一種制備河豚毒素的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種制備河豚毒素的方法，具體包括如下步驟：浸泡；沉降；絮凝；離子交換；低壓柱層析；高效液相色譜柱；結(jié)晶。本發(fā)明采用的上述各步驟前后緊密相連、層層相扣，能較好的將河豚毒素與4-表河豚毒素分離開(kāi)來(lái)，且使河豚毒素的收率大大提高，制備出來(lái)的河豚毒素的純度高達(dá)99％以上。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種制備河豚毒素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥制劑領(lǐng)域，特別涉及一種制備河豚毒素的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 河豚毒素（tetrodotoxin)是一種氨基全氫喹唑啉型化合物，具有籠型原酸酯結(jié)

【權(quán)利要求】
1. 一種制備河豚毒素的方法，其特征在于，具體包括如下步驟： 步驟一：浸泡 將河豚魚(yú)肝或魚(yú)子切成條或塊后，用去離子水或純化水浸泡，得到料液，浸泡至料液不 再含毒為止； 步驟二：沉降 將步驟一所得的料液置于6?10°C沉降放置10?12小時(shí)，分出上清液，并將沉淀物離 心并過(guò)濾除渣后再與上清液混合得到澄清液； 步驟三：絮凝 將步驟二所得的澄清液用氨水溶液調(diào)PH至7?9,加入絮凝劑溶液調(diào)節(jié)PH至4?6,攪 勻，靜置沉降，然后分出上清液，并將沉淀物經(jīng)過(guò)高速離心并過(guò)濾除渣后再與上清液混合； 步驟四：離子交換 將步驟三混合所得的料液，上離子交換柱，交換至PH6. 5?7. 0,交換結(jié)束后用去離子 水或純化水沖柱至澄清，然后以醋酸溶液洗脫，收集含目標(biāo)產(chǎn)物的組分，以氨水溶液調(diào)PH 至5?7,減壓濃縮得到濃縮液。 步驟五：低壓柱層析 將步驟四所得的濃縮液和干硅膠拌好，上低壓硅膠柱進(jìn)行分離，并加入組成為正丁醇、 醋酸和水的洗脫液進(jìn)行洗脫，收集含目標(biāo)產(chǎn)物的流出液部分，過(guò)濾得到濾液，減壓濃縮得到 濃縮液。 步驟六：高效液相色譜柱 將步驟五所得濃縮液注入平衡后的高效液相色譜柱，以醋酸溶液洗脫，收集含目標(biāo)產(chǎn) 物的流出液減壓濃縮，得到濃縮液。 步驟七：結(jié)晶 將步驟六所得的濃縮液用氨水溶液調(diào)PH至8?9,冷藏，析出結(jié)晶，濾出，用無(wú)水乙醇洗 滌，常溫減壓干燥即得河豚毒素高純單體結(jié)晶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于， 所述步驟一中，所述河豚魚(yú)肝或魚(yú)子是切成1?2cm的條或塊，置不銹鋼浸泡槽中加 1?2倍的去離子水或純化水在6?10°C浸泡，并適時(shí)攪拌，18?24小時(shí)后將料液從不銹 鋼浸泡槽的下口放出至儲(chǔ)料槽或沉降罐中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于， 所述步驟三中，是將步驟二所得的澄清液用25 %的氨水溶液調(diào)PH至7?9，加絮凝劑 溶液至PH4?6,以50?300rpm/min的速度攪拌5?lOmin，在溫度為6?10°C下靜置沉 降18?24小時(shí)，分出上清液后，將沉淀物經(jīng)過(guò)高速離心機(jī)，在轉(zhuǎn)速為5000?10000rpm/min 下離心20?40分鐘，并過(guò)濾除渣后再與上清液混合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于， 所述絮凝劑為聚合硫酸鐵、聚合硫酸鋁、聚丙烯酰胺或聚合氯化鋁，投放量為〇. 01? 5g/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于， 所述步驟四中，是將步驟三混合所得的料液，上經(jīng)氨化并用水沖至PH8?9的離子交換 柱，交換至PH6. 5?7. 0,其中料液和離子交換樹(shù)脂之間的量比為40?60ml/g，交換結(jié)束后 用去離子水或純化水沖柱至澄清，然后以5?10%的醋酸溶液洗脫，醋酸溶液與上的料液 的體積比為1 :90?180,收集含目標(biāo)產(chǎn)物的組分，以氨水調(diào)PH至5?7,在0.9?1.0大氣 壓下濃縮90?100倍，得到濃縮液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于， 所述步驟四中的離子交換柱所用的離子交換樹(shù)脂為D152弱酸型大孔丙烯酸陽(yáng)離子交 換樹(shù)脂。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于， 所述步驟五中，是將步驟四所得的濃縮液，和干硅膠拌好，兩者的量的比例為0.8? lml/g，上低壓硅膠柱進(jìn)行分離，壓力為0. 7?0. 9個(gè)大氣壓，加入組成為正丁醇、醋酸和水 的洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫液與上的料液的體積比為50:1，其中正丁醇、醋酸和水的體積比分 別為5 :3 :1，收集含目標(biāo)產(chǎn)物的流出液部分，用0. 45um微孔濾膜過(guò)濾，得到濾液在0. 9?
1. 〇個(gè)大氣壓下90?100倍濃縮，得到濃縮液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于， 所述步驟六中，是將步驟五所得濃縮液注入平衡后的高效液相色譜柱，高效液相色譜 柱為C18柱，上樣量為0. 2?0. 4ml，以體積百分比為0. 4?0. 6%的醋酸溶液洗脫，洗脫液 與上的料液的體積比為80?150:1，用示差折光監(jiān)測(cè)器監(jiān)測(cè)，收集含目標(biāo)產(chǎn)物的流出液在 0. 9?1. 0個(gè)大氣壓下90?100倍濃縮，得到濃縮液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備河豚毒素的方法，其特征在于， 所述步驟七中，是將步驟六所得的濃縮液用體積分?jǐn)?shù)為8?10%的氨水調(diào)PH至8?9， 冷藏，析出結(jié)晶，濾出，用無(wú)水乙醇洗滌，在-1. 1?_〇. 9個(gè)大氣壓下，常溫干燥24?48小 時(shí)即得河豚毒素高純單體結(jié)晶。
【文檔編號(hào)】C07D491/22GK104370929SQ201410573138
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月19日
【發(fā)明者】鐘馨稼, 劉延?xùn)| 申請(qǐng)人:鐘馨稼, 劉延?xùn)|