抗磷脂酶d4抗體的制作方法
【專利摘要】結(jié)合磷脂酶D4(PLD4)蛋白的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段。NITE BP-12112012.01.27NITE BP-12142012.01.27NITE BP-12132012.01.27NITE BP-12122012.01.27
【專利說(shuō)明】抗磯脂酶D4抗體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及結(jié)合磯脂酶D4的抗體。在下文中，"磯脂酶D"可被縮寫為PLD，并且 "磯脂酶D4"等可被縮寫為PLD4等。
[000引背景領(lǐng)域
[0003] 干擾素（在下文中，"干擾素"可被縮寫為IFN)是抗病毒免疫反應(yīng)中最重要的細(xì) 胞因子。人血中的干擾素生成細(xì)胞（IPC JPC是未分化的基于淋己細(xì)胞的樹突細(xì)胞，其被定 位為樹突細(xì)胞值C)的前體細(xì)胞。IPC還可稱為漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞或漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞 (PDC)。此后，在本說(shuō)明書中，IPC和pDC是同義的，并且在下文中一律W術(shù)語(yǔ)pDC相稱），表 達(dá)CD4和主要組織相容性復(fù)合物II類蛋白。然而，由于不充分的該樣的細(xì)胞的數(shù)量、快速 細(xì)胞調(diào)亡和另外地譜系（系統(tǒng)）標(biāo)志物的缺乏，直至現(xiàn)在仍未進(jìn)行細(xì)胞的分離或具體表征。 已發(fā)現(xiàn)pDC為樹突細(xì)胞的CD4+CD11(T2型前體細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)在微生物的刺激后pDC產(chǎn)生的 IFN比其它血細(xì)胞產(chǎn)生的IFN要高200至1000倍。因此，pDC為抗病毒/抗腫瘤免疫反應(yīng) 中的決定性免疫系統(tǒng)效應(yīng)細(xì)胞。
[0004] IFNa和IFN目被稱為I型IFN，其具有抗病毒活性或抗腫瘤活性。在另一方面，已 發(fā)現(xiàn)IFNa與自身免疫疾病相關(guān)。例如，已報(bào)導(dǎo)具有自身免疫疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和 慢性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患者中的IFNa的異常產(chǎn)生。此外，已報(bào)導(dǎo)了其中在施用重組IFNa 2 或IFN后自身免疫疾病癥狀表達(dá)或加重的病例。還已提出自身免疫癥狀可能通過(guò)IFNa的 中和來(lái)緩和。
[0005] 此外，還已顯示IFNa誘導(dǎo)樹突細(xì)胞值C)的分化。已預(yù)期樹突細(xì)胞的分化的誘 導(dǎo)構(gòu)成了自身免疫疾病的重要機(jī)制，因?yàn)闃渫患?xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞。事實(shí)上，已有人提出 IFNa的樹突細(xì)胞分化的誘導(dǎo)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生深度相關(guān)。如上所述，已指出了 IFNa與自身免疫疾病W及抗腫瘤活性的密切關(guān)系。此外，IFNa還與銀屑病的發(fā)生深度相 關(guān)。
[0006] 僅少數(shù)pDC存在于血液中。預(yù)期占據(jù)外周血淋己細(xì)胞的pDC的比率為1 %或更少。 然而，pDC具有極高的IFN產(chǎn)生能力。pDC的IFN產(chǎn)生能力達(dá)到例如3000pg/mL/104個(gè)細(xì)胞。 也就是說(shuō)，可認(rèn)為在病毒感染時(shí)在血液中產(chǎn)生的大多數(shù)IFNa或IFN目由pDC引起，盡管細(xì) 胞數(shù)目很少。
[0007] pDC通過(guò)病毒刺激分化成樹突細(xì)胞，并且誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Y或白細(xì)胞介素 (IL)-10。此外，pDC還通過(guò)IL-3刺激分化成樹突細(xì)胞。在IL-3刺激后分化的樹突細(xì)胞誘 導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生化2細(xì)胞因子（比-4、比-5、比-10)。如上所述，pDC具有該樣的性質(zhì)；取決于 刺激的不同其分化成不同的樹突細(xì)胞。
[0008] 因此，pDC是具有個(gè)方面的細(xì)胞，即一方面作為IFN生成細(xì)胞，另一方面作為樹突 細(xì)胞的前體細(xì)胞。細(xì)胞的任一方面在免疫系統(tǒng)中都起著重要作用。目P，pDC是在各個(gè)方面 支持免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞之一。
[0009] 在體液因子例如IFN的活性調(diào)節(jié)中，識(shí)別所述因子的抗體的施用是有效的。例如， 利用抗IL-I或IL-4抗體治療自身免疫疾病的嘗試是實(shí)用的。此外，也類似地對(duì)于IFN，中 和抗體被當(dāng)作自身免疫疾病的治療劑?？深A(yù)期相似的方法對(duì)于IFN生成pDC是有效的。然 而，該樣的方法基于在產(chǎn)生后體液因子的作用的抑制。如果期望的體液因子的產(chǎn)生可被直 接控制，則可獲得進(jìn)一步的基本療效。
[0010] 已報(bào)導(dǎo)了識(shí)別人pDC的抗體。例如，抗-抓CA-2單克隆抗體為人pDC-特異性 單克隆抗體值z(mì)ionek,A.等人 J. Immunol, 165:6037-6046,2000)。已發(fā)現(xiàn)抗-BDCA-2 單 克隆抗體具有抑制人pDC的IFN產(chǎn)生的作用（J. Exp. Med. 194 :1823-1834, 2001)。此外， 還已報(bào)導(dǎo)識(shí)別小鼠干擾素生成細(xì)胞的單克隆抗體抑制干擾素的產(chǎn)生炬Iood 2004化n 1:103/11 :4201-4206. Epub 2003Dec)。還已報(bào)導(dǎo)小鼠pDC的單克隆抗體減少樹突細(xì)胞的數(shù) 目 Q. Immunol. 2003, 171 :6466-6477)。
[0011] 類似地，如果提供可識(shí)別人pDC并且調(diào)節(jié)活性的抗體，則其將是有用的。例如，本 發(fā)明人已顯示識(shí)別Ly49Q的抗體特異性結(jié)合小鼠pDC。然而，Ly49Q的抗體不干擾小鼠pDC 的活性炬Iood, 2005年4月1日，第105卷，第7卷，PP. 2787-2792)。
[0012] PLD是催化磯脂醜膽堿的水解反應(yīng)W產(chǎn)生磯脂酸和膽堿，并且在不同細(xì)胞中引起 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的酶。預(yù)期產(chǎn)生的磯脂酸作為脂質(zhì)信號(hào)分子。
