專利名稱：從一種蜘蛛毒液分離的多肽的制作方法
本申請(qǐng)是1988年12月23日提交的序號(hào)為289，175的部分繼續(xù)申請(qǐng)。
近年來，科學(xué)家們致力于尋找分離和鑒定來自蜘蛛毒液的新的化學(xué)成份，以便用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)。H.Jackson和P.N.R.Usherwood發(fā)表的“蜘蛛毒素作為剖析顯示興奮的氨基酸轉(zhuǎn)移元素的工具”一文(TINS，11，No6，278-283，1988)綜述了本領(lǐng)域中近年來的發(fā)展。此文報(bào)導(dǎo)蜘蛛Hololenacurta的毒素已被研究，這種活性的蜘蛛毒液的成份作為不可逆谷氨酸拮抗物存在于離析出的5000-10000Da的該毒液級(jí)份中。建議這種毒素“可以代表一類相對(duì)大量的不可逆谷氨酸拮抗物(ID282)。
另外，Bowers等人發(fā)現(xiàn)(ProcNatl.Acad，Sci.，USA84，3506-3510(1987))，從H.Curta毒素離析出的級(jí)份包括Mr為7000及9000的兩個(gè)亞單位，二者以二硫化物鍵聯(lián)接，假想的由每個(gè)推定的亞單位之一組成的該毒素的Mr估計(jì)為16000，它是一種對(duì)于依賴電壓的突觸前的鈣通道潛在和長期的抑制劑。
這種影響的神經(jīng)肌肉介質(zhì)的化合物具有研究興趣并且用于治療許多神經(jīng)病學(xué)的疾病包括癲，缺氧-缺血神經(jīng)元致死，享廷頓午蹈病(Jackson等“蜘蛛毒液對(duì)于AvianCochlearNacleus中被Non-N-甲基-D-天冬氨酸受體傳遞的轉(zhuǎn)移的影響“ExcitatoryAminoAcidTransmission51-54(1987)AlanR.Liss，Inc.)及早老性癡呆以及用作天然殺蟲劑。
本發(fā)明涉及從蜘蛛Hololenacurta的毒液中離析出來的或用合成方法制備的多肽，該多肽由約為4000Da的38個(gè)氨基酸序列組成，主要式子為N-Ter-Ala-Asp-Gys-Val-Gly-Asp-Gly-Gln-X-Cys-Ala-Asp-Trp-Y-Gly-Pro-Tyr-Cys-Cys-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Gys-Arg-Ser-Met-Pro-Tyr-Cys-Arg-Cys-Arg-Ser-Asp-Ser(式Ⅰ)其中X是Arg或Lys;Y是Ala或Phe，并且當(dāng)x是Arg時(shí)Y必須是Ala，當(dāng)X是Lys時(shí)，Y必須是phe，及式為N-Ter-Ser-Cys-Val-Gly-Gln-Tyr-Gly-Arg-Cys-Arg-Ser-Ala-Tyr-Gln-Asp-Cys-Cys-Asp-Gly-Tyr-Tyr-Cys-Asn-Cys-Ser-Gln-Pro-Pro-Tyr-Cys-Leu-Cys-Arg-Asn-Asn-Asn本發(fā)明還涉及它們的鹽，多肽的使用以及用作殺蟲劑的含該多肽的組合物，還涉及需要谷氨酸拮抗物活性及鈣拮抗物活性的其它方面的一些應(yīng)用，例如治療許多神經(jīng)病學(xué)疾病包括如癲，缺氧-缺血神經(jīng)元致死，亨延頓午蹈病等的方法。
本說明書中使用的術(shù)語大部分是眾所周知的并是本領(lǐng)域中通常使用的，現(xiàn)說明如下
Ala丙氨酸Arg精氨酸Asn天冬酰胺ASp天冬氨酸Cys半胱氨酸Gln谷氨酰胺Gly甘氨酸Leu亮氨酸Lys賴氨酸Met蛋氨酸Phe苯丙氨酸Pro脯氨酸Ser絲氨酸Tyr酪氨酸Val纈氨酸N-Ter-N端氨基酸殘基本發(fā)明的范圍包括三個(gè)有關(guān)序列的多肽，每個(gè)都是從蜘蛛Holodena Curta的毒液中分離出來的或者是合成的。式Ⅰ的每個(gè)多肽由38個(gè)氨基酸序列組成，兩個(gè)多肽之間氨基酸序列的差別僅在于位置9(在式Ⅰ中是X)和14(在式Ⅰ中是Y)。其中X是Arg且Y是Ala的化合物的分子量為4188.9Da;其中X是Lys且Y是Phe的化合物的分子量為4237.4Da。這些分子有較高含量的Cys(8)，Ser(5)，Tyr(4)，堿性殘基如Arg/Lys(4)，Asp(4)，分子中沒有組氨酸，蘇氨酸，異亮氨酸和亮氨酸。分子中還有兩個(gè)二肽序列18Cys-19Cys及22Tyr-23Tyr。
