這種抗原可作為免疫原，即刺激免疫反應(yīng)的試劑，或作為耐受原(tolerogen)，即產(chǎn)生免疫耐受的試劑。作為免疫原的應(yīng)用，例如可用作對抗腫瘤抗原的接種。為此目的，此處不用整個腫瘤細(xì)胞，可能注射能被T細(xì)胞識別的腫瘤特異性肽與相應(yīng)的MHC分子的復(fù)合物，特別是寡聚復(fù)合物，以引起抗腫瘤的T細(xì)胞反應(yīng)。為了增加免疫刺激，還可能將此復(fù)合物與另外的刺激物質(zhì)結(jié)合使用。例如細(xì)胞因子如IL2或IL4適合此目的，它可任選并優(yōu)選與本發(fā)明的肽-MHC復(fù)合物共價(jià)連結(jié)。另一種可能性是將此復(fù)合物與那些與激活T細(xì)胞有關(guān)的輔助組分結(jié)合以活化T細(xì)胞，特別是與抗原提呈細(xì)胞的上所必需的表面分子結(jié)合，如表面分子B7。
優(yōu)選的治療配方是將載有肽的MHC分子整合在人工載體中，如脂載體，此配方中還可任選含有膜結(jié)合分子如B7或/和固定化細(xì)胞因子。
本發(fā)明另外涉及與本發(fā)明的肽或肽-MHC復(fù)合物反應(yīng)的T細(xì)胞亞群的分離。此方法是將例如來自預(yù)先采來自病人的體液的含T細(xì)胞的樣品，與本發(fā)明的肽或本發(fā)明的肽-MHC復(fù)合物接觸，這樣就可鑒別與肽或復(fù)合物反應(yīng)的T細(xì)胞，必要時將它們與其它T細(xì)胞分離。在此情形下，還可能在T細(xì)胞與肽或復(fù)合物接觸前或/和后，選擇預(yù)活化的T細(xì)胞，即帶有IL-2受體的T細(xì)胞。
在此方法中，還可使用在載體上呈固定化形式存在的肽或肽-MHC復(fù)合物，這就簡化了陽性反應(yīng)T細(xì)胞群與其它T細(xì)胞分離的方法。通過再刺激，可從用此方法分離的T細(xì)胞亞群中建立T細(xì)胞系。然后，這些自身反應(yīng)性T細(xì)胞系可用于免疫病人。
Ⅰ型糖尿病的特異免疫治療包括首先分離抗自身抗原的特異性T細(xì)胞系自身抗原如IDDM病人的GAD65。然后確定T細(xì)胞系的最佳(fine)特異性，即鑒別自身反應(yīng)性肽。選擇那些識別優(yōu)勢肽的T細(xì)胞系用于隨后接種病人，優(yōu)勢肽即數(shù)種分離到的T細(xì)胞系均可與之反應(yīng)的肽。上述的T細(xì)胞系中特別要提到的是能識別氨基酸序列(Ⅰ)或(Ⅱ)的肽的T細(xì)胞。
如果在病人中沒有明確的優(yōu)勢肽，必須將數(shù)種T細(xì)胞系混合用于隨后接種。在孵育前，所選擇T細(xì)胞系再用抗原提呈細(xì)胞及用適當(dāng)?shù)碾拇碳ぃ源_?；罨肿拥牧己帽磉_(dá)，特別是T細(xì)胞受體的表達(dá)。然后將T細(xì)胞系滅活，例如通過熱處理或/和放射活性照射，優(yōu)選劑量為4000-10000拉德，特別優(yōu)選ca.8000拉德，并皮下注射到作為該細(xì)胞供體的病人的體內(nèi)，細(xì)胞數(shù)量優(yōu)選為107到5×107。一般持續(xù)6-12個月的時間內(nèi)至少注射三次。
然后檢測病人對接種物的T細(xì)胞反應(yīng)。為此，例如用Ficoll密度梯度離心分離病人的外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)并用標(biāo)準(zhǔn)增殖試驗(yàn)來測定由接種物引起的增殖。成功免疫后，作為對接種物的反應(yīng)，應(yīng)該能檢測到病人的PBLs的大量增殖。對免疫成功的進(jìn)一步控制是確定免疫過程中病人的GAD-反應(yīng)性T細(xì)胞的發(fā)生率。這例如可用標(biāo)準(zhǔn)有限稀釋法進(jìn)行，即用自體細(xì)胞與GAD共同孵育后再用4000拉德射線照射，以這種細(xì)胞作為刺激細(xì)胞。如果免疫進(jìn)行得成功，自身反應(yīng)性T細(xì)胞發(fā)生率明顯減少。