[0013] PLDl和PLD2常規(guī)地已知為兩種類型的哺乳動(dòng)物PLD，并且在其N末端區(qū)域包含 化OX同源結(jié)構(gòu)域（PX結(jié)構(gòu)域）（其可與磯脂醜肌醇醋鍵合）和血小板白細(xì)胞C激酶底物同 源性結(jié)構(gòu)域（pleckstrin homology domain) (PH結(jié)構(gòu)域）。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都參與PLD膜祀向。
[0014] PLDl和PLD2還包含兩個(gè)His-X-Lys-X-X-X-X-Asp序列（H邸基序）。該H邸基序 是PLD活性的必需結(jié)構(gòu)域。
[0015] 已預(yù)期由PLDl和PLD2產(chǎn)生磯脂酸參與細(xì)胞骨架的重構(gòu)、胞吐作用、吞瞻作用、癌 化、細(xì)胞粘附、趨化作用等，并且在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等中起著中樞作用。
[0016] 盡管迄今人化-K4和小鼠SAM9被正式命名為PLD3,但它們?nèi)狈X和PH結(jié)構(gòu)域， 并且未顯示PLD活性，盡管它們具有2個(gè)HKD基序。此外，盡管存在3個(gè)PLD家族成員，即 PLD4、PLD5和PLD6,但該些非經(jīng)典PLD幾乎不為人知。
[0017] 搜索小鼠小腦發(fā)育中的基因表達(dá)模式的小腦發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（CDT-DB)，作 為其結(jié)果，鑒定了 PLD4,其為在發(fā)育時(shí)受控制的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（參見Tao等人，化t. Methods 2巧)，591-598 (2005))。PLD4的基本特征未曾報(bào)導(dǎo)。考慮從現(xiàn)在應(yīng)當(dāng)確定PLD4是否顯示酶 促活性，W及PLD4的去糖基化形式是否具有PLD活性。
[001引 PLD4為由SEQ ID NO ; 1所示的506個(gè)氨基酸的序列（Tao等人，化t. Methods 2(8),591-598(2005)和 Clark 等人，Genome Res. 13 (10) ,2265-2270 (2003))。PLD4 蛋白 具有兩個(gè)假定的PDE區(qū)域（磯酸二醋酶基序）（其由兩個(gè)在C末端區(qū)域中保守的HKD基序 化is-x-Lys-x-x-x-x-Asp的氨基酸序列，其中X為其它氨基酸）構(gòu)成）和假定的磯酸化位 點(diǎn)（T虹472)。PLD4蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為II型單變跨膜蛋白（monotropic transmembrane protein)。此外，PLD4蛋白的N末端區(qū)域不具有PX區(qū)域和PH區(qū)域，所述區(qū)域由為經(jīng)典PLD 家族的PLDl和PLD2所具有（圖1和2)。
[0019] 在另一個(gè)方面，盡管根據(jù)其具有兩個(gè)HKD基序的事實(shí)，PLD4屬于PLD家族，但PLD4 缺乏PX結(jié)構(gòu)域和PH結(jié)構(gòu)域，而是具有替代的假定的跨膜結(jié)構(gòu)域。
[0020] 在優(yōu)選地位于出生后1周的小鼠的脫腑體和白質(zhì)區(qū)（包括小腦白質(zhì)）周圍 的細(xì)胞亞群中發(fā)現(xiàn)了特征性的從低水平至中等水平的PLD4的mRNA表達(dá)。該些表達(dá) PUMmRNA的細(xì)胞已被鑒定為Ibal陽(yáng)性小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（參見Tao等人，化t. Methods 2巧)，591-598(2005))。
[0021] 出生后1周的時(shí)期是當(dāng)髓磯脂形成的活化在小鼠的脫腑體和小腦白質(zhì)中開始時(shí) 的時(shí)期。在該時(shí)期中，PLD4在存在于白質(zhì)中的變形蟲樣（活化狀態(tài)）小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中高 度表達(dá)。根據(jù)該些事實(shí)，預(yù)期了白質(zhì)中的PLD4表達(dá)細(xì)胞在該時(shí)期參與髓磯脂形成的可能 性。特別地，PLD4在吞瞻小泡中的積累變得明顯，并且提出了化D4表達(dá)細(xì)胞參與吞瞻作用 的可能性。從處于活化狀態(tài)的變形蟲樣小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，各種細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子被分泌， 吞瞻作用也被活化。預(yù)期額外的少突膠質(zhì)細(xì)胞（中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其形成 包卷和連接至軸突的髓磯脂）在發(fā)育階段引起腦的白質(zhì)中的細(xì)胞調(diào)亡。已預(yù)期了該樣的可 能性；額外的少突膠質(zhì)細(xì)胞被降解并從變形蟲樣小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被除去W分泌信號(hào)分子， 從而安排在白質(zhì)中髓磯脂形成的環(huán)境。已提出PLD4參與該些過(guò)程，包括髓磯脂形成。
[0022] PUMmRNA表達(dá)也普遍地見于非神經(jīng)組織中，但主要分布在脾中。在脾紅髓的邊緣 帶周圍檢測(cè)到強(qiáng)PLD4表達(dá)，并且從細(xì)胞的膜級(jí)分收集的脾PLD4蛋白被高度N-糖基化。當(dāng) PLD4在異質(zhì)性細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，它們位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中。異源表達(dá)的PLD4未顯示 PLD 酶促活性（Plos ONE WWW. plosone. org, November 2010,第 5 卷，Issue 11, el3932)。
[0023] 根據(jù)在時(shí)間和位置方面受限的PLD4表達(dá)的模式，已提出PLD4在出生后最初階段 的腦發(fā)育時(shí)期在小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或脾邊緣區(qū)的細(xì)胞的共同功能中起作用。
[0024] 上文中已概述了神經(jīng)組織和非神經(jīng)組織中PUMmRNA的表達(dá)和PLD4分布。然而， 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)PUMmRNA W下文中描述的細(xì)胞種類的水平在處于靜止期的pDC(靜息pDC) 中特異性高度表達(dá)。