式Ⅱ的多肽由36個(gè)氨基酸序列組成，其分子量為4103.0Da。該分子有較高含量的Cys(8)及Tyr(5)，沒有組氨酸，蘇氨酸和異亮氨酸，該分子也有兩個(gè)二肽序列16Cys-17Cys和20Tyr-21Tyr。
本發(fā)明的多肽化合物(以下有時(shí)稱為“多肽”或如下述提出的“Curta毒素1，2及3”)能通過分離并提純選擇性的相對(duì)低分子量的H.Curta毒液的級(jí)份方式實(shí)質(zhì)上以純的形式得到。使用重組體DNA技術(shù)或者用化學(xué)肽合成方法也能完成這種多肽的合成。
從相對(duì)低分子量的H.Curta毒液級(jí)份中式Ⅰ和式Ⅱ的多肽分離和提純通常是用下述方法實(shí)現(xiàn)的。首先將全部H.Curta毒液用反相高壓液相色譜(HPLC)初步分級(jí)，其中級(jí)份33(X是Arg且Y是Ala，稱為Curta毒素1)，級(jí)份37(X是Lys且Y是Phe，稱為Curta毒素2)及級(jí)份27(稱為Curta毒素3)被認(rèn)為是有興趣的。每個(gè)級(jí)份再通過陰離子交換色譜及凝膠過濾進(jìn)一步提純，最后再用反相-HPLC提純，對(duì)每個(gè)級(jí)份得到一個(gè)對(duì)稱單峰，說明是單一的蛋白質(zhì)組份。分離和提純?cè)摶衔锏奶厥夥椒ㄔ趯?shí)施例中給出。
本發(fā)明化合物的肽合成法通常采用以下方法。
本發(fā)明的化合物采用肽合成法中的常規(guī)方法制備。在合成本發(fā)明的某些化合物期間，可能發(fā)生部分外消旋化。雖然如些，但外消旋化的程度不足以較大地改變本發(fā)明化合物的活性。
本發(fā)明的化合物能采用經(jīng)典的溶液合成法合成。
制備方法包括通過羧基官能基和氨基官能基彼此反應(yīng)將氨基酸或肽片斷偶聯(lián)起來得到酰胺鍵。為了有效地達(dá)到偶聯(lián)，首先需要將不直接參加反應(yīng)的所有反應(yīng)性官能團(tuán)用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基鈍化，其次要將需被偶聯(lián)的羧基官能團(tuán)適當(dāng)活化以使偶聯(lián)能進(jìn)行。所有這些包括精心地選擇反應(yīng)順序和反應(yīng)條件以及使用特殊的保護(hù)基，以便能得到所需的肽產(chǎn)品。用來制備本發(fā)明化合物，及有特別選定的保護(hù)基和/或活化官能團(tuán)的每一氨基酸，均可用肽技術(shù)領(lǐng)域中已知的技術(shù)來制備。
本發(fā)明化合物全部合成過程中的每一步都要選擇性地結(jié)合保護(hù)基。這種特殊的結(jié)合被發(fā)現(xiàn)能作用最平穩(wěn)。但是盡管大概成功率較低，在合成本發(fā)明的化合物中也采用其它方式的結(jié)合。因之，例如芐氧羧基，叔-丁氧羰基，叔-戊氧羰基，對(duì)-甲氧芐氧羰基，金剛烷氧羰基，冰片氧羰基在合成本發(fā)明化合物中能被廣泛用作氨基保護(hù)基。而且，芐基(BZ丨)一般用作對(duì)于酪氨酰殘基的羥基保護(hù)基，盡管也可以使用如對(duì)-硝基芐基(PNB)，對(duì)-甲氧基芐基(PMB)等。
制備本發(fā)明化合物所用的羧基保護(hù)基，可以是任何能形成典型的酯的基團(tuán)，例如包括甲基、乙基、芐基、對(duì)硝基芐基、對(duì)甲氧芐基、2，2，2-三氟乙基等。
在制備本發(fā)明化合物時(shí)，使適當(dāng)保護(hù)的N-保護(hù)氨基酸或肽片斷和適當(dāng)保護(hù)了羧基-保護(hù)的氨基酸或肽片斷偶聯(lián)，反映出氨基酸的自由羧基官能團(tuán)或肽片斷活性所組成以形成偶聯(lián)反應(yīng)。這一點(diǎn)可以采用已知技術(shù)中的任何一種來完成。這種活化技術(shù)之一包括將羧基官能轉(zhuǎn)化成混合酸酐，自由羧基官能可通過和其它酸，一般是碳酸衍生物如其酰氯反應(yīng)被活化。形成混合酐，所用的酰氯的例子是氯甲酸乙酯，氯甲酸苯酯，氯甲酸仲丁酯，氯甲酸丁酯，新戊酰氯等，最好用氯甲酸異丁酯。
