一種抗a型肉毒毒素單克隆抗體及其重鏈和輕鏈可變區(qū)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了抗A型肉毒毒素單克隆抗體及其輕鏈和重鏈可變區(qū)。提供了具有生物學(xué)活性的抗A型肉毒毒素單克隆抗體FMU-BTA49的輕鏈和重鏈可變區(qū)。本發(fā)明通過基因工程技術(shù)和雜交瘤技術(shù)制備了一組小鼠抗A型肉毒毒素mAbs，篩選出能穩(wěn)定分泌高特異性的抗A型肉毒毒素mAb的雜交瘤細(xì)胞株，制備腹水獲得高特異性、高親和力的抗A型肉毒毒素mAbFMU-BTA49。確認(rèn)該基因序列和相應(yīng)蛋白序列的惟一性及其CDR序列；為研制和開發(fā)抗A型肉毒毒素嵌合或人源化基因工程抗體或分子診斷和治療試劑提供支持。
【專利說明】一種抗A型肉毒毒素單克隆抗體及其重鏈和輕鏈可變區(qū)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種單克隆抗體，具體涉及一種抗A型肉毒 毒素單克隆抗體（FMU-BTA49)及其重鏈和輕鏈可變區(qū)。

【背景技術(shù)】
[0002] 肉毒毒素 （botulinum neurotoxins，BoNTs)由肉毒梭菌產(chǎn)生，是典型的A-B型神 經(jīng)外毒素，可以抑制神經(jīng)肌肉接頭處突觸部位乙酰膽堿遞質(zhì)囊泡的釋放，通過阻斷神經(jīng)肌 肉接頭處沖動傳導(dǎo)造成的肌肉麻痹而發(fā)揮毒理作用。BoNTs是目前已知毒性最強(qiáng)的毒素，小 于1微克即可以殺死一個成年人，至今已發(fā)現(xiàn)有7種血清型（A、B、C、D、E、F和G型），其中 引起人類中毒的主要是A、B、E和F型。BoNTs的制備、運(yùn)輸及釋放相對其他毒素更為容易， 因此美國疾病控制中心將其列為A類級別的生物威脅，其中以A型軍事意義最大。BoNTs毒 性大，性質(zhì)穩(wěn)定，制備工藝相對簡單，易被恐怖分子獲得，并且能夠以氣溶膠形式散布，容易 污染食物和水源，是聯(lián)合國《禁止生物武器公約》核查的重要生物戰(zhàn)劑。在海灣戰(zhàn)爭期間， 就曾在伊拉克方面查出疑似肉毒武器。更為重要的是，平時肉毒桿菌也可以污染肉類和罐 頭、奶粉等食品而引起食用者中毒，例如2013年新西蘭恒天然公司加工廠因管線遭到肉毒 桿菌污染，在全球7個國家內(nèi)緊急召回1000噸乳清蛋白制品。2003年陜西省岐山縣發(fā)生肉 毒中毒事件，當(dāng)時全國范圍內(nèi)沒有可用于救治的抗毒素，最終從德國獲得抗毒素制劑空運(yùn) 到國內(nèi)救治患者。目前美容注射肉毒毒素也日益普遍，不規(guī)范的操作同樣具有潛在的肉毒 毒素中毒危險。
[0003] 單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)是免疫學(xué)領(lǐng)域的重大突破，單抗制劑的廣泛應(yīng)用對生命科 學(xué)研究和臨床醫(yī)療實(shí)踐都具有非同尋常的重要意義。利用靶向待檢測抗原分子的特異性單 克隆抗體，可以開發(fā)出定量檢測相應(yīng)抗原成分的高靈敏度試劑盒，而能檢測到低劑量肉毒 毒素的高靈敏度的方法對反生物武器戰(zhàn)爭和反恐怖襲擊具有重要的軍事用途，對于日常食 物中毒的快速檢測鑒定同樣具有重要意義。與此同時，救治肉毒毒素中毒的最有效方法是 盡早注射抗毒素抗體。利用單克隆抗體制備技術(shù)，開發(fā)并篩選出高親和力高特異性的中和 活性抗體，可以有效阻斷肉毒毒素的致病毒理作用，挽救肉毒毒素中毒患者的生命。
[0004] 1、肉毒梭菌概述
[0005] 肉毒梭菌（Clostridium botulinum)是厭氧的革蘭氏陽性的芽孢菌，廣泛存在于 土壤中，在滅菌不良的密封性罐裝食品中能夠生長。肉毒梭菌是比較老的一種分類，能夠產(chǎn) 生毒素并導(dǎo)致肌肉軟癱的細(xì)菌被稱為肉毒類細(xì)菌。肉毒類細(xì)菌根據(jù)其基因型和表型可以 分為四組，第一、二組細(xì)菌可產(chǎn)生導(dǎo)致人類中毒的神經(jīng)毒素，即肉毒毒素。第三組產(chǎn)生的神 經(jīng)外毒素人類雖然也易感，但是多見于動物中毒，人類中毒鮮有報道。第四類可產(chǎn)生肉毒 毒素樣蛋白，但是并未導(dǎo)致人或動物的中毒，故此類細(xì)菌改稱為阿根廷梭菌（Clostridium argentinense)。根據(jù)對人類致病性分類，第一組主要產(chǎn)生A型、B型或F型毒素，第二組主 要產(chǎn)生B型、E型或F型毒素。第一、二組肉毒梭菌各菌株間差異明顯，第一組梭菌多見于 溫帶地區(qū)，芽孢具有較高的熱抵抗能力，常導(dǎo)致罐裝食品以及家庭自制植物性食品（我國 主要為豆制品，豆腐乳、豆瓣醬等發(fā)酵腌制類食品）以及家庭儲存的肉類（如臘肉）等食物 的污染。第二組多見于北半球大洋水產(chǎn)品中，特別是E型毒素最為典型，菌株芽孢對熱抵抗 力差，常導(dǎo)致冷藏類食物中毒。