[00巧]抗全長(zhǎng)人PLD4蛋白的小鼠抗-人PLD4多克隆抗體是商購(gòu)可得的（PLD4純化的 Max化b小鼠多克隆抗體炬Ol巧，目錄號(hào)冊(cè)0122618-B01P，由Abnova Co巧oration生產(chǎn)的）。 然而，一直未獲得僅結(jié)合PLD4的特定位點(diǎn)的單克隆抗體或可特異性結(jié)合PLD4的單克隆抗 體。
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[00測(cè)發(fā)明概述
[0040] 技術(shù)問(wèn)題
[0041] 待由本發(fā)明解決的問(wèn)題是提供結(jié)合PLD4的抗體，和檢測(cè)、鑒定或分離pDC。此外， 待由本發(fā)明解決的問(wèn)題是調(diào)節(jié)PDC的活性。
[004引 問(wèn)題的解決
[0043] 本發(fā)明人通過(guò)PLD4的研究確認(rèn)了 PLD4的表達(dá)在pDC，特別地，除了處于活化期的 PDC W外，處于靜止期的pDC中特異性升高。因此，本發(fā)明人嘗試制備PLD4抗體和闡明其作 用。
[0044] 為了獲得識(shí)別少量來(lái)源于活生物體的蛋白質(zhì)的抗體，通常將通過(guò)基因重組技術(shù)制 備的蛋白質(zhì)用作免疫原。本發(fā)明人嘗試基于已被顯示（化t. Methods 2巧)，591-598 (2005)) 的PUMcDNA的堿基序列和由其編碼的氨基酸序列佑enBank登錄號(hào)NM_138790. 2)的信息 表達(dá)化D4。
[0045] 為了獲得蛋白質(zhì)的抗體，通常嘗試將天然蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列用作免疫原。 然而，為了獲得識(shí)別細(xì)胞表面上的分子的抗體，必需選擇構(gòu)成被抗體識(shí)別為細(xì)胞表面上的 表位的部分的區(qū)域。因此，已預(yù)期使用片段氨基酸序列作為免疫原來(lái)獲得特異于PLD4的抗 體是不現(xiàn)實(shí)的。
[0046] 在該樣的情況下，本發(fā)明人顯示特定免疫原的使用允許獲得結(jié)合pDC的抗體。此 夕F，本發(fā)明人確認(rèn)了所獲得的抗體特異性識(shí)別人PDC，并且還具有調(diào)節(jié)其活性的作用，從而 完成了本發(fā)明。目P，本發(fā)明涉及下文中描述的抗-PLD4抗體、其制備方法及其用途。
[0047] 本發(fā)明如下：
[004引 （1)結(jié)合磯脂酶D4(PLD4)蛋白的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段。
[0049] (2)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū) 中具有作為 CDRl 的序列 SYWMH(SEQ ID NO ;2)、作為 CDR2 的序列 DIYPGSDSTNY肥KFKS(SEQ ID NO ;3) W及作為 CDR3 的序列 GGWLDAMOT(SEQ ID NO ;4)。
[0050] (3)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū) 中具有作為CDRl的序列RAS孤ISNYLN(SEQ ID NO ;5)、作為CDR2的序列YTSRLHS (SEQ ID NO ;6)，W及作為 CDR3 的序列 QQGNTLPW(SEQ ID NO ;7)。
[0051] (4)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū) 中具有作為CDRl的序列SYWMH、作為CDR2的序列DIYPGSDSTNYNEKFKS W及作為CDR3的 序列GGWLDAMDY，和在輕鏈可變區(qū)中具有作為CDRl的序列RAS孤ISNYLN、作為CDR2的序列 YTSRLHS W及作為 CDR3 的序列 QQGNTLPW。
[0052] 妨上述（1)中描述的單克隆抗體（3B4抗體）或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片 段，其在重鏈可變區(qū)中具有作為CDRl的序列TYWMH(SEQ ID N0;8)、作為CDR2的序列 AIYPGNSETSYNQKFKG(SEQ ID N0;9) W及作為 CDR3 的序列 6￥50抑^569 ID N0;10)。
[0053] (6)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū) 中具有作為 CDRl 的序列 HASQGIRSNIG(SEQ ID NO ;11)、作為 CDR2 的序列 HGTNL邸(SEQ ID NO ;12) W及作為 CDR3 的序列 VQYVQFP(SEQ ID NO ;13)。
[0054] (7)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū) 中具有作為CDRl的序列TYWMH、作為CDR2的序列AIYPGNSETSYNQKFKG W及作為CDR3的序 列GYSD抑Y，和在輕鏈可變區(qū)具有作為CDRl的序列HASQGIRSNIG、作為CDR2的序列HGTNL邸 W及作為CDR3的序列VQYVQFP。
[0055] 做上述（I)中描述的單克隆抗體巧B7抗體）或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段， 其在重鏈可變區(qū)中具有作為CDRl的序列DYNLH(SEQ ID N0;14)、作為CDR2的序列 YIYPYNGNTGYNQKFKR(SEQ ID N0;15) W 及作為 CDR3 的序列 GGIY 孤 YYDYAIOT(SEQ ID NO: 16)。
[0056] (9)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū) 中具有作為 CDRl 的序列 RASENIYSHIA(SEQ ID NO ;17)、作為 CDR2 的序列 GATNLAH(SEQ ID NO ;18) W及作為 CDR3 的序列 QHFWGTP(SEQ ID NO ;19)。
[0057] (10)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū) 中具有作為CDRl的序列DYNLH、作為CDR2的序列YIYPYNGNTGYNQKFKR W及作為CDR3的序 列GGIY孤YYDYAIDY，和在輕鏈可變區(qū)中具有作為CDRl的序列RASENIY甜IA、作為CDR2的序 列GATNLAH W及作為CDR3的序列QHFWGTP。
[0058] (11)上述（1)中描述的單克隆抗體巧Cll抗體）或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片 段，其在重鏈可變區(qū)中具有作為CDRl的序列SYYLY(SEQ ID NO ;20)、作為CDR2的序列 LINPTNSDTIF肥KFKS(SEQ ID N0;21) W及作為 CDR3 的序列 EGGYGYGPFAY(SEQ ID N0;22)。
[0059] (12)上述（I)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū) 中具有作為 CDRl 的序列TSSQTLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO ;23)、作為CDR2 的序列KVSNRFS(SEQ ID NO ;24) W及作為 CDR3 的序列 HSTHVP(SEQ ID NO ;2W。