被起調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞所識別的接種物T細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步窄化后，還可能用起調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞的部分結(jié)構(gòu)，如T細(xì)胞受體片段來免疫。
另外，在抗腫瘤免疫的情形下，可以再注射有分裂能力的T細(xì)胞，這可導(dǎo)致病人對腫瘤細(xì)胞的主動免疫。
在鑒別或活化/抑制特異性T細(xì)胞亞群的診斷和治療方法中，還可以用能激活MHC-肽復(fù)合物活性的抗個體基團(tuán)型(antiidiotypic)抗體代替本發(fā)明的肽或肽-MHC分子。這種抗體易于得到，可用抗特異肽的特異性T細(xì)胞亞群作為免疫原以產(chǎn)生抗體(如在鼠中)，或首先產(chǎn)生抗MHC-肽復(fù)合物的第一種抗體，然后再產(chǎn)生抗第一種抗體的抗個體基因型抗體。
因此，本發(fā)明的另一主題是抗本發(fā)明肽或肽衍生物或抗本發(fā)明復(fù)合物的抗體(第一抗體)，它可以通過用此肽、肽衍生物或復(fù)合物免疫，并分離免疫產(chǎn)生的抗體而得到，優(yōu)選為Kohler和Milstein的方法或進(jìn)一步改進(jìn)的方法產(chǎn)生的單克隆抗體。
最后，本發(fā)明還涉及抗第一抗體的抗個體因基型抗體，第一抗體是抗本發(fā)明肽或肽衍生物或復(fù)合物的抗體，用第一抗體免疫并進(jìn)行分離即得到由免疫產(chǎn)生的抗個體基團(tuán)型抗體。
本發(fā)明的又一主題物是能與本發(fā)明的自身反應(yīng)性肽、肽衍生物或肽模擬物或此肽與MHC分子的復(fù)合物反應(yīng)的T細(xì)胞。T細(xì)胞優(yōu)選的實(shí)例是來自T細(xì)胞系6/7(DSMACC2172)或6/10(DSMACC2173)的T細(xì)胞，或具有基本相當(dāng)?shù)腡細(xì)胞受體結(jié)合特異性的T細(xì)胞，即可識別MHC分子提呈的肽或具有氨基酸序列(Ⅰ)或(Ⅱ)或/和這些氨基酸序列部分區(qū)域的肽的T細(xì)胞。
下列實(shí)施例結(jié)合圖1-4，用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
圖1表示本發(fā)明的自身反應(yīng)性氨基酸序列圖2表示本發(fā)明的另一些自身反應(yīng)性氨基酸序列圖3表示T細(xì)胞系6/7與肽庫增殖試驗(yàn)的結(jié)果圖4表示T細(xì)胞系6/10與肽庫增殖試驗(yàn)的結(jié)果圖5表示T細(xì)胞系6/7與來自肽庫7和11的單一肽的增殖試驗(yàn)的結(jié)果圖6表示T細(xì)胞系6/10與來自肽庫7和11的單一肽的增殖試驗(yàn)的結(jié)果。
實(shí)施例1建立GAD特異性T細(xì)胞系1.初級刺激用Ficoll密度梯度離心法從Ⅰ型糖尿病人的EDTA抗凝血中分離外周血液淋巴細(xì)胞(PBLs)。這些細(xì)胞用RPM1培養(yǎng)液洗滌兩次，并懸浮在由RPMI 1640、5%人血清、2mM谷氨酰胺和100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素組成的培養(yǎng)基中。將相當(dāng)于100000個細(xì)胞的100μl細(xì)胞懸浮液置于96孔圓底培養(yǎng)板的每個孔中。然后加入終濃度為2.5μg/ml的豬GAD(SW-GAD)。在37℃/7%CO2孵箱中將細(xì)胞孵育3-4天。這段時間后，加入100μl IL-2(30u/ml)。再過3-4天后，從所有培養(yǎng)混合物中每孔吸出100μl，再加入100μlIL-2(30u/ml)。每3-4天重復(fù)一次。