為完成偶聯(lián)反應(yīng)另一個(gè)活化羧基官能基的方法，是轉(zhuǎn)化為它的活性酯衍生物。這種活性酯包括例如2，4，5-三氯苯酯，五氯苯酯，對(duì)-硝基苯酯等。另一種易得到應(yīng)用的偶聯(lián)方法是已知的疊氮化物偶聯(lián)法。
在制備本發(fā)明的化合物時(shí)較好的偶聯(lián)方法是使用N，N′-二環(huán)已基碳化二亞胺(DCC)來活化自由羧基以使偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行。這種活化和偶聯(lián)技術(shù)使用對(duì)于氨基酸或肽片斷等摩爾量的DCC并在等摩爾量的1-羥基苯并三唑(HOBt)存在下完成。HOBt的存在排除了不需要的付反應(yīng)，包括排除外消旋化的可能性。
在制備本發(fā)明化合物用的合成路線的某個(gè)特定步驟中必須脫掉選擇的保護(hù)基。肽合成領(lǐng)域中具有普通技術(shù)的化學(xué)工作者能很容易地從有代表性的保護(hù)基中選擇出這種保護(hù)基，這樣做的意義是產(chǎn)品選擇性地脫掉保護(hù)基，即允許脫一個(gè)或幾個(gè)保護(hù)基，而不是脫掉存在于氨基酸或肽片斷上的所有保護(hù)基。這種技術(shù)在肽技術(shù)領(lǐng)域中是熟知的。Schroder和Lubke在文獻(xiàn)中(ThePeptidesI，AcademicPress，NewYork1965，特別是其中72-75頁的表格)提供了易獲得的選擇性脫掉保護(hù)基的這方面技術(shù)的更為完整的論述。
用堿性皂化法可以脫掉羧基保護(hù)基，相對(duì)強(qiáng)的堿性條件，一般使用堿金屬氫氧化物如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化鋰等一般使用將保護(hù)的羧基進(jìn)行脫酯。完成皂化的反應(yīng)條件是本技術(shù)領(lǐng)域中熟知的。很多羧基保護(hù)基也可用催化氫解方法來脫掉，例如用載于碳上的鈀作催化劑進(jìn)行氫解。況且，當(dāng)羧基保護(hù)基是對(duì)硝基芐基或2，2，2-三氯乙基情況時(shí)，可以在鋅和鹽酸存在下通過還原反應(yīng)來脫掉保護(hù)基。
用酸處理保護(hù)的氨基酸或肽可以脫掉許多氨基保護(hù)基，形成相應(yīng)的酸加成鹽。所用的酸如甲酸，三氟乙酸(TFA)，對(duì)甲苯磺酸(TSA)，苯磺酸(BSA)，萘磺酸等。另一脫掉氨基保護(hù)基的方法是用HBr和乙酸的混合物處理被保護(hù)的氨基酸或肽，產(chǎn)生相應(yīng)的氫溴酸加成鹽。所使用的特殊的方法或試劑將取決于在特定的脫除保護(hù)反應(yīng)中所用材料的化學(xué)及物理性質(zhì)。所得到的酸加成鹽通過用適當(dāng)?shù)碾x子交換樹脂如DEAESephadexA25，AmberlystA27等處理可轉(zhuǎn)化成藥學(xué)上更易接受的形式。
羥基保護(hù)基在整個(gè)制備過程中可一直保留在肽上，在合成的最后一步期間和脫掉氨基保護(hù)基一起被脫除。但是，根據(jù)脫掉羧基保護(hù)基時(shí)所采用的條件，它也可以在合成步驟中較早地被脫掉。當(dāng)用堿性皂化的方法脫掉羧基保護(hù)基時(shí)，羥基保護(hù)基被保留著，但當(dāng)用催化氫解脫掉羧基保護(hù)基時(shí)，羥基保護(hù)基也就一起被脫掉了。后面一種情況將不會(huì)有嚴(yán)重問題，因?yàn)榭梢栽谖幢Ｗo(hù)的酪氨酰殘基存在下完成制備本發(fā)明的化合物。
當(dāng)然，另一些步驟也是適用的。其一是將單獨(dú)制備的N-端基三肽和單獨(dú)制備的C-端基苯丙氨酸衍生物進(jìn)行偶聯(lián)，隨后再適當(dāng)脫去任何殘留的保護(hù)基部分。所用的另一溶液方法是分步，連續(xù)加入單氨基酸以便形成從帶有C-端基部分開始的肽鏈。如上述的反應(yīng)技術(shù)也被用于此處及任何其它經(jīng)過仔細(xì)考慮的制備步驟中。
此外，本發(fā)明的化合物也可用重組DNA合成技術(shù)來制備。