[0060] (13)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū) 中具有作為CDRl的序列SYYLY、作為CDR2的序列LINPTNSDTIFNEKFKS W及作為CDR3的序 列EGGYGYGPFAY，和在輕鏈可變區(qū)具有作為CDRl的序列TSSQTLVHSNGNTYLH、作為CDR2的序 列KVSNRFS W及作為CDR3的序列HSTHVP。
[006。 （14)上述（1)中描述的單克隆抗體（10C3抗體）或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片 段，其在重鏈可變區(qū)中具有作為CDRl的序列SYGMS(SEQ ID N0;26)、作為CDR2的序列 TISSGGSYIYYPESVKG(SEQ ID N0;27) W及作為CDR3 的序列LYGGRRGYGLOT(SEQ ID N0;28)。
[0062] (15)上述（I)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū) 中具有作為CDRl的序列RSSK化L服DGITYLY (SEQ ID NO ;29)、作為CDR2的序列QMSNLAS (SEQ ID NO ;30) W及作為 CDR3 的序列 AQNLEUSEQ ID NO ;31)。
[0063] (16)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū) 中具有作為CDRl的序列SYGMS、作為CDR2的序列TISSGGSYIYYPESVKG W及作為CDR3的序 列LYGGRRGYGLDY，和在輕鏈可變區(qū)具有作為CDRl的序列RSSKSUJ1SDGIITLY、作為CDR2的 序列QMSNLAS W及作為CDR3的序列AQNLEL。
[0064] (17)上述（1)中描述的單克隆抗體（13D4抗體）或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片 段，其在重鏈可變區(qū)中具有作為CDRl的序列甜YYWT(SEQ ID NO ;32)、作為CDR2的序列 YISYDGSNNYNPSLKN(SEQ ID N0;33) W 及作為 CDR3 的序列 EGPLYYGNPYWY 抑 V(SEQ ID NO: 34)。
[0065] (18)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū) 中具有作為 CDRl 的序列 RAS孤IDNYLN(SEQ ID NO ;35)、作為 CDR2 的序列 YTSRLHS (SEQ ID NO ;36) W及作為 CDR3 的序列 QQFNTLP(SEQ ID NO ;37)。
[0066] (19)上述（I)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū) 中具有作為CDRl的序列甜YYWT、作為CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN W及作為CDR3的序 列EGPLYYGNPYWYFDV，和在輕鏈可變區(qū)中具有作為CDRl的序列RAS孤IDNYLN、作為CDR2的 序列YTSRLHS W及作為CDR3的序列QQFNTLP。
[0067] (20)上述（1)中描述的單克隆抗體（13H11)或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段， 其在重鏈可變區(qū)中具有作為CDRl的序列SHYYWS (SEQ ID NO ;38)、作為CDR2的序列 YISYDGSNNYNPSLKN(SEQ ID N0;39) W 及作為 CDR3 的序列 EGPLYYGNPYWY 抑 V(SEQ ID NO: 40)。
[0068] (21)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū) 中具有作為 CDRl 的序列 RAS孤IDNYLN(SEQ ID NO ;41)、作為 CDR2 的序列 YTSRLHS (SEQ ID NO ;42) W及作為 CDR3 的序列 QQFNTLP(SEQ ID NO ;43)。
[0069] (22)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū) 中具有作為CDRl的序列甜YYWS、作為CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN W及作為CDR3的序 列EGPLYYGNPYWYFDV，和在輕鏈可變區(qū)具有作為CDRl的序列RAS孤IDNYLN、作為CDR2的序 列YTSRL服W及作為CDR3的序列QQFNTLP。
[0070] (23)通過(guò)在登錄號(hào)；NITE BP-1211、肌TE BP-1212、NITE BP-1213 和 NITE BP-1214 下保藏的雜交瘤mp5B7、mp7B4、mpl3D4和mpl3化1之任一產(chǎn)生的單克隆抗體或包含其抗原 結(jié)合區(qū)的片段。
[0071] (24)產(chǎn)生上述（1)或（2)中描述的單克隆抗體之任一的雜交瘤。
[0072] (25)在登錄號(hào)；NITE BP-121UNITE BP-1212、NITE BP-1213 或 NITE BP-1214 下 保藏的雜交瘤 mp5B7, mp7B4, mpl3D4 或 mpl3Hll。
[0073] (26)制備單克隆抗體的方法，包括培養(yǎng)上述（25)中描述的雜交瘤和從培養(yǎng)物收 集單克隆抗體的過(guò)程。
[0074] (27)制備產(chǎn)生結(jié)合PLD4的單克隆抗體的細(xì)胞的方法，包括下列過(guò)程：
[00巧]1)給免疫動(dòng)物施用編碼包含PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的重組PUM-Ig融 合蛋白的過(guò)程，和
[0076] 2)從免疫動(dòng)物的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞選擇產(chǎn)生結(jié)合PLD4的抗體的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的 過(guò)程。
[0077] (28)上述（27)中描述的方法，其中表達(dá)PLD4的細(xì)胞是W可表達(dá)的方式保留編碼 包含PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的外源性多核巧酸的細(xì)胞。
[007引 （29)上述（28)中描述的方法，其中細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞。
[0079] (30)上述（29)中描述的方法，其中細(xì)胞為人來(lái)源的細(xì)胞。
[0080] (31)上述（30)中描述的方法，其中人來(lái)源的細(xì)胞為肥K-293T細(xì)胞。
