一種多肽alkg及其在治療白血病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多肽ALKG，其氨基酸序列為Lys-Phe-Val-Cys-Gly-Val-Ser-Leu-Cys-Leu-Leu-Gly，分子量為1238.57。本發(fā)明還公開了該多肽ALKG在制備白血病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了該多肽ALKG在治療白血病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明多肽ALKG與現(xiàn)有抗腫瘤多肽無同源性，該肽作用于白血病細(xì)胞系，能夠抑制白血病腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，為廣譜、高效、低副作用的靶向性白血病治療策略提供新的藥物候選和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【專利說明】-種多肽ALKG及其在治療白血病藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)中的多肽藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種多肽ALKG及其在治 療白血病藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 白血病是一組具有高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，屬于造血干細(xì)胞克隆性疾 病，白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力，停滯在細(xì)胞發(fā)育過程中不同階段，大量聚集在 骨髓和其他造血組織中，并浸潤其他組織器官，導(dǎo)致正常造血功能受到抑制，危及正常器官 的功能。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國白血病好發(fā)于青少年階段，其發(fā)病率排在青少年腫瘤的第一位。白血 病的治療近年來取得了許多新的進(jìn)展，但仍然有許多不足之處。不斷涌現(xiàn)的新的化療藥物、 多藥聯(lián)合化療及造血干細(xì)胞移植的的應(yīng)用使急性白血病的預(yù)后獲得了很大改善，但難治性 和復(fù)發(fā)性病例以及患者的耐藥性仍缺乏有效的應(yīng)對策略。近年來，針對白血病細(xì)胞生存、增 殖等復(fù)雜過程中某些環(huán)節(jié)的靶向治療成為治療研究中的一個(gè)重要領(lǐng)域，通過小分子靶向藥 物與化療藥物或其他信號途徑抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，提高患者的CR率和長期生存率成為目前 白血病治療的一個(gè)重要方向。
[0003] 白血病的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的增殖、周期、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中生物大分子間相 互作用的異常密切相關(guān)。白血病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因表達(dá)產(chǎn)物及調(diào)控因子間的相互作用 決定著細(xì)胞的命運(yùn)。多肽類分子由于其靶向性與特異性高、免疫原性低、易于結(jié)構(gòu)的修飾改 造等諸多優(yōu)點(diǎn)，尋找與白血病相關(guān)靶點(diǎn)特異性作用的多肽，為白血病的診斷與治療提供高 親和性和特異性的多肽分子，已成為白血病治療藥物研究的新熱點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種多肽ALKG，并提供其制備方法和在治療白血病藥物中的 應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，多肽ALKG，其氨基酸序列為：Lys-Phe-Val-Cys-Gly -Val-Ser-Leu-Cys-Leu-Leu-Gly，分子量為 1238. 57。