一般而言，本發(fā)明化合物的完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)用下述方法測(cè)定。Curta毒素Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ按照Firedman等人提出的(J.Biol，CHem，245，3868(1970))D、Hawke及P.Yaum改進(jìn)的(AppliedBiosystemsIncorporatedUserBulletin，No28(1987))方法進(jìn)行吡啶乙基化。吡啶乙基化的毒素(PESTS)用微孔反相HPLC脫鹽，洗脫約40分鐘后進(jìn)入梯度程序，再進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)Edman降解。用和氣相序列發(fā)生器直接聯(lián)機(jī)PHT分析儀上，在每次循環(huán)中對(duì)苯基硫代海因衍生的氨基酸進(jìn)行分析。在自動(dòng)樣品管中通過氣相水解將肽進(jìn)行水解，然后轉(zhuǎn)入到氨基定量分析儀中以便測(cè)定伯氨基酸和仲氨基酸。首先將幾毫微摩爾的天然毒素進(jìn)行分析，并且每個(gè)都給出高產(chǎn)量的PTH氨基酸，對(duì)第一個(gè)35-37殘基獲得了清楚的測(cè)定。半胱氨酸通過PEST蛋白質(zhì)的序列分析來測(cè)定。為了證明羧端基序列，每個(gè)肽的PEST形式均用CNBr降解，以便在位置29脫掉蛋氨酸。羧端基片斷用微孔C-18反相HPLC提純并進(jìn)行序列分析。水解肽的氨基酸組份和從該片斷的氨基酸序列計(jì)算出的組份一致，證實(shí)了羧端基絲氨酸殘基。該結(jié)構(gòu)還從FAB-MS分析中得到證實(shí)。Curta毒素Ⅰ和Ⅱ相應(yīng)的離子分子量MH+分別為4188.7Da、4237.4Da，而計(jì)算值分別是4189.6Da和4237.7Da。Curta毒素Ⅲ的分子量為4103.0Da，這和從羧酰胺化多肽的氨基酸序列的分子量計(jì)算出來的數(shù)值一致。測(cè)定本發(fā)明化合物一級(jí)結(jié)構(gòu)的個(gè)別方法在下述實(shí)施例中說明。
下述實(shí)施例用以說明了解和鑒定本發(fā)明化合物的方法，但它們不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。
實(shí)施例1純化Curta毒素Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ的原始記錄將HololenaCurta毒液冷凍儲(chǔ)藏，不經(jīng)最初的凍干步驟即進(jìn)行色譜提純，即直接把毒液注入到HPLC柱中。
用監(jiān)測(cè)器Curta毒液純度的生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)是觀察蟋蟀Aohetadomestica的麻痹情況，接著進(jìn)行色譜提純后，柱級(jí)份用SavantSpeed-Vac凍干過夜，殘留物溶于最低量的蒸餾水/去離子水中(通常100-200μl)將其2μl注入到蟋蟀的胸腔中，隨后將其裝在塑料的陪替氏培養(yǎng)皿中。含麻痹物質(zhì)的級(jí)份通常在5-10分鐘內(nèi)產(chǎn)生麻痹作用，完全麻痹需2-3小時(shí)。蟋蟀至少要被監(jiān)測(cè)24小時(shí)(通常48小時(shí))觀其復(fù)復(fù)蘇。
提純步驟1PharmaciaRepRPCHR16/10柱用含0.05%IFA(三氟乙酸)的HPLC-級(jí)別的水平衡過夜。全部毒液(0.5ml)通過注射環(huán)以2.5ml/min的流速被注入到柱子中。以上述流速用40ml平衡溶劑洗滌柱子。通過線性梯度洗脫將毒液組份選擇性地洗至60%的乙腈止。(含0.05%TFA)，流速為2.5ml/min，需用約100分鐘。用級(jí)份收集器收集5ml(2分鐘)級(jí)份，將其凍干并進(jìn)行上述生物測(cè)定，對(duì)于級(jí)份27，33和37基本上會(huì)見到迅速的立即的麻痹作用。將這些級(jí)份接著參與下一步的提純。
假如不進(jìn)行同樣的分離的話，基本上任何制備反相(C18)HPLC柱都給出類似的結(jié)果。Pharmacia柱子用15μl孔度硅石C2/18填充。在此第一步中所用的梯度洗脫是較慢的，但它能使毒液組份得到極好的離析。