[0006] 2.肉毒毒素
[0007] 肉毒毒素是典型的A-B型細(xì)菌神經(jīng)性外毒素。其前體蛋白為分子量150KD的無活 性單鏈蛋白，由肉毒梭菌分泌時或者細(xì)菌培養(yǎng)液中被內(nèi)切酶剪切、并重新組合為雙鏈分子 而活化。由鏈間二硫鍵鏈接100KD重鏈和50KD輕鏈，折疊為具有3個亞單位的功能性肉毒 毒素。重鏈羧基端為祀細(xì)胞表面受體結(jié)合片段（receptor binding domain, RBD)，介導(dǎo)毒 素識別并結(jié)合到哺乳動物外周α運(yùn)動神經(jīng)元神經(jīng)肌肉接頭的突觸前膜，重鏈氨基端則介 導(dǎo)毒素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，可將輕鏈或者全毒素轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞內(nèi)。輕鏈?zhǔn)卿\離子依賴的蛋白內(nèi)切 酶，可以水解SNARE蛋白，抑制神經(jīng)肌肉接頭處突觸前成份的乙酰膽堿（Ach)囊泡釋放，繼 而造成神經(jīng)肌肉接頭處沖動傳導(dǎo)障礙，引起肌肉軟癱。肉毒毒素患者死亡多是由于呼吸肌 麻痹導(dǎo)致的。
[0008] 3· A型肉毒毒素抗體研究現(xiàn)狀
[0009] 目前美國研制并儲備兩種肉毒多價抗毒素制品，2006年美國聯(lián)邦政府健康與公共 事業(yè)部斥資3. 63億美元購買20萬人份抗毒素作為國家戰(zhàn)略儲備。目前在研由3種抗體組 合形成的治療A型肉毒毒素中毒的組合抗體，其中和活性較單一抗體組分可提高2萬倍，高 于馬抗血清效價40倍以上，目前美國FDA已經(jīng)受理審批中。我國蘭州生物制品研究所（蘭 州所）和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院曾研制成功多抗血清，2003年陜西省岐山縣的中毒事件以后，國 家恢復(fù)專項撥款，在蘭州所重啟了抗毒素馬血清的生產(chǎn)和儲備任務(wù)。
[0010] 抗肉毒人源化抗體可以替代傳統(tǒng)的馬血清，減少異種蛋白反應(yīng)，最重要的優(yōu)勢在 于發(fā)生緊急情況時，基因工程抗體可以迅速擴(kuò)大產(chǎn)量，快速部署，是應(yīng)對恐怖襲擊和突發(fā)事 件的一種有效遏制手段。另外，馬抗血清的制備開支巨大，從抗原規(guī)模制備到馬場管理等各 個環(huán)節(jié)都不易操作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明解決的問題在于提供一種抗A型肉毒毒素單克隆抗體及其重鏈和輕鏈可 變區(qū)，該抗體為與A型肉毒毒素特異性結(jié)合的抗體，并且具有高度的中和活性，可以用于救 治肉毒毒素中毒，并且為構(gòu)建高特異性的抗A型肉毒毒素嵌合或人源化基因工程抗體提供 支持。
[0012] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0013] 一種抗A型肉毒毒素單克隆抗體，包括重鏈和輕鏈，所述輕鏈的可變區(qū)的3個互補(bǔ) 決定區(qū)（CDR)序列為：
[0014] CDR1 ：Arg-Ala-Ser-Glu-Ser-Val-Asp-Ser-Tyr-Gly-Asn-Ser-Phe-Met-His ；
[0015] CDR2 ：Arg-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser-Gly ；
[0016] CDR3 ：Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pr〇-Pr〇-Thr ；
[0017] 所述重鏈的可變區(qū)的3個互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)序列分別為：
[0018] CDR1 ：Asp-Tyr-Ala-Met-His ；
[0019] CDR2 ：Arg-Ile-Ser-Pr〇-Tyr-Tyr-Gly-Asp-Ala-Asp-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Arg- Gly-Lys-Ala-Thr ；