[0006] 多肽ALKG在制備白血病藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明多肽ALKG與現(xiàn)有抗腫瘤多肽無同源性，該肽作用于 白血病細(xì)胞系，能夠抑制白血病腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，為白血病的靶向性治 療策略提供新的藥物候選和物質(zhì)基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1是本發(fā)明多肽ALKG的ESI-MS鑒定圖，檢測到的正離子峰[M+H] + = 1238. 80(MW = 1238.57)；
[0009] 圖2是本發(fā)明多肽ALKG的RP-HPLC分析圖，其保留時(shí)間tK = 8. 803 min，純度為 95. 47% ；
[0010] 圖3是本發(fā)明多肽ALKG抑瘤活性MTT實(shí)驗(yàn)HL60與U937細(xì)胞時(shí)間依賴的生長曲 線圖；其中，圖3-1為HL60細(xì)胞時(shí)間依賴的生長曲線，圖3-2為U937細(xì)胞時(shí)間依賴的生長 曲線，圖3-3為正常PBMC細(xì)胞時(shí)間依賴的生長曲線。橫坐標(biāo)代表處理時(shí)間，縱坐標(biāo)代表處 理后細(xì)胞存活率。
[0011] 圖4是本發(fā)明多肽ALKG誘導(dǎo)白血病細(xì)胞系HL60與U937凋亡的流式細(xì)胞儀分析 圖；圖4-1、圖4-3和圖4-5分別為HL60細(xì)胞中加入本發(fā)明多肽ALKG后24h、36h和48h的 凋亡誘導(dǎo)圖，圖4-7、圖4-9和圖4-11分別為U937細(xì)胞中加入本發(fā)明多肽ALKG后24h、36h 和48h的凋亡誘導(dǎo)圖，圖4-2、圖4-4和圖4-6圖分別為對應(yīng)圖4-1、圖4-3和圖4-5的空白 對照組，圖4-8、圖4-10和圖4-12圖分別為對應(yīng)圖4-7、圖4-9和圖4-11的空白對照組。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 本發(fā)明多肽ALKG，氨基酸序列為：
[0013] Lys-Phe-Val-Cys-Gly-Val-Ser-Leu-Cys-Leu-Leu-Gly (賴氨酸-苯丙氨酸-繳 氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-纈氨酸-絲氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-亮氨酸-亮氨酸-甘氨 酸），分子式為C 56H95N13O14S2，分子量為1238. 57。本發(fā)明多肽ALKG作用于白血病細(xì)胞系，能 夠抑制白血病腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
[0014] 說明書和權(quán)利要求書中所使用的縮寫的含義如下：
[0015] Lys 賴氨酸
[0016] Phe 苯丙氨酸
[0017] Val 纈氨酸
[0018] Cys 半胱氨酸
[0019] Gly 甘氨酸
[0020] Ser 絲氨酸
[0021] Leu 亮氨酸
[0022] Fmoc 9_莉甲氧撰基
[0023] MBHA 甲苯氫胺樹脂
[0024] DCM 二氯甲烷
[0025] THF 四氫呋喃
[0026] DMF N，N-二甲基甲酰胺
[0027] DIC N，N-二異丙基碳二亞胺
[0028] HOBt 1-羥基苯并三唑
[0029] DMAP 4-二甲氨基吡啶
[0030] MeOH 甲醇
[0031] PIP 哌啶
[0032] TIS 三異丙基硅烷
[0033] TFA 三氟乙酸
[0034] CH3CN 乙腈
[0035] RP-HPLC 反相高效液相色譜
[0036] ESI-MS 電噴霧電離質(zhì)譜
[0037] MTT 3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 本實(shí)施例采用常規(guī)方法Fmoc固相多肽合成法合成本發(fā)明多肽ALKG，具體合成步 驟如下：
[0040] 1、第一個(gè)氨基酸 Fmoc-Gly-OH 與 Rink Amide MBHA 樹脂的連接：
[0041] 步驟1. 1、稱取2g(lmmol，0. 5mol/g)Rink Amide MBHA樹脂置于反應(yīng)器中，加入 IOml DCM溶脹樹脂，振蕩2h之后真空抽濾除去DCM，得到溶脹后的樹脂。