第2步，Curta毒素Ⅰ(級(jí)份33)將Bio-Rad MicroAnalyzer MA7P+陰離子交換HPLC柱(4.6×30mm)以0.5ml/min的流速用20mM(Tris)(PH7.5)平衡。在這種isocratic條件下，從級(jí)份33得到的起麻痹作用的毒素將不粘在柱子上而以空體積洗脫。當(dāng)監(jiān)測(cè)吸收度為220nm時(shí)，用手操收集級(jí)份。不活潑的組份通過原始記錄此時(shí)稍稍滯后或粘于柱子上而獲得較好的提純。
MicroAnalyzer是稍不同于其它陰離子交換器的，它由球形的，薄膜的(非孔的)聚合物組成。(在大多數(shù)HPLC柱中，樣品和柱之間的相互作用出現(xiàn)在填充材料的孔中間)。因之MicroAnalyzer有相對(duì)低的容量，這又意味著可使用收率高并且較高的流速。雖然對(duì)此種柱所推薦的流速是1.5ml/min但較慢的流速能得到極好的結(jié)果。
步驟3Curta毒素Ⅰ將從上一步得到的活化物質(zhì)施加到Bio-Rad Biosil TSK 250凝膠滲透柱(300×7.5mm)中，該柱預(yù)先以1.0ml/min的流速用50mM Na2SO4/20mM Na2HPO4(PH6.8)平衡。在這種isocartic條件下麻痹活性物在約12ml洗脫體積(Ve)時(shí)被洗脫，幾種次要的污染物用此方法除去。
步驟4Curta毒素Ⅰ提純Curta毒素Ⅰ的最后一步，是如步驟1相同柱子所進(jìn)行的另外反相步驟。而且柱子以2.5ml/min的流速用15%乙腈的水溶液/0.05%TFA平衡。接著加入毒素，柱子用12.5ml平衡溶劑以上述流速洗滌。Curta毒素Ⅰ的洗脫以2.5ml/min的流速，85分鐘后梯度至35%的乙腈時(shí)完成。洗脫位置接近26%乙腈。
將提純過的毒素凍干并冷凍儲(chǔ)藏，再進(jìn)行下一步的序列分析。
步驟5Curta毒素Ⅱ(從第一步得到的級(jí)份37)-將級(jí)份37加到凝膠滲透柱中，如步驟3所述，但流動(dòng)速度變?yōu)?.5ml/min，毒性組份在洗脫體積約16ml(Ve)處被洗脫。
步驟6Curta毒素Ⅱ?qū)纳弦徊降玫降幕钚晕镞M(jìn)行色譜提純，方法和步驟4完全一樣，活性物質(zhì)在相當(dāng)于約31%乙腈的位置被洗脫。
步驟7Curta毒素Ⅲ(從步驟9得到的級(jí)份27)-Curta毒素Ⅲ的提純是將級(jí)份27再進(jìn)行一次色譜提純(用100μl含0.1%TFA的水重新平衡)，采用AquaporeRP-300微孔反相柱(2.1×30mm)，并使用AppliedBiosystemInc.的Madel130蛋白質(zhì)-肽分離系統(tǒng)。梯度洗脫是從100%緩沖液A(含0.1%TFA的水)線性至100%緩沖液B(含0.85%TFA和70%乙腈的水)，流速為100μl/min。洗脫時(shí)間約150分鐘，毒素被還原并用4-乙烯基吡啶進(jìn)行吡啶乙基化以后，再用微孔反相HPLC提純。
實(shí)施例2一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定Curta毒素的吡啶乙基化及溴化氰降解。在進(jìn)行序列分析前，按照Friedman等人提出的(1970)后來被Hawke和Yuam(1987)用少量蛋白質(zhì)而改進(jìn)的方法將已經(jīng)提純過的Curta毒素進(jìn)行吡啶乙基化。簡言之，將10μg每種Curta毒素溶于44μl6M的胍-HCl，0.25MTris-HCl(PH8.5)中，隨后使其和3μl10%β-巰基乙醇及3μl4-乙烯基吡啶于室溫反應(yīng)2小時(shí)。吡啶乙基化的毒素然后用微孔反相HPLC脫鹽，使用AquaporeRP-300柱(2.1×30mM)在AppliedBiosystemsInc的model130蛋白質(zhì)-肽分離系統(tǒng)上。梯度是線性的，范圍從100%緩沖液A(含0.1%三氟乙酸的水)到100%緩沖液B(含0.085%三氟乙酸和70%乙腈的水)，洗脫時(shí)間為150分鐘，流速為100μl/min。被吡啶乙基化的蜘蛛毒素(PESTS)洗脫在接近40分鐘中進(jìn)入梯度程序，比未經(jīng)改性的蛋白質(zhì)早5-10分鐘。