[0020] CDR3 :Arg-Ala-Ser-Gly-Thr-Met_Asp-Tyr。
[0021] 所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1 ;重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2 所示。
[0022] 編碼輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ. ID. NO. 3所示，編碼重鏈可變區(qū)的基因序列如 SEQ. ID. N0. 4 所示。
[0023] 抗A型肉毒毒素單克隆抗體在構(gòu)建針對A型肉毒毒素的基因工程抗體或制備分子 診斷和/或治療試劑中的應(yīng)用。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0025] 1、本發(fā)明提供的抗A型肉毒毒素單克隆抗體，是一種高特異性抗A型肉毒毒素單 克隆抗體：與A型肉毒毒素特異性結(jié)合，表現(xiàn)出高親和力、高特異性，具備在體內(nèi)體外中和A 型肉毒毒素的毒理作用，可進(jìn)一步用于肉毒毒素的快速診斷和緊急救治等方面的研究。
[0026] 2、本發(fā)明公開了抗A型肉毒毒素單克隆抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因和氨基酸序 列，序列分析證實(shí)了該抗體序列的惟一性。
[0027] 3、本發(fā)明分析獲得了輕鏈、重鏈可變區(qū)的⑶R區(qū)，在此基礎(chǔ)上為構(gòu)建高特異性、高 親和力的抗A型肉毒毒素嵌合或人源化基因工程抗體提供支持，可根據(jù)本發(fā)明公開的基因 序列及其編碼的氨基酸序列，制備針對A型肉毒毒素功能表位的其它生物制品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為FMU-BTA49mAb輕鏈可變區(qū)基因同源性序列檢測結(jié)果圖；
[0029] 圖2為FMU-BTA49mAb重鏈可變區(qū)基因同源性序列檢測結(jié)果圖；
[0030] 圖3為FMU-BTA49mAb輕鏈可變區(qū)氨基酸同源性序列檢測結(jié)果圖；
[0031] 圖4為FMU-BTA49mAb重鏈可變區(qū)氨基酸同源性序列檢測結(jié)果圖；
[0032] 圖5為抗肉毒毒素 FMU-BTA49體內(nèi)中和保護(hù)作用檢測結(jié)果圖；
[0033] 圖6是肉毒毒素毒理作用示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 本發(fā)明用重組表達(dá)的A型肉毒毒素重鏈蛋白免疫Balb/c小鼠 ，篩選出能穩(wěn)定分泌 高特異性抗A型肉毒毒素單抗FMU-BTA49雜交瘤細(xì)胞株，制備腹水獲得高特異性抗A型肉 毒毒素 mAb ;并確認(rèn)該基因序列和相應(yīng)蛋白序列的惟一'丨生及其CDR序列；為抗A型肉毒毒素 嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。
[0035] 下面結(jié)合具體單克隆抗體的制備方法、抗體特異性和活性檢測，以及序列的檢測 和唯一性的確定對本發(fā)明做詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0036] 本發(fā)明具體按以下步驟實(shí)施：
[0037] 1、抗A型肉毒毒素單抗FMU-BTA49的制備及其特異性鑒定
[0038] 1. 1A型肉毒毒素抗原制備
[0039] 重組表達(dá)的A型肉毒毒素重鏈（rAHc)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院孫志偉教授課題組提供， 濃度為lmg/mL。經(jīng)鑒定具有可以結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞突觸前膜的能力，在高鉀誘導(dǎo)下，模擬在體細(xì) 胞內(nèi)吞毒素的過程。
[0040] 1.2單克隆抗體的制備、純化
