鹽析和部分溶解洗滌法純化IFN-τ包涵體蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種依靠鹽析和部分溶解洗滌法純化IFN-τ包涵體蛋白的方法，通過鹽析、部分溶解鹽析沉淀、復(fù)性即可獲得高純度高活性的蛋白質(zhì)，不需要再進行諸如離子交換色譜、分子篩等既繁瑣費事又成本高昂的精純化操作，蛋白純度即可高達90％以上，達精純化標(biāo)準(zhǔn)，目的蛋白損失量小，蛋白活性良好。該方法具有成本低廉、操作簡單、重復(fù)性好、快速高效的優(yōu)點，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】鹽析和部分溶解洗滌法純化IFN-τ包涵體蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種依靠鹽析和部分溶解洗滌法純化IFN- τ包涵體蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)純化要利用不同蛋白質(zhì)間內(nèi)在的相似性與差異，利用各種蛋白質(zhì)間的相似性來除去非蛋白質(zhì)的污染，而利用各種蛋白質(zhì)間的差異將目的蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)中純化出來。每種蛋白質(zhì)間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會有差異，利用這些差異可將目的蛋白質(zhì)從混合物如包涵體蛋白中提取出來。
[0003]目前蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細純化階段二個階段。經(jīng)過粗分離階段后還需要利用離子交換色譜、分子篩精純化方法才能達到90%以上純度的精純化標(biāo)準(zhǔn)，步驟繁瑣費事，成本高昂。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種依靠鹽析和部分溶解洗滌法純化IFN- τ包涵體蛋白的方法，成本低廉、操作簡單、重復(fù)性好、目的蛋白損失量小，僅憑借此方法即可達到90%以上純度的精純化標(biāo)準(zhǔn)，從而不需要再進行諸如離子交換色譜、分子篩等精細純化操作。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種以鹽析和部分溶解洗滌法純化IFN- τ包涵體蛋白的方法,包括以下步驟:
[0006]I)表達蛋白質(zhì)的工程菌發(fā)酵后，收集、裂解菌體，然后收集、洗滌包涵體，并用包涵體溶解液溶解包涵體，再以40%飽和度硫酸銨溶液進行鹽析沉淀；
[0007]2)取用鹽析沉淀的同體積的包涵體溶解液，以部分溶解方式溶解鹽析沉淀，離心后檢測上清中的目的蛋白純度，丟棄上清，留取沉淀；
[0008]3)將所留沉淀重復(fù)進行步驟2)操作，重復(fù)2-4次，最后將剩余沉淀充分溶解并復(fù)性，即可獲得高純度高活性的蛋白質(zhì)。
[0009]具體地,所述步驟I)中溶解包涵體的包涵體溶解液成分為:Bis_Tris (二(2_輕乙基)亞胺基三(羥甲基)甲烷)20mM、Urea (尿素)8M、EDTA(乙二胺四乙酸)10mM、DTT (二硫蘇糖醇)IOmM用去離子水溶解，然后用鹽酸調(diào)pH值到5.8。
[0010]具體地，所述步驟I)硫酸銨溶液配制如下:以包涵體溶解液為溶劑配制飽和硫酸銨溶液，加Bis-Tris至濃度30mM,濃硫酸調(diào)pH值至5.8。
[0011]具體地，所述步驟2)中的部分溶解方式為包涵體溶解液的用量不足以使鹽析沉淀完全溶解，僅使其部分溶解。
[0012]具體地，所述步驟3)中的重復(fù)次數(shù)由上清中目的蛋白的純度(即目的蛋白占總蛋白的百分比)來決定，如果純度下降，則丟棄上清，留取沉淀。因為隨著重復(fù)次數(shù)的增多，上清中的目的蛋白純度會逐漸升高，使得在部分溶解與完全溶解的這兩種情況下，上清中蛋白純度的差值減小，這樣情況下純化效果會變差，且造成目的蛋白的丟失。所以，實驗者可根據(jù)自己的實驗?zāi)康淖孕袥Q定合適的重復(fù)次數(shù)。