2.再刺激初級刺激開始后第14天進(jìn)行第一次再刺激。為此，用Ficoll方法分離初級刺激中的兩倍數(shù)目的自體PBLs，調(diào)節(jié)在培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度為2×106/ml。這些刺激物細(xì)胞的一半與抗原SW-GAD(終濃度5μg/ml)孵育2小時/37℃/7%CO2(抗原脈沖性刺激)。另一半在相同條件下不接觸抗原，僅與培養(yǎng)基孵育。然后，所有刺激物細(xì)胞用4000拉德照射。再將刺激物細(xì)胞分布在96孔圓底板中(100000個細(xì)胞/孔)，其排布方式使含抗原的刺激物細(xì)胞孔總與無抗原的刺激物細(xì)胞孔相鄰。
然后從初級刺激制備物中制備T細(xì)胞。為此，從初級刺激制備物中吸出上清液，盤中的細(xì)胞用DMEM液洗兩次，每次用100μl(Dulbeccos Modified Fagk Medium＝DMEM)。每次沖洗后細(xì)胞在盤中以400g離心沉淀。然后將每孔細(xì)胞懸浮在100μl培養(yǎng)基中，將各50μl細(xì)胞懸液分配在再刺激盤的兩個相鄰的孔中。以此方式，在一有抗原的孔中和相鄰的無抗原的孔中孵育T細(xì)胞，這可以監(jiān)視再刺激的抗原特異性。
再刺激開始后第2天或第3天，可以通過顯微鏡評估其增殖。在此過程中，只有那些反在有抗原的孔中發(fā)生增殖的微培養(yǎng)對被視為有意義。從第4天，向每個培養(yǎng)孔中依次加入100μlIL-2(30u/ml)。直到第14天，每3-4天將ca.50%的培養(yǎng)基用IL-2(30u/ml)交換。
當(dāng)生長良好時，將培養(yǎng)物分裝于幾個96孔盤中。在以后的再刺激中，還可以將它們分布在較大的孔中。用上述方法每兩周進(jìn)行一次新的再刺激。從第3次再刺激起，用增殖試驗(yàn)測定微培養(yǎng)物的特異性。
3.與SW-GAD的增殖試驗(yàn)所有試驗(yàn)在至少兩份制備物中進(jìn)行。
a)刺激物細(xì)胞以HLAⅡ型抗原相同的自體PBLs或血常供體的PBLs作為刺激物細(xì)胞。如2中所述，PBLs與抗原一起預(yù)培養(yǎng)，用4000拉德照射，分布在96孔盤中(100000細(xì)胞/孔)。
b)T細(xì)胞所用T細(xì)胞總來自再刺激階段的最后一步。這些細(xì)胞用DMEM洗三次，除去抗原和IL-2，然后分成6000個細(xì)胞/96孔。如此分離的T細(xì)胞系6/7和6/10，按照Budapest條約的規(guī)定，已在DSM保藏，保藏號為DSMACC2172和DSMACC2173。
除與SW-GAD孵育外，對照孵育無GAD。
37℃/7%CO2下3-4天后，加入1μCiH-胸苷，再孵育16-20小時。然后用細(xì)胞收集儀將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一玻璃纖維濾器上，用β計(jì)數(shù)器測定摻入的放射活性。
表1表示與SW-GAD的增殖試驗(yàn)的典型結(jié)果。
表1T細(xì)胞系6/7和6/10與SW-GAD的增殖試驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞系對照cpm
無抗原SW-GAD6/712993736/1011752224.與衍生自H-GAD序列的肽的增殖試驗(yàn)已通過至少4個再刺激循環(huán)而擴(kuò)增，并在增殖試驗(yàn)中與SW-GAD反應(yīng)的T細(xì)胞系，再與H-GAD的重疊肽進(jìn)行試驗(yàn)。這些試驗(yàn)的目的是確定被T細(xì)胞識別的H-GAD的表位。為此，首先合成H-GAD的重疊的20mer肽(重疊區(qū)10個氨基酸，總共有59種不同的肽)。
每4-5個這種肽合并成一個庫，并以終濃度18μg/ml加入到刺激物細(xì)胞中(刺激物細(xì)胞按3a部分所述方法制備)。這些刺激物細(xì)胞的進(jìn)一步處理如3a部分所述。