為了獲得羧基端片斷，將10μg的每種PESTⅠ和Ⅱ溶于330μl70%的甲酸中，往樣品中加一些CNBr的晶體，然后用氮?dú)鉀_洗，封閉并于室溫于暗處放置24小時(shí)，將樣品在Speedvac離心機(jī)(Savant)上干燥。再重新溶解于50μ10.1%TFA/H2O中，并用微機(jī)反相HPLC再提純。梯度是線性的，范圍從100%緩沖液A(含0.1%TFA的水)到100%緩沖液B(含0.085%TFA和70%乙腈的水)，時(shí)間為150分鐘。18μg的毒素通過胰蛋白酶消化作用產(chǎn)生PEST111的羧端基片斷，酶和底物重量比為1∶50，消化作用在1%碳酸氫銨(PH9.0)中于室溫進(jìn)行20小時(shí)。肽用如上述微孔反相HPLC提純。
自動(dòng)Edman降解在model470A蛋白質(zhì)-肽序列分析儀(ApplliedBiosystemsInc.)上進(jìn)行，試劑，操作規(guī)程及標(biāo)準(zhǔn)程序均是制造商提供的。苯基硫代海因衍生的氨基酸用Model120PTH-分析儀(AppliedBioSystems，Inc)在每次循環(huán)時(shí)進(jìn)行分析，上述儀器直接和470A相序列分析儀相連。
氨基酸分析、氨基酸分析鑒定用專用的熱噴啉液體色譜-質(zhì)譜(LC-MS)系統(tǒng)進(jìn)行，該系統(tǒng)由安裝在Vestec101熱噴啉界面上的HewlettPackard5790質(zhì)譜選擇檢定器組成，熱噴淋界面由熱噴淋離子源和相聯(lián)的真空體系組成。在LC-MS分析前，使酸性的水解物和異硫氰酸苯酯(PITC)反應(yīng)形成苯基硫代氨基甲酰(PCT)氨基酸。定量結(jié)果在HewlettPackard氨基定量分析儀上得到，它使用雙重衍生物化學(xué)，鄰苯二醛和9-氟烯炔甲基氯代甲酸酯，以分別測(cè)定伯，仲氨基酸。
氨基酸序列分析-自動(dòng)Edman降解在Model470A蛋白質(zhì)-肽序列分析儀上進(jìn)行(AppliedBiosystems，Inc.)，試劑，操作規(guī)程及標(biāo)準(zhǔn)程序均是由制造商提供的。苯基硫代海因衍生的氨基酸在每一循環(huán)中用和470A氣相序列儀直接相連的model120PTH分析儀上進(jìn)行分析(AppliedBiosystems，Inc.)。
FAB質(zhì)譜分析分子量測(cè)定使用ZAB2-SE雙焦距質(zhì)譜儀(VGAnalytical，Ltd)。完整的Curta毒素的FAB分析使用1μg適當(dāng)?shù)亩舅卦谟啥蛱K糖醇，二硫赤蘚糖醇和硫甘油(重量比5∶1∶6)組成的基質(zhì)中和1%TFA進(jìn)行。離子化作用使用在恒定磁場(chǎng)強(qiáng)度下加速電壓的線性掃描來獲得。被選擇的間隔包括2C5I參照離子，它們的質(zhì)量值(4030.0541和4289.8640)把Curta毒素的分子量范圍進(jìn)行分類。使用數(shù)據(jù)系統(tǒng)的MCA模型在質(zhì)量解析1000處得到數(shù)據(jù)，這種模型收集了連續(xù)數(shù)據(jù)的相鄰的掃描并把它們匯積成相同的數(shù)據(jù)圖。用這種圖，肽的3個(gè)掃描同作為參照的CSI的3個(gè)連續(xù)的掃描一起被積分，然后毒素質(zhì)量通過線性內(nèi)插法被測(cè)定。
對(duì)于含肽片斷羧端基所獲得的質(zhì)譜，可使用普通的磁流掃描被得到，使用質(zhì)量解析2000以保證肽的個(gè)別同位素被解析。分析之前，使用CsI作參照獲得質(zhì)量校準(zhǔn)，其后的分析使用17KeV銫離子束在由1∶1甘油/硫代甘油(W/W)與1%TFA組成的基質(zhì)中進(jìn)行。
本發(fā)明的化合物用作殺蟲劑，一般而言，該多肽的用量至少為每克體重量3微克重以產(chǎn)生某些殺蟲效力。用量至少大約為每克體重9微克較好。本發(fā)明化合物的殺蟲性能用標(biāo)準(zhǔn)的及已知的方法很容易地被測(cè)定，下述方法說明多肽的殺蟲活性。