[0041] 按單克隆抗體制備方法（《細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，P9-P17)，用A型肉毒 毒素重組重鏈抗原免疫Balb/c小鼠（每只小鼠20 μ g/次，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中 心）。初次免疫，使用弗氏完全佐劑，后續(xù)免疫使用弗氏不完全佐劑，每次間隔3周，均為皮 下多點(diǎn)注射，共免疫4次。末次免疫7?10天后采血測其效價，檢測免疫效果。間隔2? 3周后，經(jīng)腹腔注射抗原再加強(qiáng)免疫，3天后處死動物取脾進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0042] 取對數(shù)生長的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0計數(shù)，同時制備免疫脾細(xì)胞懸液。將骨髓瘤 細(xì)胞與脾細(xì)胞按1:10比例混合進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞（正常 Balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞）的96孔板，37°C、5% 0)2孵箱培養(yǎng)。待克隆出現(xiàn)后，間接ELISA 檢測，挑選陽性克隆。對含有陽性克隆孔的細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，直至獲得能夠 穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞系（體外連續(xù)培養(yǎng)超過6個月）。
[0043] 誘導(dǎo)產(chǎn)生腹水及抗體純化：在獲得能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株后，按常規(guī) 制備腹水（細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一版，P9-P17)。腹水經(jīng)45%飽和硫酸銨沉淀后， 采用QFF陰離子交換層析法純化，純化的FMU-BTA49mAb純度達(dá)95%?？贵w的IgG亞型的 鑒定按Sigma檢測試劑盒說明書操作。對其分泌的抗體進(jìn)行Ig亞類測定（結(jié)果為IgGl亞 類，κ型輕鏈）。
[0044] 參見圖6,為肉毒毒素毒理作用示意圖，從圖中可以看出，有致病活性的肉毒毒素 由輕、重兩條肽鏈組成，功能上可以分為3個亞單位：輕鏈Lc，重鏈羧基端Hc，重鏈氨基端 Hn。He為祀細(xì)胞表面受體結(jié)合片段（receptor binding domain, RBD)，介導(dǎo)毒素識別并結(jié) 合到外周α運(yùn)動神經(jīng)元神經(jīng)肌肉接頭的突觸前膜，重鏈氨基端Hn則介導(dǎo)毒素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)， 可將輕鏈或者全毒素轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞內(nèi)。輕鏈Lc是鋅離子依賴的蛋白內(nèi)切酶，能夠水解突觸 前膜細(xì)胞內(nèi)的SNAP-25蛋白，抑制神經(jīng)肌肉接頭處乙酰膽堿（Ach)囊泡釋放，導(dǎo)致乙酰膽堿 釋放障礙，造成神經(jīng)肌肉接頭處沖動傳導(dǎo)障礙，引起肌肉軟癱。
[0045] 1. 3抗A型肉毒毒素單克隆抗體FMU-BTA49的效價測定
[0046] 用間接ELISA方法測定純化前腹水以及純化后mAb的相對親和力。其中包被抗原 為重組A型肉毒毒素重鏈免疫原，待測樣品為系列稀釋的腹水以及純化后的mAb，檢測抗體 為羊抗鼠-HRP酶標(biāo)記抗體，底物使用ABTS。所篩選出的高親和力FMU-BTA49mAb，腹水效價 為1 X ΚΓ6,純化后效價達(dá)1 X 10'而一般采用間接ELISA檢測腹水效價達(dá)1 X ΚΓ5以上的抗 體即可使用。
[0047] 1. 4抗A型肉毒毒素單克隆抗體FMU-BTA49中和能力的鑒定
[0048] 用制備的抗A型肉毒毒素單抗FMU-BTA49做體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)，分析其在體內(nèi)情況下 對A型肉毒毒素中毒的保護(hù)和緊急救治作用。按照蘭州生物制品所第五研究室提供的標(biāo)準(zhǔn) 致死性小鼠活性實(shí)驗(yàn)方法，并在蘭州生物制品所實(shí)驗(yàn)員指導(dǎo)和監(jiān)督下，進(jìn)行中和保護(hù)能力 測定。
[0049] 步驟如下：
[0050] 將毒素按照所需濃度稀釋至目標(biāo)濃度。每個毒素劑量分為一個組，每組4只小鼠。 陽性對照為蘭州生物制品所提供A型肉毒毒素抗毒素多抗血清，保護(hù)能力大于1U(1U能中 和10 5LD50的肉毒毒素），使用時稀釋10倍，理論保護(hù)能力應(yīng)大于10000LD50。陰性對照單 純注射毒素。