[0081] (32)上述（27)至（31)的任一項(xiàng)中描述的方法，包括遞增地克隆獲得的抗體產(chǎn)生 性細(xì)胞的過(guò)程。
[0082] (33)制備結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體的方法，包括培養(yǎng)通過(guò)上述（29) 中描述的方法獲得的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞和從培養(yǎng)物收集單克隆抗體的過(guò)程。
[0083] (34)識(shí)別PLD4的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其可通過(guò)下列過(guò)程獲 得：
[0084] I)給免疫動(dòng)物施用編碼包含PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的重組PLD4-Ig融 合蛋白的過(guò)程，
[0085] 2)從免疫動(dòng)物的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞選擇產(chǎn)生結(jié)合PLD4的抗體的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的 過(guò)程，和
[0086] 3)培養(yǎng)過(guò)程2)中選擇的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞，和從培養(yǎng)物收集識(shí)別PLD4的抗體的過(guò) 程。
[0087] 做）用于制備結(jié)合PLD4的抗體的免疫原，其包含（a) W可表達(dá)的方式外源性地保 留編碼包含PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的多核巧酸的動(dòng)物細(xì)胞，或其細(xì)胞膜級(jí)分。
[0088] (36)上述（35)中描述的免疫原，其中動(dòng)物細(xì)胞為人來(lái)源的細(xì)胞。
[0089] (37)檢測(cè)漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的方法，包括將結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗 體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段與測(cè)試細(xì)胞接觸，隨后檢測(cè)結(jié)合細(xì)胞的單克隆抗體或包含其 抗原結(jié)合區(qū)的片段的過(guò)程。
[0090] (38)用于檢測(cè)漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的試劑，其包含結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克 隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段。
[0091] (39)抑制漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性的方法，包括將下述組分的任一種與漿細(xì)胞樣 樹突細(xì)胞接觸的過(guò)程：
[0092] (a)結(jié)合PLD4并抑制漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性的單克隆抗體，或包含其抗原結(jié)合 區(qū)的片段，和
[0093] 化）免疫球蛋白或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了單克 隆抗體（a)的互補(bǔ)決定區(qū)。
[0094] (40)抑制活生物體的漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性的方法，包括給活生物體施用下述 組分的任一種的過(guò)程：
[0095] (a)結(jié)合PLD4并抑制漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性的單克隆抗體，或包含其抗原結(jié)合 區(qū)的片段，和
[0096] 化）免疫球蛋白或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了單克 隆抗體（a)的互補(bǔ)決定區(qū)。
[0097] (41)上述（39)或（40)中描述的方法，其中漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性是干擾素生 成活性和干擾素生成細(xì)胞的存活之一，或其兩者。
[0098] (42)用于抑制漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性的試劑，其包含下述組分的任一種作為活 性組分：
[0099] (a)結(jié)合PLD4并抑制漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性的單克隆抗體，或包含其抗原結(jié)合 區(qū)的片段，和
[0100] 化）免疫球蛋白或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了單克 隆抗體（a)的互補(bǔ)決定區(qū)。
[0101] (43)上述（42)中描述的用于抑制干擾素生成細(xì)胞的活性的試劑，其中漿細(xì)胞樣 樹突細(xì)胞的活性是干擾素生成活性和干擾素生成細(xì)胞的存活的任一種，或其兩者。
[0102] 本發(fā)明的作用
[0103] 本發(fā)明提供了特異性識(shí)別PLD4的抗體、在抗體的制備中有用的免疫W及使用免 疫原制備抗-PLD4抗體的方法。PLD4是屬于PLD4家族的膜蛋白。本發(fā)明人顯示特異性識(shí) 別PLD4的抗體可容易地獲得。可通過(guò)本發(fā)明獲得的抗-PLD4抗體是具有高度特異性的抗 體，其可區(qū)分人pDC與表達(dá)其它PLD家族的細(xì)胞。
[0104] 在優(yōu)選方面，由本發(fā)明提供的抗-PLD4抗體結(jié)合人pDC。此外，本發(fā)明的抗體特異 性識(shí)別人pDC。因此，本發(fā)明的抗體對(duì)于pDC的檢測(cè)或分離是有用的。pDC是產(chǎn)生大部分I 型IFN的細(xì)胞。因此，該樣的檢測(cè)或分離在與pDC相關(guān)的疾病例如自身免疫疾病的診斷或 研究中是非常重要的。
[0105] 此外，在優(yōu)選方面，由本發(fā)明提供的抗-PLD4抗體具有調(diào)節(jié)人pDC活性的作用。因 此，本發(fā)明的抗-PLD4抗體可用于抑制pDC活性。因此，如果使用本發(fā)明的抗體來(lái)進(jìn)行pDC 活性的抑制，則可預(yù)期對(duì)于其中IFNa表達(dá)已上升的自身免疫疾病的患者的治療作用。