然后，每個微培養(yǎng)孔中加入6000-20000個T細(xì)胞。以下步驟類似于3b部分所述。
圖3和4表示T細(xì)胞系6/7和6/10用人GAD 65kd的肽庫進(jìn)行增殖試驗(yàn)的結(jié)果。兩個T細(xì)胞系都與庫11的肽旺盛增殖。與庫7的增殖反應(yīng)也被觀察到，反應(yīng)雖稍弱但卻很明顯。
圖5和6表示T細(xì)胞系6/7和6/10與庫7和11的10μg/ml單一肽的增殖試驗(yàn)結(jié)果。兩個細(xì)胞系都與肽5G1(相當(dāng)于人GAD65的氨基酸266-285)有明顯增殖，與肽5F3(相當(dāng)于人GAD65的氨基酸306-325)的增殖較差但也明顯。
實(shí)施例2分離和測定抗原特異性T細(xì)胞亞群的方法因?yàn)榭乖禺愋訲淋巴細(xì)胞，特別是抗自身抗原的特異性T淋巴細(xì)胞在外周血液中的數(shù)量很小(預(yù)計(jì)頻率為10-5-10-6)，很明顯，需要通過選擇步驟首先濃縮在體內(nèi)預(yù)活化的T細(xì)胞。這可通過兩種方法達(dá)到1.與IL-2孵育擴(kuò)增體內(nèi)預(yù)化T細(xì)胞為此，用Ficoll密度梯度離心方法分離PBLs，并調(diào)節(jié)使其在含IL-2的細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI 1640/5%人血清/30u/ml IL-2)中濃度為2×106細(xì)胞/ml。將每等份200μl的細(xì)胞分配在幾個48孔盤中，并培養(yǎng)7天。4天后，再一次加入IL-2。因?yàn)轭A(yù)活化T細(xì)胞表現(xiàn)高親合力IL-2受體，在此刺激階段，體內(nèi)預(yù)活化T細(xì)胞選擇性地繁殖，并在初級培養(yǎng)中積累。刺激階段結(jié)束后，洗滌每個孔中的細(xì)胞，計(jì)數(shù)并用于增殖試驗(yàn)。
2.通過免疫磁分離濃縮體內(nèi)預(yù)活化T細(xì)胞為此，將Ficoll分離的PBLs與抗高親合力IL-2受體的單克隆抗體一起孵育(7×106PBLs/ml;10μl/ml抗IL-2受體抗體(Boehringer Mannheim);30分鐘，4℃。然后，細(xì)胞懸浮液用冰冷卻的RPMI/10%人血清(HS)(400g/10分鐘)洗滌兩次，再將懸浮液調(diào)節(jié)至細(xì)胞密度為1-3×107/ml。將偶聯(lián)上綿羊抗-鼠抗體的Dynal公司的DynabeadsM-280加入此中(Dynabeads與靶細(xì)胞的比例為ca.10-15)。將懸浮液4℃下在搖床上非常緩慢地振動。然后，懸浮液用RPMI/10%HS稀釋10倍，并在事先預(yù)冷的磁顆粒濃縮器(MPC)中放置1-2分鐘。帶有IL-2受體的玫瑰花環(huán)T細(xì)胞被磁體固定后，吸出上清液，從MPC中去除孵育容器，保留下來的細(xì)胞重新懸浮在RPMI/10%HS中。在MPC中再進(jìn)行一次靶細(xì)胞的分離。再重復(fù)一次洗滌步驟。然后分離的細(xì)胞再懸浮在培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)目為1×107/ml。通過脫離(detacher)抗體用已知方法去除磁珠。
通過2.1或2.2的方法濃縮的預(yù)活化細(xì)胞然后被用于測試其抗自身抗原肽或抗肽/MHC復(fù)合物的反應(yīng)活性。
這有幾種方法3.用照射的刺激細(xì)胞和肽作為抗原的增殖試驗(yàn)首先，從Ficoll-分離的PBLs制備自身刺激細(xì)胞。將刺激細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度調(diào)至106細(xì)胞/ml，并與肽(終濃度10μg/ml)孵育2小時/37℃/7%CO2。然后用4000拉德照射刺激細(xì)胞，再份配在一96孔圓底培養(yǎng)板中，細(xì)胞數(shù)為100000細(xì)胞/孔。
