微生物發(fā)酵制備廣昌白蓮降血壓多肽的方法
【專利摘要】一種微生物發(fā)酵制備廣昌白蓮降血壓多肽的方法，將白蓮研磨成粉，發(fā)酵液培養(yǎng)基的配方（kg/L）為：3-6%白蓮粉、1-5%碳源、水，自然pH值；取菌齡處于28-44h的活化菌株，把地衣芽孢桿菌ND稀釋成1mL中含1*107CFU后，按2-6%接種量將種子液接種于發(fā)酵液培養(yǎng)基中，37℃，125r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)32-52h；取發(fā)酵液，10000r/min下離心20min，沉淀為菌體和未水解的白蓮組分，取上清液0.45μm微孔濾膜過濾，濾液真空干燥；用蒸餾水溶解后在葡聚糖凝膠Sephadex-G25下對其進(jìn)行分離純化，根據(jù)各個收集管的OD220，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)凝膠層析后，收集第2個吸收峰真空干燥。本發(fā)明工藝簡單，成本低，獲得的混合多肽分子量多數(shù)小于1500D，且其降血壓活性比使使用木瓜蛋白酶獲得的多肽更好。
【專利說明】微生物發(fā)酵制備廣昌白蓮降血壓多肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于自然資源中肽的提取，特別涉及降血壓活性肽的提取。
技術(shù)背景
[0002]血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin Converting Enzyme, ACE)可以使血壓升高。能抑制ACE活性的物質(zhì)稱為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Angiotensin Converting Enzymeinhibitor,ACEI),研究發(fā)現(xiàn)許多天然蛋白水解肽可以抑制ACE的活性。這些多肽在預(yù)防和治療高血壓方面具有巨大的開發(fā)潛力。食源性蛋白降血壓肽由于其無毒、無副作用、安全性高，可開發(fā)成降壓藥物或者降壓保健品。
[0003]廣昌白蓮具有高蛋白、低脂肪，氨基酸含量豐富的特點(diǎn)，是藥食共用的優(yōu)良保健食品。通過對廣昌干白蓮蓮子中蛋白的組成、溶性和品質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)含蛋白質(zhì)24.94 %，目前利用木瓜蛋白酶從廣昌白蓮中獲得了降血壓活性肽，但是植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等)效率低，受外界環(huán)境因素影響大，成本高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。[0004]微生物發(fā)酵法生產(chǎn)多肽不需要蛋白酶的提取過程，而是直接利用微生物生長過程中產(chǎn)生的各種酶類。此酶系非單一蛋白酶而是多種蛋白酶混合的復(fù)合酶系，包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶等一系列蛋白酶。簡化生產(chǎn)工藝，可有效的降低生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目地是針對現(xiàn)有廣昌白蓮降血壓多肽獲取存在的兩個問題，即成本高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，提供一種獲得降血壓活性較高的白蓮多肽的方法。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0007]將白蓮研磨成粉，發(fā)酵液培養(yǎng)基的配方(kg/L)為:3-6%白蓮粉、1-5%碳源、水，自然pH值。取菌齡處于28-44h的活化菌株，把地衣芽孢桿菌ND稀釋成ImL中含1*107CFU后，按2-6%接種量將種子液接種于發(fā)酵液培養(yǎng)基中，37°C，125r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)32_52h。
[0008]取發(fā)酵液，10000r/min下離心20min，沉淀為菌體和未水解的白蓮組分，取上清液微孔濾膜過濾(0.45 μ m)，濾液真空干燥。用蒸餾水溶解后在葡聚糖凝膠S印hadex-G25下對其進(jìn)行分離純化，根據(jù)各個收集管的OD22tl,發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)凝膠層析后出現(xiàn)3-5個吸收峰，收集第2個吸收峰進(jìn)行真空干燥，其ACE抑制率為60-89%。
[0009]本發(fā)明所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、麩皮或玉米粉中的一種。
[0010]本發(fā)明的最優(yōu)條件:將白蓮研磨成粉，發(fā)酵液培養(yǎng)基的配方(kg/L)為:5%白蓮粉、2%葡萄糖、余為水，自然pH值。取菌齡處于36h的活化菌株，把地衣芽孢桿菌ND稀釋成ImL中含1*107CFU后，按5%接種量將地衣芽孢桿菌ND種子液接種于發(fā)酵液培養(yǎng)基中，37 °C，125r/min搖床培養(yǎng),培養(yǎng)46h。取發(fā)酵液，10000r/min下離心20min,沉淀為菌體和未水解的白蓮組分，取上清液微孔濾膜過濾(0.45 μ m)，濾液真空干燥。用蒸餾水溶解后在葡聚糖凝膠SephadeX-G25下對其進(jìn)行分離純化，根據(jù)各個收集管的OD22tl，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)凝膠層析后出現(xiàn)5個吸收峰。收集第2個吸收峰進(jìn)行真空干燥。其ACE抑制率為88.5%。