[0051] 按照每只小鼠腹腔注射50yL mAb與目標(biāo)濃度的毒素混合，37°C孵育lh，注射小 鼠腹腔，每只小鼠500 μ L毒素和抗體的混合物。結(jié)果判斷：注射后，分別于24h、48h、72h和 96h觀察并記錄小鼠發(fā)病及死亡情況。以標(biāo)準(zhǔn)品組動物50 %死亡終點(diǎn)比較供試組50 %保護(hù) 終點(diǎn)，推算mAb保護(hù)效價。
[0052] 參見圖5,為本發(fā)明的抗肉毒毒素 FMU-BTA49體內(nèi)中和保護(hù)作用檢測結(jié)果圖，其 中：
[0053] (a)表示FMU-BTA49mAb單獨(dú)使用時即具有較強(qiáng)的中和作用，肉毒毒素在10LD50劑 量時，F(xiàn)MU-BTA49mAb單獨(dú)使用可以完全保護(hù)小鼠，4天后存活率為100% ;
[0054] (b)表示FMU-BTA49mAb單獨(dú)使用時即具有較強(qiáng)的中和作用，肉毒毒素在20LD50劑 量時，F(xiàn)MU-BTA49mAb單獨(dú)使用可以完全保護(hù)小鼠，4天后存活率為100% ;
[0055] (c)表示FMU-BTA49mAb單獨(dú)使用時即具有較強(qiáng)的中和作用，肉毒毒素在50LD50劑 量時，F(xiàn)MU-BTA49mAb單獨(dú)使用可以完全保護(hù)小鼠，4天后存活率為100% ;
[0056] (d)表示FMU-BTA49mAb單獨(dú)使用時即具有較強(qiáng)的中和作用，肉毒毒素在250LD50 劑量時，F(xiàn)MU-BTA49mAb單獨(dú)使用能夠推遲毒素在250LD50劑量時小鼠的致死時間；
[0057] (e)表不FMU_BTA49mAb和另外兩株抗A型肉毒毒素 mAbs聯(lián)合使用，具有更強(qiáng)的 中和作用，肉毒毒素在500LD50劑量時，三株聯(lián)合使用可以完全保護(hù)小鼠,4天后存活率為 100% ；
[0058] (f)表示當(dāng)肉毒毒素劑量進(jìn)一步加大到1000LD50劑量時，F(xiàn)MU-BTA49mAb和另外兩 株抗A型肉毒毒素 mAbs聯(lián)合使用可以部分保護(hù)小鼠，1天后存活率為下降為75%。
[0059] 綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MU-BTA49具有較強(qiáng)的中和保護(hù)作用，且單株保護(hù) 能力在50-100LD50之間，能夠推遲毒素在250LD50劑量時的致死時間。
[0060] 2、抗A型肉毒毒素單抗FMU-BTA49輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的克隆
[0061] 2. lFMU-BTA49mAb雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)
[0062] 按常規(guī)方法復(fù)蘇（細(xì)胞培養(yǎng)，第一版，P88)分泌FMU-BTA49mAb的雜交瘤細(xì)胞，用 含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37°C，5% C02孵箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
[0063] 2. 2單抗FMU-BTA49輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的克隆
[0064] 采用TRIZOL Reagent (購自美國GIBC0公司）提取總RNA，具體操作步驟按說明書 進(jìn)行；cDNA第一鏈合成與單抗輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的克隆委托北京安必奇生物科技有 限公司完成。
[0065] 2. 3FMU-BTA49mAb輕鏈和重鏈可變區(qū)的核苷酸序列及同源性分析
[0066] 3. 1確定測序無誤后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行核苷酸序列同 源性分析（Blastn)。在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行核苷酸序列同源性分析 (Blastn)〇
[0067] 如圖1所示，F(xiàn)MU-BTA49mAb輕鏈可變區(qū)基因與同源性最高對比序列可達(dá) 627/648(97% )；