向每孔中加入用2.1或2.2方法所得體內(nèi)預(yù)活化T細(xì)胞100000個，并在37℃/7%CO2下孵育4天。然后該制備物體積的一半用IL-2(30u/ml)置換。再過4天后，重復(fù)一次。
在微培養(yǎng)開始后第12天，進(jìn)行實(shí)際的繁殖試驗(yàn)。為此，微培養(yǎng)物首先用DMEM洗兩次，以去除抗原和IL-2。將每個培養(yǎng)物分成4等份，在100000照射的自體PBLs存在下雙份孵育(37℃/7%CO2)3天，每例中分有肽或無肽的脈沖性刺激兩種。然后加入3H-胸苷，再過16-20小時后測定摻入的放射活性。
4.用標(biāo)記的寡聚肽/HLA復(fù)合物直接檢測自身反應(yīng)性T細(xì)胞。
此處使用經(jīng)2.2的方法濃縮的體內(nèi)預(yù)活化T細(xì)胞。調(diào)節(jié)細(xì)胞在RPMI/10%HS中的濃度為106/ml，并在40℃下與帶有熒光標(biāo)記的寡聚的HLA-肽復(fù)合物孵育30分鐘。然后用冰冷的細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次。在流式細(xì)胞計(jì)中對熒光標(biāo)記的細(xì)胞群進(jìn)行分析。
實(shí)施例3提呈特定的自身反應(yīng)性肽的MHC分子的鑒別首先將肽按Bolton和Hunter的方法用125I標(biāo)記(Bolton，A.E.和Hunter，W，M.，Biochem.J.133(1993)，529-531)。然后將MHC型待測的供體的2-5×106PBLs在37℃下在含125I-標(biāo)記肽(2-10μM)的細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育4個小時。細(xì)胞洗滌后，在由0.5%NP40;0.5%Mega 9;150mMNaCl;5mMEDTA;50mMTris pH7.5;2mM苯甲磺酰氟組成的溶解緩沖液中溶解。用連于蛋白A-Sepharose的構(gòu)架(framework)特異性單克隆抗體(如針對HLA-DR的單克隆抗體L243(ATCC HB55))從混合物中將MHC分子免疫沉淀，并用γ計(jì)數(shù)器測定結(jié)合在蛋白A-Sepharose上的放射活性。
實(shí)施例4
能提呈自身反應(yīng)性肽給T細(xì)胞系6/7(DSM ACC2172)和6/10(DSMACC2173)的MHC分子亞型的測定實(shí)驗(yàn)步驟類似于實(shí)施例1.3。但不用自體PBLs作為抗原提呈細(xì)胞，而用異源供體的PBLs，它與從自身中分離出T細(xì)胞系的供體的MHC分子不完全相應(yīng)，而只是所限定的MHC等位基因相應(yīng)。用自身抗原性肽5G1(相當(dāng)于人GAD65的氨基酸266-285)和5F3(相當(dāng)于GAD65的氨基酸306-325)進(jìn)行增殖試驗(yàn)。
表3表示該試驗(yàn)的結(jié)果。在DR B1等位基因0401存在下，T細(xì)胞系6/7和6/10與兩種肽作用后都可以增殖。DQ A1或DQ B1等位基因的變異對T細(xì)胞系的刺激反應(yīng)性無影響。T細(xì)胞系6/7識別肽5G1還與等位基因B1 0101或/和1601有關(guān)。

實(shí)施例5使用T細(xì)胞系6/10測定肽5G1的變異體的增殖試驗(yàn)為了闡明刺激肽5G1的核心結(jié)構(gòu)，使用T細(xì)胞系6/10來測定此肽的各種變異體的刺激增殖試驗(yàn)(見表4)。
對第一系列20mer變異體的試驗(yàn)，目的在于確定是否5G1結(jié)構(gòu)上C-或N-末端的邊緣氨基酸在被T細(xì)胞系6/10的識別中起作用。刺激指數(shù)表明向C-末端移動20mer肽不增加增殖活性。向N-末端移動6個氨基酸引起刺激能力減低。