[0011]本方法工藝簡單，成本低，HPLC-MS分析結(jié)果表明多肽分子量集中在500-1900D之間。降血壓肽的活性除與其氨基酸的組成及結(jié)構(gòu)有關(guān)外，還與分子量有關(guān)。一般認(rèn)為分子量小于1500D的組分降血壓活性最強(qiáng)，目前已經(jīng)分離和純化得到的降血壓肽多為2-12肽。本研究獲得的混合多肽分子量多數(shù)小于1500D。且其降血壓活性比使使用木瓜蛋白酶獲得的多肽更好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明發(fā)酵液多肽經(jīng)葡聚糖凝膠S印hadex-G25分離后的降血壓混合多肽HPLC-MS 圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0013]本發(fā)明將通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
[0014]實(shí)施例1。
[0015]將白蓮研磨成粉，發(fā)酵液培養(yǎng)基的配方(kg/L)為:4%白蓮粉、3%葡萄糖、余為水，自然PH值。取菌齡處于36h的活化菌株，按5%接種量將地衣芽孢桿菌ND種子液接種于發(fā)酵液培養(yǎng)基中，37°C，125r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)46h。取發(fā)酵液，10000r/min下離心20min，沉淀為菌體和未水解的白蓮組分，取上清液微孔濾膜過濾(0.45 μ m)，濾液真空干燥。用蒸餾水溶解后在葡聚糖凝膠SephadeX-G25下對其進(jìn)行分離純化，根據(jù)各個收集管的OD22tl，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)凝膠層析后出現(xiàn)4個吸收峰。收集第2個吸收峰進(jìn)行真空干燥。其ACE抑制率為為 64.13%。
[0016]實(shí)施例2。
[0017]將白蓮研磨成粉，發(fā)酵液培養(yǎng)基的配方(kg/L)為:5%白蓮粉、2%葡萄糖、余為水，自然PH值。取菌齡處于38h的活化菌株，按4%接種量將地衣芽孢桿菌ND種子液接種于發(fā)酵液培養(yǎng)基中，37°C，125r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)42h。取發(fā)酵液，10000r/min下離心20min，沉淀為菌體和未水解的白蓮組分，取上清液微孔濾膜過濾(0.45 μ m)，濾液真空干燥。用蒸餾水溶解后在葡聚糖凝膠SephadeX-G25下對其進(jìn)行分離純化，根據(jù)各個收集管的OD22tl，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)凝膠層析后出現(xiàn)3個吸收峰。收集第2個吸收峰進(jìn)行真空干燥。其ACE抑制率為為 75.44%ο
【權(quán)利要求】
1.一種微生物發(fā)酵制備廣昌白蓮降血壓多肽的方法，其特征是將白蓮研磨成粉，發(fā)酵液培養(yǎng)基的配方(kg/L)為:3-6%白蓮粉、1-5%碳源、水，自然pH值；取菌齡處于28_44h的活化菌株，把地衣芽孢桿菌ND稀釋成ImL中含1*107CFU后，按2_6%接種量將種子液接種于發(fā)酵液培養(yǎng)基中，37°C，125r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)32_52h ； 取發(fā)酵液，10000r/min下離心20min，沉淀為菌體和未水解的白蓮組分，取上清液0.45 μ m微孔濾膜過濾，濾液真空干燥；用蒸餾水溶解后在葡聚糖凝膠S印hadeX-G25下對其進(jìn)行分離純化，根據(jù)各個收集管的OD22tl，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)凝膠層析后，收集第2個吸收峰進(jìn)行真空干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵制備廣昌白蓮降血壓多肽的方法，其特征是所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、麩皮或玉米粉中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物發(fā)酵制備廣昌白蓮降血壓多肽的方法，其特征是將白蓮研磨成粉，發(fā)酵液培養(yǎng)基的配方(kg/L)為:5%白蓮粉、2%葡萄糖、余為水，自然pH值；取菌齡處于36h的活化菌株，把地衣芽孢桿菌ND稀釋成ImL中含1*107CFU后，按5%接種量將地衣芽孢桿菌ND種子液接種于發(fā)酵液培養(yǎng)基中，37°C，125r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)46h ;取發(fā)酵液，10000r/min下離心20min，沉淀為菌體和未水解的白蓮組分，取上清液0.45 μ m微孔濾膜過濾，濾液真空干燥；用蒸餾水溶解后在葡聚糖凝膠SephadeX-G25下對其進(jìn)行分離純化，根據(jù)各個收集管 的OD22tl,發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)凝膠層析后，收集第2個吸收峰進(jìn)行真空干燥。
【文檔編號】C07K1/36GK103911417SQ201410145355
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月14日
【發(fā)明者】吳麗萍, 段元丹, 李恒, 袁建贛, 李曼 申請人:南昌大學(xué)