[0013]具體地，所述步驟3)中將剩余沉淀充分溶解的溶解液為包涵體溶解液。
[0014]本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明是一種僅僅依靠鹽析和部分溶解洗滌法即完成IFN- τ包涵體蛋白純化的方法，不需要再進行諸如離子交換色譜、分子篩等既繁瑣費事又成本高昂的精純化操作，蛋白純度即可高達90%以上，達精純化標(biāo)準(zhǔn)，目的蛋白損失量小，蛋白活性良好。該方法具有成本低廉、操作簡單、重復(fù)性好、快速高效的優(yōu)點，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是實施例1中鹽析和部分溶解法純化IFN- τ過程中的SDS-PAGE圖譜。
[0016]圖2是圖1經(jīng)Bandscan5.0軟件分析后的圖譜。
[0017]圖3是圖1經(jīng)Bandscan5.0軟件分析后，軟件生成的以表格形式顯示的各樣品目的蛋白純度。
【具體實施方式】
[0018]以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步作描述，但是本發(fā)明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0019] 實施例1
[0020]以干擾素-τ包涵體蛋白(IFN-τ )的純化為例。
[0021]①IFN-τ誘導(dǎo)表達:
[0022]本發(fā)明所用重組蛋白的工程菌是由含有IFN- τ基因的溫控型重組質(zhì)粒pBV220轉(zhuǎn)化E.coli BL21獲得。培養(yǎng)溫度為30°C，誘導(dǎo)溫度為42°C。
[0023]②菌體裂解和包涵體的洗滌:
[0024]常規(guī)方法進行。
[0025]③鹽析沉淀液配制:
[0026]以包涵體溶解液稀釋鹽析沉淀液至其蛋白濃度于25_30mg / mL。其中包涵體溶解液成分:Bis-Tris20mM、Urea8M、EDTAlOmM、DTTlOmM去離子水配置，用鹽酸調(diào)pH值到5.8。
[0027]④配制飽和硫酸銨溶液配制:
[0028]以包涵體溶解液為溶劑配制飽和硫酸銨溶液。加Bis-Tris至濃度30mM，濃硫酸調(diào)pH值至5.8。
[0029]⑤鹽析步驟:
[0030](TC條件下，以步驟③所配制蛋白溶液作為鹽析沉淀液，向此溶液中緩慢添加步驟④所配置硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，使硫酸銨終濃度達45%飽和度(硫酸銨濃度的表示方法是以飽和溶液的體積百分?jǐn)?shù)表示，稱為百分飽和度)。加完后繼續(xù)攪拌30min，0°C放置3小時以上，以形成較大沉淀而易于分離。1000Og離心lOmin，收集沉淀。
[0031]⑥部分溶解法純化:
[0032]取用鹽析沉淀的相同體積的包涵體溶解液，部分溶解鹽析沉淀，離心后丟棄上清，留取沉淀。再將所留的沉淀重復(fù)進行以上操作，重復(fù)3次。[0033]⑦溶解剩余沉淀:
[0034]用包涵體溶解液(最少需用沉淀體積的4-5倍的溶解液)將剩余沉淀完全溶解。
[0035]⑧復(fù)性及純化產(chǎn)物活性測定:
[0036]透析復(fù)性后，進行重組IFN- τ的活性測定。
[0037]在常規(guī)方法純化IFN- τ的實驗中，我們意外地發(fā)現(xiàn)了一個現(xiàn)象:某次實驗中，因操作失誤，取用溶劑不足，未將蛋白沉淀完全溶解，此情況下SDS-PAGE蛋白電泳顯示上清中干擾素_τ (21KD分子量位置)含量只占總蛋白的大約15%。而正常操作，即取用足量的溶解液使沉淀充分溶解時，上清中干擾素-τ可達到約50%。這說明:當(dāng)溶劑體積不足時，溶出的上清中的各種蛋白的構(gòu)成比發(fā)生了巨大變化。推測其原因:溶劑足夠時重組蛋白和雜蛋白都能得以充分溶解，溶解度的差異不能直接得以體現(xiàn)；而溶劑體積不足的情況下，各種蛋白間的溶解度差異得以體現(xiàn)，即溶解度較大的蛋白受溶劑不足因素影響不明顯，可以順利溶出，而溶解度較小的蛋白的溶出會受到較大影響，不易溶出。