用第二系列肽變異體所作的試驗(yàn)，目的是檢查C-末端縮短后對其刺激能力的影響。該系列實(shí)驗(yàn)表明C-末端的氨基酸殘基組氨酸(H)和苯丙氨酸(F)對刺激能力有重要影響。
用第三系列肽變異體的試驗(yàn)，目的是確定最小刺激活性肽的N-末端。如果從18mer去掉亮氨酸(L)和脯氨酸(P)而C-末端不變，這引起刺激指數(shù)大大下降。因此N-末端確定為L和P。如果因去掉H和F而進(jìn)一步縮短C-末端，也導(dǎo)致刺激活性下降。因眥，對T細(xì)胞系6/10，可產(chǎn)生刺激作用的最小肽為序列LPRLIAFTSEHSHF的14mer。
表4為了鑒定具有刺激活性的最小肽結(jié)構(gòu)，TCL6/10與肽5G1的變異體的反應(yīng)。
5G1的肽變異體刺激指數(shù)5G1GMAALPRLIAFTSEHSHFSL5.4ALPRLIAFTSEHSHFSLKKG3.0RLIAFTSEHSHFSLKKGAAA3.2PEVKEKGMAALPRLIAFTSE0.6AALPRLIAFTSEHSHFSL4.5AALPRLIAFTSEHSHF2.9AALPRLIAFTSEHS0.7AALPRLIAFTSE0.6GMAALPRLIAFTSE0.8GMAALPRLIAFT1.0LPRLIAFTSEHSHFSLKK3.2RLIAFTSEHSHFSL1.4LPRLIAFTSEHSHF4.6LPRLIAFTSEHS0.權(quán)利要求
1.包括下列氨基酸序列的肽或肽衍生物(a)氨基酸序列(Ⅰ)G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A(b)氨基酸序列(Ⅱ)E-R-G-K-M-I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K(c)下列氨基酸序列中的一種I-L-I-K-C-D-E-R-G-K-M-I-P-SL-G-I-G-T-D-S-V-I-L-I-K-C-DL-A-F-L-Q-D-V-M-N-I-L-L-Q-YY-D-L-S-Y-D-T-G-D-K-A-L-Q-CV-S-Y-Q-P-L-G-D-K-V-N-F-F-RL-A-A-D-W-L-T-S-T-A-N-T-N-ML-L-Y-G-D-A-E-K-P-A-E-S-G-GV-N-Y-A-F-L-H-A-T-D-L-L-P-AL-L-Q-Y-V-V-K-S-F-D-R-S-T-KF-T-Y-E-I-A-P-V-F-V-L-L-E-YL-E-Y-V-T-L-K-K-M-R-E-I-I-GN-M-Y-A-M-M-I-A-R-F-K-M-F-PK-I-W-M-H-V-D-A-A-W-G-G-G-LW-G-G-G-L-L-M-S-R-K-H-K-W-KE-G-Y-E-M-V-F-D-G-K-P-Q-H-TR-Y-F-N-Q-L-S-T-G-L-D-M-V-GW-L-T-S-T-A-N-T-N-M-F-T-Y-ET-A-N-T-N-M-F-T-Y-E-I-A-P-VL-V-S-A-T-A-G-T-T-V-Y-G-A-FY-I-P-P-S-L-R-T-L-E-D-N-E-EV-I-S-N-P-A-A-T-H-Q-D-I-D-F(d)長度為至少6個氨基酸的(a)、(b)或/和(c)中所示氨基酸序列的部分區(qū)域，或/和(e)具有與(a)、(b)、(c)或/和(d)中所示氨基酸序列基本相當(dāng)?shù)?、與MHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的肽或肽衍生物，包括(a)氨基酸序列(Ⅰ)，(b)氨基酸序列(Ⅱ)，(c)氨基酸序列(Ⅰ)或/和(Ⅱ)的部分區(qū)域，或/和(d)具有與(a)、(b)或/和(c)的氨基酸序列基本相當(dāng)?shù)?、與MHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2的肽或肽衍生物，其中其長度為至少8個氨基酸。
4.權(quán)利要求1-3之一的肽或肽衍生物，其中其長度為至少10個氨基酸。