Achetadomestica屬/種的蟋蟀或者用全部蜘蛛毒液注射或者用提純的蜘蛛毒液級(jí)份來注射，而對(duì)照用蟋蟀僅用蒸餾水注射，而將HololenaCurta毒液(50mg/ml用Bradford/coomassiaBlue試驗(yàn)測(cè)定)和去離子水混合，將其0.5μl(25μg蛋白質(zhì))注射到蟋蟀的胸腔內(nèi)，引起即刻的及不可逆的麻痹。約880μgCurta毒素Ⅱ(級(jí)份37)被溶于150μl去離子水中，5.86μg/μl的稀釋液被用于5個(gè)蟋蟀的一個(gè)實(shí)驗(yàn)組(平均重量＝0.384克)，帶有2.93μg多肽被注射到每個(gè)蟋蟀體內(nèi)。觀察到無恢復(fù)平穩(wěn)反應(yīng)及麻痹作用，注射后48小時(shí)全部5個(gè)蟋蟀均死亡，而對(duì)照的5個(gè)蟋蟀仍活著。準(zhǔn)備好1.95μg/μl的另一種溶液，0.98μg的多肽同樣被注射到5個(gè)蟋蟀體內(nèi)(平均重0.314克)，48小時(shí)后5個(gè)中的2個(gè)死亡，而5個(gè)對(duì)照用的蟋蟀均正常，進(jìn)一步將溶液稀釋進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但未發(fā)現(xiàn)致死現(xiàn)象。
以上結(jié)果說明本發(fā)明的化合物具有強(qiáng)有力的殺蟲活性。
本發(fā)明的化合物還能用作谷氨酸受體及鈣通道拮抗物，在治療神經(jīng)病學(xué)疾病方面是有效的，這些疾病包括驚厥，早老性癡呆和享廷頓午蹈病，大腦局部缺血，隨后發(fā)作等。
本發(fā)明化合物的拮抗作用性質(zhì)能很容易地用標(biāo)準(zhǔn)和已知方法來測(cè)定，這種方法是L.VyKlicky等人(NeuroscienceLetlers68227-2311986)及C.W.Bowers等人(Proc、Natl、AcadSci，USA843506-35101987)提出的。
一般來說，本發(fā)明化合物可用于哺乳動(dòng)物例如需治療的病人，其用量為能有效地產(chǎn)生谷氨酸受體或鈣通道拮抗物反應(yīng)。因之能治療上述的各種疾病。
本發(fā)明的多肽化合物可以以游離酸形式或者鹽形式被使用?！八帉W(xué)上可接受的鹽”一詞是指式Ⅰ化合物的任何有機(jī)或無機(jī)加成鹽，它們?cè)诤陀行Щ钚韵嘁恢碌臐舛壬蠈?duì)病人是相對(duì)無毒無害的，即這種鹽所引起的付作用不會(huì)損害式Ⅰ多肽的有效性。這些鹽也屬于本發(fā)明的范圍。這種鹽包括銨鹽，堿金屬鹽如鈉鹽及鉀鹽，堿土金屬鹽如鈣鹽及鎂鹽，和有機(jī)堿如二環(huán)己基胺，N-甲基-D-葡糖胺形成的鹽，以及和氨基酸如精氨酸及賴氨酸形成的鹽等。還可制備和有機(jī)及無機(jī)酸形成的鹽，如和下列酸形成的鹽鹽酸，氫溴酸，磺酸，硫酸，磷酸，硝酸，抗壞血酸，甲磺酸，乙酸，丙酸，酒石酸，檸檬酸，乳酸，蘋果酸，扁桃酸，肉桂酸，棕櫚酸，衣康酸，富馬酸，苯磺酸和甲苯磺酸。盡管也可使用其它鹽，但非毒性的生理上可接受的鹽是優(yōu)先選用的例如分離或純化過的產(chǎn)物。
用普通的方法即能制備這種鹽，例如將該產(chǎn)品的游離酸形式和一個(gè)或一個(gè)以上當(dāng)量適當(dāng)?shù)膲A在其鹽不能溶解在其中的溶劑或介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)?；蛘呤褂萌缢@樣的溶劑，隨后它能真空除掉或用凍干，或者用在適當(dāng)?shù)碾x子交換樹脂上，將存在的鹽可交換的陽離子交換成另一種陽離子。
為治療神經(jīng)病學(xué)疾病的患者是哺乳動(dòng)物，包括需治療特殊病癥，損傷或疾病的病人。對(duì)于患有神經(jīng)病學(xué)疾病的病人所給用的有效成分(即式Ⅰ和Ⅱ的多肽)的數(shù)量能在很寬的范圍內(nèi)改變，這要根據(jù)所用的特定劑量單位，治療周期，被治療的病人的年令和性別，被治療病人發(fā)病程度所用的多肽，是否使用了其它藥物等來考慮。
本發(fā)明的多肽能以適當(dāng)配方的藥物組合形式被使用，以便當(dāng)對(duì)需要治療的病人給藥后能達(dá)到所希望的醫(yī)理學(xué)效果。因之，本發(fā)明包括含有藥學(xué)上，可接受的載體和藥學(xué)上有效量的式Ⅰ化合物的藥學(xué)組合物。藥學(xué)上可接受的載體是對(duì)病人來說相對(duì)無毒和無害的，并在和有效成份的有效活性相匹配的濃度中的任何載體，以致由載體引起的任何付作用都不會(huì)損害有效成份有效性?；衔锏乃幬镉行Я渴侵钙鋽?shù)量能對(duì)被治療的特殊病癥產(chǎn)生結(jié)果或給出影響。式Ⅰ和式Ⅱ的化合物能和藥學(xué)上可接受的載體一起，使用普通的劑量單位形式通過口服或非腸道給藥來使用。
醫(yī)生能確定最合適的本發(fā)明化合物特定劑量。所選擇的劑量將根據(jù)上述因素而變化，但一般范圍是約0.01-10mg/kg。