[0042] 步驟 L 2、吸取 IOml THF 與 DMF混合液（V:V = 11:9)溶解 2. 5mmol Fmoc-Gly-OH, 待溶解后加入3mmol DIC和2. 5mmol HOBt，冰浴下攪拌反應(yīng)30min。然后過濾除去沉淀，將 該濾液加入步驟I. 1得到的溶脹后的樹脂中，再加入〇. 5mmol DMAP，室溫下反應(yīng)4h。真空 抽濾除去反應(yīng)液得到接合有Gly的樹脂，用DMF、DCM、MeOH分別洗滌該接合有Gly的樹脂三 次，每次3min。
[0043] 步驟1. 3、將4ml無水吡啶、4ml乙酸酐與20ml DMF混合，得到脫Fmoc試劑，將該混 合物加入上述步驟1. 2得到的接合有Gly的樹脂中，反應(yīng)2h ;反應(yīng)結(jié)束后分別用DMF、DCM、 MeOH各IOml依次洗滌該得到的樹脂，每次3min，真空干燥；再向該樹脂中加入IOml PIP與 DMF混合液（V:V = 1:4)，反應(yīng)20min，脫去Fmoc保護(hù)基；最后依次加入IOml DMF、MeOH、DCM 分別洗滌樹脂三遍，真空抽濾。
[0044] 2、肽鏈的延伸：
[0045] 將 2. 5mmol Fmoc-Leu-OH 和 2. 5mmol HOBt 溶解于 IOml THF 與 DMF(V:V = 11:9) 混合液中，逐滴加入2. 5mmol DIC，20°C下反應(yīng)lh，過濾去掉沉淀，將所得濾液加入到步驟1 得到的樹脂中反應(yīng)。反應(yīng)進(jìn)程采用Chloranil方法檢測。反應(yīng)結(jié)束后，真空抽濾除去反應(yīng) 液，依次加入IOml的DMF、MeOH和DCM洗滌樹脂三遍，真空抽濾。向樹脂中加入5ml PIP與 DMF混合液（V:V = 1:4)，反應(yīng)20min，脫去Fmoc保護(hù)基。向反應(yīng)后的樹脂中依次加入IOml DMF、MeOH、DCM洗滌樹脂三遍，真空抽濾。
[0046] 按照縮合Fmoc-Leu-OH的操作步驟，依次縮合其余10個(gè)氨基酸（Leu、Cys、Leu、 Ser、Val、Gly、Cys、Val、Phe和Lys)，得到12肽-樹脂。加入DCM洗滌該12肽-樹脂，真 空干燥過夜。
[0047] 3、肽樹脂的切割及純化：
[0048] 將步驟2得到的12肽-樹脂置于砂芯反應(yīng)器中，加入20ml切割試劑（0. 5ml H2O, 0.5ml TIS，19ml TFA)，反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液。向濃縮液中加入 IOOml冰乙醚，析出沉淀。4?下，5000rpm下離心IOmin,然后棄去上清液，真空干燥沉淀即 得粗肽產(chǎn)物。
[0049] 將得到的粗肽溶于水中，冷凍干燥。將干燥后的粗肽溶于水中，lOOOOr/min離心 lOmin，除去沉淀后使用制備級RP-HPLC色譜純化。
[0050] 色譜純化條件：色譜柱（4. 6*250mm，VYDAC-C18)，流動相 A 為 0· 1 % TFA/CH3CN，流 動相B為0. 1% TFA/H20,檢測波長為220nm。洗脫梯度為10-60% A，25min。收集保留時(shí)間 tK = 17. 23min處目標(biāo)峰，冷凍干燥得到本發(fā)明ALKG肽純品。
[0051] 本發(fā)明多肽ALKG還能根據(jù)本發(fā)明中氨基酸序列，使用其他常規(guī)合成法（如采用其 他縮合方式的固相合成法、液相合成法、自動多肽合成儀等）合成其全序列。本實(shí)施例1不 限制本發(fā)明多肽ALKG的制備方法。
[0052] 實(shí)施例2
[0053] 本發(fā)明多肽ALKG的質(zhì)譜鑒定及RP-HPLC分析：
[0054] ESI-MS質(zhì)譜分析：檢測方法為正離子檢測。實(shí)施例1制備的多肽ALKG的檢測結(jié) 果為：[M+H]+= 1238.80(多肽ALKG分子量為1238. 57)。質(zhì)譜分析結(jié)果符合預(yù)測，可以確 定產(chǎn)物為多肽ALKG，結(jié)果如圖1所示。
[0055] RP-HPLC分析：取Img ALKG肽純化制品，溶解于Iml雙蒸水，經(jīng)直徑0. 22 μ m濾膜 過濾以備分析。液相分析條件：色譜分析柱（4. 6*250mm，phenomenex C18-5);流動相A: 0· 1% TFA in 100% CH3CN ;流動相 B :0· 1% TFA in 100% H2O,流速：1. Oml/min，檢測波長 22〇11111。分析梯度為36-61%4,251^11。保留時(shí)間、=8.8031^11，純度為95.47%，結(jié)果如 圖2所示。