5.權(quán)利要求1-3之一的肽或肽衍生物，其中其長度達(dá)25個氨基酸。
6.權(quán)利要求1-5之一的肽或肽衍生物，其中它帶有標(biāo)記基團(tuán)。
7.肽模擬物，其中它與MHC分子結(jié)合的特異性或/和親合力與權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物的基本相當(dāng)。
8.含有至少一種能與MHC分子或MHC分子的肽結(jié)合衍生物結(jié)合的、在權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物或權(quán)利要求7的肽模擬物的復(fù)合物。
9.權(quán)利要求8的復(fù)合物，其中它含有MHCⅡ型分子或其肽結(jié)合衍生物。
10.權(quán)利要求9的復(fù)合物，其中MHCⅡ型分子為DR1、DR2、DR3或DR4型。
11.權(quán)利要求10的復(fù)合物，其中MHCⅡ型分子為DR B1 0101、DR B1 0301、DR B1 0401、DR B1 0402、DR B1 0404或DR B1 1601亞型。
12.權(quán)利要求11的復(fù)合物，其中MHCⅡ型分子為DR B1 0101或DR B1 0401亞型。
13.權(quán)利要求8-12之一的復(fù)合物，其中它含有重組MHC分子或其肽結(jié)合衍生物。
14.權(quán)利要求13的復(fù)合物，其中它包括MHC分子的可溶性肽結(jié)合衍生物。
15.權(quán)利要求8-14之一的復(fù)合物，其中它帶有標(biāo)記基團(tuán)。
16.寡聚的肽-MHC分子復(fù)合物，它含有通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用而連結(jié)的至少2個MHC分子或MHC分子衍生物。
17.權(quán)利要求16的寡聚復(fù)合物，其中它含有通過化學(xué)偶聯(lián)試劑交聯(lián)的肽-MHC分子復(fù)合物。
18.權(quán)利要求16的寡聚復(fù)合物，其中它含有數(shù)個MHC結(jié)合區(qū)并被寡聚肽組分所交聯(lián)的MHC分子或MHC分子衍生物。
19.權(quán)利要求16的寡聚復(fù)合物，其中它含有被抗體交聯(lián)的肽-MHC分子復(fù)合物。
20.權(quán)利要求16-19之一的寡聚復(fù)合物，其中它含有權(quán)利要求9-14之一所定義的MHC分子。
21.權(quán)利要求16-20之一的寡聚復(fù)合物，其中它含有至少一種權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物或權(quán)利要求7的肽模擬物。
22.藥物組合物，其中它含有權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物、權(quán)利要求7的肽模擬物或/和權(quán)利要求8-21之一的復(fù)合物作為活性成分，必要時與一般藥物添加劑結(jié)合。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中它另外包括輔助刺激組分。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中輔助刺激組分選自細(xì)胞因子或/和表面抗原B7。
25.權(quán)利要求22-24之一的藥物組合物用于制備診斷影響免疫系統(tǒng)的疾病或疾病素質(zhì)、或診斷腫瘤疾病或腫瘤疾病素質(zhì)的試劑。
26.權(quán)利要求25的用途，即用于制備診斷自身免疫疾病或自身免疫疾病素質(zhì)的試劑。
27.權(quán)利要求25或26的用途，即用于制備診斷糖尿病或糖尿病素質(zhì)的試劑。