[0106] pDC在少量細(xì)胞中產(chǎn)生大量IFN。在IFN的中和中，抗體是必需的，該取決于IFN 分子的數(shù)目。然而，在本發(fā)明中，生產(chǎn)細(xì)胞的活性被直接抑制。作為其結(jié)果，相較于抗-IFN 抗體的中和，使用更少量的抗體可預(yù)期強(qiáng)有力的IFN抑制作用。此外，在其中連續(xù)產(chǎn)生IFN 的情況下，預(yù)期通過(guò)IFN抗體的中和將仍然為瞬時(shí)抑制。然而，在本發(fā)明，pDC活性被抑制， 并且據(jù)此，可預(yù)期在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的IFN生成抑制作用。
[0107] 附圖概述
[010引圖1是舉例說(shuō)明人PLD4(C14或fl75)蛋白的氨基酸序列巧06個(gè)殘基）的圖表。 可預(yù)見的是來(lái)自N末端的第31至第53殘基是跨膜結(jié)構(gòu)域，如使用"S0SUI程序(http:// bp. nuap. nagova-u. ac. jp/sosui/sosui submit, html)"分析的,該程序是針對(duì)跨膜區(qū)域的 預(yù)測(cè)系統(tǒng)。第54至第506殘基包含兩個(gè)磯酸二醋酶基序，該蛋白被預(yù)測(cè)為II型跨膜蛋白：
[0109] 圖2是代表人PLD4蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的示意圖。結(jié)構(gòu)在氨基酸506個(gè)殘基中具有 2個(gè)服D OlxKxxxxD)基序，蘇氨酸殘基472可能是磯酸化位點(diǎn)：
[0110] 圖3是舉例說(shuō)明人PLD4蛋白與異種動(dòng)物的同源分子種類的同源性的圖表。PLD4 蛋白在從小鼠至人的進(jìn)化過(guò)程中是保守的：
[0111] 圖4是舉例說(shuō)明與人PLD4蛋白家族的同源性（旁系同源物）的圖表：
[0112] 圖5是舉例說(shuō)明PLD4基因在負(fù)責(zé)人免疫的細(xì)胞中的人pDC-特異性表達(dá)的圖表。 PLD4基因在處于靜止期的pDC中高表達(dá)，在CD19+B細(xì)胞中低表達(dá)：
[0113] 圖6是舉例說(shuō)明人PUMmRNA的組織表達(dá)模式的圖表。其在脾和外周血白細(xì)胞中 高表達(dá)：
[0114] 圖7是舉例說(shuō)明重組人PUM-Ig融合蛋白的結(jié)構(gòu)的示意圖。通過(guò)PCR擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于 人PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域巧6-506氨基酸）的CDNA片段。將該片段插入在N末端包含小鼠 IgK前導(dǎo)區(qū)段和小鼠IgG2a重鏈恒定化區(qū)域（較鏈+C肥+C冊(cè)）的N-Flag PCDNA3. 1表達(dá) 載體的BamHI-EcoRI克隆位點(diǎn)。用質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清液：
[0115] 圖8是舉例說(shuō)明對(duì)人PLD4的結(jié)合特異性的FACS分析圖。mpllG9. 6和chllG9. 6 抗體特異性識(shí)別人PLD4,但不識(shí)別人PLD3-293T或PLD5-293T轉(zhuǎn)染子：
[0116] 圖9是舉例說(shuō)明與食蟹猴PLD4的交叉反應(yīng)性的FACS分析圖。mpllG9.6和 chllG9. 6抗體能夠識(shí)別293T轉(zhuǎn)染子上的食蟹猴PLD4:
[0117] 圖10是舉例說(shuō)明人PBMC的mpllG9.6抗體的染色的FACS測(cè)量圖。mpllG9.6抗體 強(qiáng)有力地識(shí)別人PBMC中的抓CA2+PDC:
[0118] 圖11是舉例說(shuō)明CAL-I細(xì)胞的純化的抗-PLD4抗體的染色的FACS分析圖：
[0119] 圖12是舉例說(shuō)明人PLD4-CT125穩(wěn)定細(xì)胞株的抗-PLD4抗體的染色的FACS分析 圖：
[0120] 圖13是舉例說(shuō)明人PBMC的抗-PLD4抗體的染色的FACS分析圖。所有抗-PLD4 抗體能夠識(shí)別人PBMC中的抓CA2+PDC:
[0121] 圖14是表示人PLD、食蟹猴PLD4、恒河猴PLD4和小鼠PLD4的蛋白的多重比對(duì)和 同源性的圖表：
[0122] 圖15是舉例說(shuō)明采用Flag標(biāo)記的食蟹猴PLD4表達(dá)載體至人PLD4-293T細(xì)胞的瞬 時(shí)基因引入的抗-PLD4抗體的染色的FACS分析圖。通過(guò)抗-Flag抗體確認(rèn)了食蟹猴PLD4 蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)：
[0123] 圖16是舉例說(shuō)明食蟹猴PLD4-CT125細(xì)胞的抗-PLD4抗體的染色的FACS測(cè)量圖。 在抗-PLD4抗體當(dāng)中，7種（384、587、784、1304、13化1、14(：1和1169.6)抗體可結(jié)合食蟹猴 PLD4-CT125穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子：
[0124] 圖17是舉例說(shuō)明采用Flag標(biāo)記的恒河猴PLD4表達(dá)載體至人PLD4-293T細(xì)胞內(nèi) 的瞬時(shí)基因引入的抗-PLD4抗體的染色的FACS分析圖。通過(guò)抗-Flag抗體確認(rèn)了恒河猴 PLD4蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)：
[0125] 圖18-1和圖18-2是舉例說(shuō)明恒河猴PBMC的抗-PLD4抗體的染色的FACS分析圖。 在抗-PLD4抗體當(dāng)中，5種（5B7、7B4、13D4、13H11和14C1)抗體特異性結(jié)合恒河猴PBMC中 的食蟹猴的pDC細(xì)胞群（譜系-CD123+HLA-DR+):
[0126] 圖19是舉例說(shuō)明針對(duì)人PLD4-CT125穩(wěn)定細(xì)胞株的抗-PLD4抗體的解離常數(shù)摩爾 濃度（nM單位，Kd值）的圖：
[0127] 圖20是舉例說(shuō)明10種類型的抗-PLD4抗體的CDC活性的圖。祀細(xì)胞：人 PLD4-CT125(小鼠2B4T細(xì)胞淋己細(xì)胞）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子抗體濃度；10y g/mL效應(yīng)子；1%未成熟 家兔補(bǔ)體：
[0128] 圖21是舉例說(shuō)明抗-PLD4抗體（mpllG9. 6抗體和chllG9. 6抗體）的CDC活性的 圖。祀細(xì)胞：人PLD4-CT125(小鼠2B4T細(xì)胞淋己細(xì)胞）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子抗體濃度；0. 1 y g/mL 至30 y g/mL效應(yīng)子；1 %未成熟家兔補(bǔ)體：
[0129] 圖22是舉例說(shuō)明抗-PLD4嵌合抗體的ADCC活性的圖。祀細(xì)胞：人PLD4-C冊(cè)穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染子抗體濃度；IOy g/mL:
[0130] 圖23是舉例說(shuō)明從3個(gè)健康個(gè)體分離的人PBMC中抗-PLD4嵌合抗體（chi 1G9. 6) 的處理對(duì)IFN-a分泌的抑制的測(cè)量（利用ELISA)的圖：和
[0131] 圖24是舉例說(shuō)明在利用抗-PLD4嵌合抗體的處理后人pDC丟失的圖。
[0132] 圖25是利用抗人原代pDC的嵌合抗-PUMAb的ADCC測(cè)定的結(jié)果。
[0133] 圖26是在嵌合抗-PUMAb存在的情況下通過(guò)CpG2216誘導(dǎo)的來(lái)自PBMC的IFN a 產(chǎn)生。
[0134] 用于進(jìn)行本發(fā)明的模式
[01巧]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)PLD4是在處于靜止期的漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞（靜息pDC)中在mRNA 水平和蛋白質(zhì)水平上特異性表達(dá)的分子。未建立制備識(shí)別PLD4的抗體的方法。
[0136] 有報(bào)導(dǎo)認(rèn)為小鼠PLD4是在出生后的最初階段的小腦或脫腑體中的處于發(fā)育期的 變形蟲樣（活化狀態(tài)）小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的分子。然而，人PLD4的表達(dá)直至現(xiàn)在還不 清楚。具體地，直至現(xiàn)在仍未報(bào)道人PLD4在免疫系統(tǒng)中的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)定位、結(jié)構(gòu)、功能等。 本發(fā)明確認(rèn)直至現(xiàn)在被認(rèn)為僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的人PLD4是在人漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞（pDC) 中表達(dá)為II型跨膜蛋白的細(xì)胞表面標(biāo)志物。因此，PLD4抗體對(duì)pDC的結(jié)合成為可能，并且 已證明PLD4抗體可用作意欲調(diào)節(jié)B細(xì)胞和pDC細(xì)胞的功能的治療性抗體的分子祀。
[0137] 本發(fā)明人通過(guò)基因表達(dá)分析確認(rèn)了 PLD4在人pDC中特異性表達(dá)。可W預(yù)見的是 如果獲得可在免疫學(xué)上區(qū)分PLD4與其它分子的抗體，則其可用于pDC研究。然而，在包含 PLD4的PLD家族中存在許多分子，其在結(jié)構(gòu)上彼此十分相似。分子例如PLD1，PLD2, PLD3和 PLD5,包括作為PLD4的PLD，包含具有特別高的同源性的氨基酸序列（圖4)。因此，可W預(yù) 見的是使用利用構(gòu)成PLD4(或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域）的氨基酸序列（部分序列）的膚的免疫原難 W獲得彼此區(qū)分該些分子的抗體。因此，本發(fā)明人嘗試使用重組PUM-Ig融合蛋白作為免 疫原來(lái)獲得抗PLD4的抗體，所述重組PUM-Ig融合蛋白編碼包含PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨 基酸序列。
[013引本發(fā)明人重復(fù)研究W獲得識(shí)別PLD4的抗體，并顯示使用重組PUM-Ig融合蛋白作 為免疫原獲得期望的抗體，并且完成了本發(fā)明。也就是說(shuō)，本發(fā)明涉及結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié) 構(gòu)域的單克隆抗體，或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段。
[0139] 在本發(fā)明中，PLD4是在人pDC中表達(dá)的天然分子，或在免疫學(xué)上與在人pDC中表 達(dá)的PLD4等同的分子。在本發(fā)明中，可確認(rèn)抗體對(duì)PLD4的結(jié)合，例如，如下文中描述的。
[0140] ?基于與人細(xì)胞的反應(yīng)性的確認(rèn)：
[0141] 根據(jù)本發(fā)明人獲得的發(fā)現(xiàn)，可W預(yù)見的是根據(jù)其在人pDC中顯示特異性表達(dá)的事 實(shí)，PLD4可用作pDC標(biāo)志物。
[014引基于PLD4的該樣的表達(dá)特征譜，與pDC的至少部分亞組的結(jié)合活性是本發(fā)明中結(jié) 合PLD4的抗體的重要特征之一。一些細(xì)胞是pDC的事實(shí)可通過(guò)每一個(gè)細(xì)胞家族中固有的 細(xì)胞表面標(biāo)志物來(lái)確定。例如，對(duì)期望的細(xì)胞的結(jié)合通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體和結(jié) 合活性待確認(rèn)的抗體的雙重染色來(lái)確認(rèn)。也就是說(shuō)，本發(fā)明中的pDC包括表達(dá)例如抓CA2 的細(xì)胞。
[0143] ?基于與表達(dá)PLD4基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的反應(yīng)性的確認(rèn)：
[0144] 本發(fā)明人確認(rèn)了當(dāng)在某些條件下表達(dá)PLD4基因時(shí)在人pDC中表達(dá)的PLD4的免疫 學(xué)特征被重建。因此，與PLD4的反應(yīng)性還可基于抗體對(duì)于其中已人工地引入了編碼PLD4 的基因的細(xì)胞的反應(yīng)性來(lái)確認(rèn)。也就是說(shuō)，本發(fā)明涉及單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的 片段，所述抗體結(jié)合包含構(gòu)成PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列作為細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的分子。 同時(shí)，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域由對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的從SEQ ID NO 1(圖1)的 N末端開始的54至506的氨基酸序列構(gòu)成。
[0145] 例如，在用包含編碼PLD4的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，在人pDC中表達(dá)的 PLD4的免疫學(xué)特征得W維持。因此，表達(dá)PLD4的轉(zhuǎn)化細(xì)胞優(yōu)選作為用于在本發(fā)明中確認(rèn)抗 體對(duì)PLD4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性的細(xì)胞。當(dāng)在本發(fā)明中通過(guò)轉(zhuǎn)化細(xì)胞確認(rèn)抗體的反 應(yīng)性時(shí)，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞被期望地用作對(duì)照。