本發(fā)明也包括含該多肽及惰性載體的組合物。這種組合物可用于診斷或用作分析參照物或標(biāo)準(zhǔn)物以及用于殺蟲劑。因之本發(fā)明包括含有惰性載性及本發(fā)明多肽或其鹽的組合物。惰性載體是和被載的化合物不相互反應(yīng)的任何材料，并且是起支撐作用的，方便運(yùn)輸?shù)?，松散的可獲得的材料，還要能和被載的化合物匹配。有效量的化合物是指，其數(shù)量對(duì)上述使用來說以所需的方式被使用，并能對(duì)所采用的特定方法產(chǎn)生效果或給出影響。
很明顯，對(duì)本域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下如本說明書所提出的?？蓪?duì)本發(fā)明作出改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種從蜘蛛HololenaCurta的全部毒液中分離出級(jí)份27的方法，該方法包括以2.5ml/min的流速將0.5ml全部毒液加到PharmicaPepRPCHR16/10HPLC柱子中，以2.5ml/min的流速在100分鐘后進(jìn)行線性梯度洗脫至含0.05%TFA的60%的乙腈止，收集2分鐘的級(jí)份5ml，從該柱子上洗脫，選擇分離第27個(gè)級(jí)份。
2.按照權(quán)利要求1的方法分離下式的多肽N-Ter-Ser-Cys-Val-Gly-Gln-Tyr-Gly-Arg-Cys-Arg-Ser-Ala-Tyr-Gln-Asp-Cys-Cys-Asp-Gly-Tyr-Tyr-Cys-Asn-Cys-Ser-Gln-Pro-Pro-Tyr-Cys-Leu-Cys-Arg-Asn-Asn-Asn(Curta毒素Ⅲ)及其鹽。
3.一種從蜘蛛HololenaCurta的全部毒液中分離級(jí)份33的方法，該方法包括以2.5ml/min流速將0.5ml全部毒液加到PharmicaPep/RPCHR16/10HPLC柱子上，以2.5ml/min流速在100分鐘后進(jìn)行線性梯度洗脫，至含0.05%TFA的60%乙腈止，收集2分鐘的級(jí)份5ml，從柱子上洗脫選擇分離出第33組份。
4.按照權(quán)利要求3的方法分離下式的多肽N-Ter-Ala-Asp-Cys-Val-Gly-Asp-Gly-Gln-Arg-Cys-Ala-Asp-Trp-Ala-Gly-Pro-Tyr-Cys-Cys-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Cys-Arg-Ser-Met-Pro-Tyr-Cys-Arg-Cys-Arg-Ser-Asp-Ser(Curta毒素Ⅰ)
5.一種從蜘蛛HoloenaCurta的全部毒液中分離級(jí)份37的方法，該方法包括以2.5ml/min的流速將0.5ml的全部毒液加到PharmicaPepRPCHR16/10HPLC柱子上，以2.5ml/min的流速在100分鐘后進(jìn)行線性梯度洗脫至含0.05%TFA的60%乙腈止，收集2分鐘的級(jí)份5ml，從該柱上洗脫選擇分離出第37級(jí)份。
6.按照權(quán)利要求5的方法分離下式的多肽N-Ter-Ala-Asp-Cys-Val-Gly-Asp-Gly-Gln-Lys-Cys-Ala-Asp-Trp-Phe-Gly-Pro-Tyr-Cys-Cys-Ser-Gly-Tyr-Tyr-Cys-Ser-Cys-Arg-Ser-Met-Pro-Tyr-Cys-Arg-Cys-Arg-Ser-Asp-Ser-(Curta毒素Ⅱ)
全文摘要
本發(fā)明涉及新穎的，相對(duì)分子量低的，由蜘蛛HololenaCur ta毒素分離并提純出來的或合成制備出的，由36-38個(gè)氨基酸的多肽。它一般用作殺蟲劑或治療與藥理學(xué)疾病有關(guān)的谷氨酸拮抗物或鈣拮抗物。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1044101SQ8910983
公開日1990年7月25日 申請(qǐng)日期1989年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1988年12月23日
發(fā)明者安德魯·G·斯特普爾頓 申請(qǐng)人:默里爾多藥物公司