28.測定特異性T細(xì)胞亞群的方法，其中將含T細(xì)胞的樣品與權(quán)利要求1-6的肽或肽衍生物、權(quán)利要求7的肽模擬物或/和權(quán)利要求8-21的復(fù)合物接觸，并測定樣品中的T細(xì)胞與肽或復(fù)合物的反應(yīng)。
29.權(quán)利要求28的方法，其中使用熒光標(biāo)記的肽或復(fù)合物通過FACS分析測定T細(xì)胞的反應(yīng)。
30.權(quán)利要求28或29的方法，其中T細(xì)胞與肽或復(fù)合物接觸前或/和后，對預(yù)活化T細(xì)胞進(jìn)行選擇。
31.權(quán)利要求22-24之一的藥物組合物用于制備治療或預(yù)防影響免疫系統(tǒng)的疾病的試劑。
32.權(quán)利要求31的用途，它是用于制備治療或預(yù)防自身免疫疾病的試劑。
33.權(quán)利要求31或32的用途，它是用于制備治療或預(yù)防糖尿病的試劑。
34.權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物，權(quán)利要求7的肽模擬物或權(quán)利要求8-21之一的復(fù)合物用于制備抗原，特別是免疫原或耐受原。
35.特異性T細(xì)胞亞群的分離方法，其中將含T細(xì)胞的樣品與權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物、與權(quán)利要求7的肽模擬物或與權(quán)利要求8-21之一的復(fù)合物接觸，從而鑒別與肽或復(fù)合物反應(yīng)的T細(xì)胞，必要時將其與其它T細(xì)胞分離。
36.權(quán)利要求35的方法，其中T細(xì)胞與肽或復(fù)合物接觸前或/和后，對預(yù)活化T細(xì)胞進(jìn)行選擇。
37.按權(quán)利要求35的方法分離的T細(xì)胞或其部分結(jié)構(gòu)用于產(chǎn)生抗體。
38.權(quán)利要求37的用途，其中將T細(xì)胞或其部分結(jié)構(gòu)注射到作為T細(xì)胞的原供體的病人中。
39.權(quán)利要求38的用途，其中再注射滅活的T細(xì)胞。
40.權(quán)利要求39的用途，其中再注射的T細(xì)胞是能夠分裂的T細(xì)胞。
41.抗權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物，權(quán)利要求7的肽模擬物或權(quán)利要求8-21之一的復(fù)合物的抗體，其可以通過用此肽、肽衍生物、肽模擬物或復(fù)合物免疫，并分離免疫產(chǎn)生的抗體得到。
42.抗權(quán)利要求41的抗體的抗個體基團(tuán)型抗體，其可用抗肽、肽衍生物或肽模擬物或復(fù)合物的抗體免疫，并分離免疫產(chǎn)生的抗個體基團(tuán)型抗體而得到。
43.與權(quán)利要求1-6之一的肽或肽衍生物、與權(quán)利要求7的肽模擬物或與權(quán)利要求8-15之一或權(quán)利要求21的復(fù)合物反應(yīng)的T細(xì)胞。
44.權(quán)利要求43的T細(xì)胞，它來自T細(xì)胞系6/7(DSM ACC 2172)或具有相當(dāng)?shù)腡細(xì)胞受體結(jié)合特異性。
45.權(quán)利要求43的T細(xì)胞，它來自T細(xì)胞系6/10(DSM ACC 2173)或具有相當(dāng)?shù)腡細(xì)胞受體結(jié)合特異性。
全文摘要
本發(fā)明涉及自身反應(yīng)性肽、肽-MHC復(fù)合物、與其反應(yīng)的T細(xì)胞亞群，以及這些化合物的診斷和治療應(yīng)用。
文檔編號C07K14/00GK1112933SQ9510132
公開日1995年12月6日 申請日期1995年1月19日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月20日
發(fā)明者J·恩德爾, P·斯塔爾, W·阿爾博特, G-G·瓊, D·J·辛德爾, E·曼爾, K·道馬爾 申請人:伯倫格·曼海姆有限公司