[0068] 如圖2所示，F(xiàn)MU-BTA49mAb重鏈可變區(qū)基因與同源性最高對比序列可達(dá) 604/661(91% ) 〇
[0069] 同源性分析表明，編碼FMU-BTA49mAb的輕、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，盡管與其 它基因序列有一定同源性，但未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明完全相同的基因序列，表明本發(fā)明在基因序 列上具有惟一性。
[0070] 3. 2將可變區(qū)基因翻譯成氨基酸序列，進(jìn)行氨基酸序列分析
[0071] 單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0. 1，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列 如 SEQ ID N0. 2 所示。
[0072] 在 non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF 蛋白質(zhì) 數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行氨基酸序列同源性分析（Blastp)。
[0073] 分析結(jié)果表明：
[0074] 如圖3所示，F(xiàn)MU-BTA49mAb輕鏈氨基酸序列與同源性最高對比序列可達(dá) 212/217(98% )；
[0075] 如圖4所示，F(xiàn)MU_BTA49mAb重鏈氨基酸序列與同源性最高對比序列可達(dá) 373/436(86% ) 〇
[0076] 同源性分析表明，F(xiàn)MU-BTA49mAb輕、重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，盡管與其它蛋白氨 基酸序列有一定同源性，但未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明完全相同的氨基酸序列，表明本發(fā)明在氨基酸 序列上也具有惟一性。
[0077] 3. 3利用頂GT/V-QUEST分析可變區(qū)結(jié)構(gòu)，確定⑶R區(qū)。
[0078] 將測序所得FMU-BTA49mAb輕鏈和重鏈可變區(qū)序列，委托北京安必奇生物科技 有限公司進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并在頂GT/V-QUEST網(wǎng)站（http://imgt. cines. fr/MGT_ vquest/vquest)進(jìn)行分析，得出其⑶R區(qū)。輕鏈可變區(qū)的3個互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)序列，如 SEQ ID NO. 1劃線部分所示，具體為：
[0079] CDR1：Arg-Ala-Ser-Glu-Ser-Val-Asp-Ser-Tyr-Gly-Asn-Ser-Phe-Met-His ；
[0080] CDR2 ：Arg-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser-Gly ；
[0081] CDR3 ：Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pr〇-Pr〇-Thr ；
[0082] 重鏈可變區(qū)的3個互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)序列，如SEQ ID NO. 2劃線部分所示，具體 為：
[0083] CDR1 ：Asp-Tyr-Ala-Met-His ；
[0084] CDR2 ：Arg-Ile-Ser-Pr〇-Tyr-Tyr-Gly-Asp-Ala-Asp-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Arg-Gly-Lys-Ala-Thr ；
[0085] CDR3 :Arg-Ala-Ser-Gly-Thr-Met-Asp-Ty;r。
[0086] 4.基因工程抗體設(shè)計
[0087] 基于抗Α型肉毒毒素單抗FMU-BTA49mAb的表達(dá)、純化以及序列分析，設(shè)計構(gòu)建以 下生物制品
[0088] 1)單鏈抗體的構(gòu)建：可將本發(fā)明的FMU-BTA49mAb輕、重鏈可變區(qū)基因通過柔性氨 基酸接頭序列進(jìn)行連接，插入原核或真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌或轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，用于制備 可對A型肉毒毒素有中和作用的單鏈抗體。