[0038]利用此現(xiàn)象，我們發(fā)明了依靠鹽析和部分溶解洗滌法純化IFN- τ包涵體蛋白的方法。本發(fā)明方法中，目的蛋白及雜蛋白的溶解要比單純的鹽析沉淀的復(fù)溶更復(fù)雜:因為本方法中引入了溶劑不足這一影響因素，使目的蛋白與雜蛋白的溶解度差異在上清和沉淀的分配上得到體現(xiàn)，從而可以用分離上清和沉淀的方法分離雜蛋白和目的蛋白，提高目的蛋白純度。
[0039]實驗證明此發(fā) 明方法簡單有效，經(jīng)過三次部分溶解法洗滌沉淀后，目的蛋白純度由44.1%升至90.3%,目的蛋白損失量小。結(jié)果如下:
[0040]將以上各步驟獲得的沉淀進行SDS-PAGE電泳，得到圖1所示的SDS-PAGE圖譜，其中條帶最明顯處對應(yīng)的是21KD的位置，即目的條帶。圖中共有5個泳道，分別對應(yīng):1:硫酸銨沉淀前的包涵體蛋白溶液；2:45%百分飽和度硫酸銨鹽析所獲沉淀；3:將泳道2沉淀部分溶解后棄上清所余沉淀；4:將泳道3沉淀部分溶解后棄上清所余沉淀；5:將泳道4沉淀部分溶解后棄上清所余沉淀(注:以上泳道樣品是是各沉淀以8Μ尿素充分溶解并離心后所獲上清)。將圖1SDS-PAGE圖譜用Bandscan5.0軟件分析得到圖2，軟件中點擊圖中目的條帶，得到圖3，圖3以表格形式顯示了各泳道中目的蛋白純度。各泳道名稱、目的蛋白純度及所余沉淀體積變化如表1總結(jié)所示。表1可以看出，經(jīng)常規(guī)硫酸銨沉淀后，目的蛋白純度由沉淀前的30.5%升至44.1 %，而用包涵體溶解液將沉淀經(jīng)過3次部分溶解法純化后，目的蛋白純度由44.1 %逐步升至58.6%, 74.0%,90.3%。結(jié)合沉淀體積分析顯示:此發(fā)明方法目的蛋白損失量小。
[0041 ] 表1SDS-PAGE圖譜中各泳道的目的蛋白純度及所余沉淀體積變化[0042]
【權(quán)利要求】
1.鹽析和部分溶解洗滌法純化IFN-τ包涵體蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)表達蛋白質(zhì)的工程菌發(fā)酵后，收集、裂解菌體，然后收集、洗滌包涵體，并用包涵體溶解液溶解包涵體，再以40%飽和度硫酸銨溶液進行鹽析沉淀； 2)取用鹽析沉淀同體積的包涵體溶解液，以部分溶解方式溶解鹽析沉淀，離心后檢測上清中的目的蛋白純度，丟棄上清，留取沉淀； 3)將所留沉淀重復(fù)進行步驟2)操作，重復(fù)2-4次，最后將剩余沉淀充分溶解并復(fù)性，即可獲得聞純度聞活性的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽析和部分溶解洗滌法純化IFN-τ包涵體蛋白的方法，其特征在于，所述步驟I)中溶解包涵體的包涵體溶解液成分為:Bis-Tris20mM、Urea8M、EDTAlOmM、DTTlOmM用去離子水溶解，然后用鹽酸調(diào)pH值到5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鹽析和部分溶解洗滌法純化IFN-τ包涵體蛋白的方法，其特征在于，所述步驟I) 40%飽和度硫酸銨溶液配制如下:以包涵體溶解液為溶劑配制飽和硫酸銨溶液，加Bis-Tris至濃度30mM，濃硫酸調(diào)pH值至5.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽析和部分溶解洗滌法純化IFN-τ包涵體蛋白的方法，其特征在于，所述步驟2)中的部分溶解方式為包涵體溶解液的用量不足以使鹽析沉淀完全溶解，僅使其部分溶解。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽析和部分溶解洗滌法純化IFN-τ包涵體蛋白的方法，其特征在于，所述步驟3)中的重復(fù)次數(shù)由上清中目的蛋白的純度來決定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽析和部分溶解洗滌法純化IFN-τ包涵體蛋白的方法，其特征在于，所述步驟3)中將剩余沉淀`充分溶解的溶解液為包涵體溶解液。
【文檔編號】C07K1/30GK103724421SQ201410013433
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】呂麗燕 申請人:呂麗燕