[0056] 實(shí)施例3
[0057] 本發(fā)明多肽ALKG抑制腫瘤活性實(shí)驗(yàn)：
[0058] A. MTT 實(shí)驗(yàn)。
[0059] 培養(yǎng)白血病細(xì)胞系HL60與U937及正常PBMC細(xì)胞，待細(xì)胞生長至對數(shù)期后，分別 加入 100 μ Μ、10 μ Μ、1 μ Μ、(λ 1 μ M 本發(fā)明多肽 ALKG，5% C02、37°C 條件下分別孵育 24h、48h、 72h，MTT法檢測捕獲肽對正常細(xì)胞與白血病細(xì)胞系的生長抑制作用。
[0060] 如圖3所示，本發(fā)明多肽ALKG的腫瘤抑制活性隨著加藥時(shí)間的增高而升高，而對 正常PBMC細(xì)胞沒有明顯的抑制作用。在100 μ M時(shí)，多肽ALKG對白血病細(xì)胞HL60與U937 的生長均有明顯的抑制作用（Ρ彡0. 05)。100 μ M肽濃度下，多肽ALKG對于HL60的24h、 48h、72h 腫瘤抑制率分別為 46. 33%、50. 79%、59. 75%，對于 U937 的 24h、48h、72h 腫瘤抑 制率分別為24. 3%、60· 86%、63· 75%，均具有時(shí)間依賴性。
[0061] B.流式細(xì)胞儀檢測凋亡。
[0062] 培養(yǎng)白血病細(xì)胞系HL60與U937,待細(xì)胞生長至對數(shù)期。實(shí)驗(yàn)組與對照組分別加入 100 μ M本發(fā)明多肽ALKG，5% C02、37°C條件下孵育，分別于24h、36h、48h收集一次細(xì)胞，流 式細(xì)胞儀檢測本發(fā)明多肽ALKG對白血病細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。
[0063] 流式細(xì)胞儀檢測條件，激發(fā)波長Ex = 488nm，發(fā)射波長Em = 530nm，Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道（FLl)檢測；PI紅色熒光通過PI通道（FL3)檢測。熒光 補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞作為對照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定 十字門的位置。
[0064] 如圖4所示，與對照組相比，ΙΟΟμΜ肽濃度下，本發(fā)明多肽ALKG對于HL60的24h、 36h、48h 凋亡誘導(dǎo)率分別為：18. 2%、29. 58%、32. 53%，對于 U937 的 24h、36h、48h 凋亡誘 導(dǎo)率分別為：19. 89%、19. 92%、25. 81%。本發(fā)明多肽ALKG對白血病細(xì)胞系HL60與U937 具有明顯的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。從圖中可以看出，本發(fā)明多肽ALKG作用于HL60與U937后，細(xì) 胞出現(xiàn)了明顯的早期凋亡跡象。
[0065] 以上研究結(jié)果表明，本發(fā)明多肽ALKG對于白血病細(xì)胞系HL60與U937具有明顯的 腫瘤生長抑制與促凋亡活性，為白血病的分子靶向治療提供了新的藥物候選與物質(zhì)基礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1. 一種多肽ALKG，其特征在于，其氨基酸序列為：Lys-Phe-Val-Cys-Gly-Val-Ser-Leu -Cys-Leu-Leu-Gly，分子量為 1238. 57。
2. 如權(quán)利要求1所述的多肽ALKG及其氨基酸替代產(chǎn)物在制備白血病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K7/08GK104292306SQ201410487801
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】張惠中, 董軻, 楊龍飛, 林芳 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)