[0089] 2)人-鼠抗A型肉毒毒素嵌合抗體的構(gòu)建：可將本發(fā)明的FMU-BTA49mAb輕、重鏈 可變區(qū)基因插入通用型嵌合抗體表達(dá)載體中，獲得含嵌合基因的載體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，用于 制備可對A型肉毒毒素有中和作用的嵌合抗體。
[0090] 3)人源化抗體的構(gòu)建：可將本發(fā)明的FMU-BTA49mAb輕、重鏈可變區(qū)基因的CDR區(qū) 移植到人源抗體可變區(qū)的骨架區(qū)中，形成互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)移植抗體，也稱重構(gòu)抗體或人 源化抗體。利用CDR移植技術(shù)改造抗體，可以獲得既保持鼠源性親本mAb特異性，又更加接 近人抗體的新型抗體，用于制備針對A型肉毒毒素有中和作用的人源化抗體。
[0091] 4)可根據(jù)本發(fā)明的基因序列及其編碼的氨基酸序列，制備針對A型肉毒毒素功能 表位的其它生物制品。
[0092] 綜上所述，本發(fā)明公開了具有生物學(xué)活性的抗A型肉毒毒素單克隆抗體 FMU-BTA49的輕鏈和重鏈可變區(qū)，通過采用基因工程技術(shù)和雜交瘤技術(shù)制備了一組小鼠抗 A型肉毒毒素 mAbs，篩選出能穩(wěn)定分泌高特異性的抗A型肉毒毒素 mAb的雜交瘤細(xì)胞株，制 備腹水獲得高特異性、高親和力的抗A型肉毒毒素 mAbFMU-BTA49。同時，確認(rèn)該基因序列和 相應(yīng)蛋白序列的惟一性及其CDR序列，為研制和開發(fā)抗A型肉毒毒素嵌合或人源化基因工 程抗體或分子診斷和治療試劑提供支持。
【權(quán)利要求】
1. 一種抗A型肉毒毒素單克隆抗體，包括重鏈和輕鏈，其特征在于，所述輕鏈的可變區(qū) 的3個互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)序列為 ： CDR1 ：Arg-Ala-Ser-Glu-Ser-Val-Asp-Ser-Tyr-Gly-Asn-Ser-Phe-Met-His ； CDR2 ：Arg-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser-Gly ； CDR3 ：Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pr〇-Pr〇-Thr ； 所述重鏈的可變區(qū)的3個互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)序列分別為： CDR1 ：Asp-Tyr-Ala-Met-His ； CDR2 ：Arg-Ile-Ser-Pr〇-Tyr-Tyr-Gly-Asp-Ala-Asp-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Arg-Gly-Lys-Ala-Thr ； CDR3 :Arg-Ala-Ser-Gly-Thr-Met_Asp-Tyr。
2. 如權(quán)利要求1所述的抗A型肉毒毒素單克隆抗體，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列如SEQ. ID. NO. 1 ;重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3. 如權(quán)利要求1所述的抗A型肉毒毒素單克隆抗體，其特征在于，編碼輕鏈可變區(qū)的基 因序列如SEQ. ID. NO. 3所示，編碼重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
4. 權(quán)利要求1所述的抗A型肉毒毒素單克隆抗體在構(gòu)建針對A型肉毒毒素的基因工程 抗體或制備分子診斷和/或治療試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K16/12GK104231077SQ201410458142
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月10日
【發(fā)明者】張圓, 李永明, 莊然, 楊琨, 劉志佳, 李琦, 宋朝君, 張赟, 方亮, 董蕓, 田瑩, 李娜, 陳麗華, 張春梅, 馬櫻, 張宇絲, 金伯泉 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)