[0146] 隨后，本發(fā)明中結(jié)合PLD4的抗體可W是顯示與已知表達(dá)除PLD4外的PLD家族的 細(xì)胞家族的交叉性質(zhì)的抗體，或可W是不顯示該樣的交叉性質(zhì)的抗體。未顯示交叉性質(zhì)的 抗體優(yōu)選作為本發(fā)明中結(jié)合PLD4的抗體。具體地，本發(fā)明中結(jié)合PLD4的抗體優(yōu)選為該樣 的抗體，在與其中對(duì)pDC的結(jié)合被確認(rèn)的條件相同的條件下，可能不能確認(rèn)所述抗體與已 知表達(dá)除PLD4外的PLD家族的細(xì)胞家族的結(jié)合。
[0147] 也就是說(shuō)，本發(fā)明中結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體優(yōu)選包括具有下述免 疫學(xué)特征的單克隆抗體。
[0148] a)結(jié)合人 pDC，
[0149] b)在允許結(jié)合人pDC的條件下，可能不能確認(rèn)對(duì)選自單核細(xì)胞、巨瞻細(xì)胞、CD34陽(yáng) 性細(xì)胞和來(lái)源于該些細(xì)胞的樹突細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)種類的細(xì)胞的結(jié)合。
[0150] 具體地，本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選為該樣的抗體，在允許結(jié)合人pDC的條件下，可 能不能確認(rèn)所述抗體對(duì)單核細(xì)胞、巨瞻細(xì)胞、B細(xì)胞、CD34陽(yáng)性細(xì)胞和來(lái)源于該些細(xì)胞的樹 突細(xì)胞的結(jié)合。
[0151] 或者，本發(fā)明中結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體優(yōu)選包括具有下述免疫學(xué) 特征的單克隆抗體。
[015引 C)對(duì)利用W可表達(dá)的方式保留編碼PLD4的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的結(jié) 厶 I=I ?
[0153] d)在允許結(jié)合轉(zhuǎn)化細(xì)胞C)的條件下，可能不能確認(rèn)與被轉(zhuǎn)化前的C)的宿主細(xì)胞 的結(jié)合。
[0154] 本發(fā)明中抗-PLD4單克隆抗體不與PLD家族的其它分子交叉反應(yīng)的事實(shí)，可通過(guò) 使用其中每一個(gè)PLD家族被強(qiáng)制表達(dá)的細(xì)胞來(lái)確認(rèn)。也就是說(shuō)，通過(guò)將編碼每一個(gè)PLD家 族的氨基酸序列的CDNA引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞來(lái)進(jìn)行強(qiáng)制表達(dá)。將獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞與交叉 性質(zhì)待確認(rèn)的抗-PLD4單克隆抗體接觸。如果未顯示對(duì)表達(dá)除PLD4外的PLD家族分子的 細(xì)胞的結(jié)合，則可確認(rèn)抗體可在免疫學(xué)上區(qū)分PLD4與其它PLD家族分子。例如，在下文中 描述的實(shí)例中確認(rèn)了大多數(shù)通過(guò)本發(fā)明獲得的抗-PLD4單克隆抗體不與與PLD4具有特別 高的同源性的PLD3和PLD5 W及另外的PLDl和PLD2交叉反應(yīng)。因此，本發(fā)明中的單克隆 抗體優(yōu)選為結(jié)合PLD4但可能不能檢測(cè)到其在相同條件下對(duì)PLD3, PLD5, PLDl或PLD2的結(jié) 合的單克隆抗體。如果使用可在免疫學(xué)上區(qū)分該些PLD家族分子與PLD4的抗體，則可特異 性地檢測(cè)PLD4表達(dá)的變化。
[0155] 可W例如根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)原理來(lái)確認(rèn)結(jié)合活性待確認(rèn)的單克隆抗體對(duì)每一個(gè)種 類的細(xì)胞的結(jié)合。為了通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)原理確認(rèn)抗體的反應(yīng)性，用產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的分子 或原子團(tuán)標(biāo)記抗體是有利的。一般地，使用英光標(biāo)記或發(fā)光標(biāo)記。為了通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)的原 理分析英光標(biāo)記抗體對(duì)細(xì)胞的結(jié)合，可使用英光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS)。通過(guò)使用FACS， 可有效地確認(rèn)抗體對(duì)細(xì)胞的多重結(jié)合。
[0156] 具體地，例如，將最初已知能夠鑒定pDC的抗體A和待分析對(duì)pDC的結(jié)合特征的抗 體B同時(shí)與包括pDC的細(xì)胞家族反應(yīng)?？贵wA和抗體B已用可彼此區(qū)分它們的英光信號(hào)進(jìn) 行了標(biāo)記。如果從相同細(xì)胞家族檢測(cè)到兩種信號(hào)，則可確認(rèn)該樣的抗體結(jié)合相同細(xì)胞家族。 也就是說(shuō)，發(fā)現(xiàn)抗體A和抗體B具有相同結(jié)合特征。如果抗體A和抗體B結(jié)合不同的細(xì)胞 家族，則很明顯它們的結(jié)合特征彼此不同。
[0157] 本發(fā)明的優(yōu)選單克隆抗體的實(shí)例包括例如由雜交瘤mp5B7、mp7B4、mp 13D4和 mpl3化1產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0巧引 雜交瘤111口587、111口784、111口1304和111口13化1于2012年1月27日在登錄號(hào)；化1￡ BP-1211、NITE BP-1212、NITE BP-1213和NITE BP-1214下被保藏于獨(dú)立行政法人制品評(píng) 價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中也（NITC)。下面將描述詳細(xì)說(shuō)明保藏的內(nèi)容。
[0159] (1)保藏機(jī)構(gòu)的名稱和地址
[0160] 名稱；獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中也（WTC)
[0161]地址；2-5-8Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Qiiba-ken, 292-0818JAPAN
[0162] (2)保藏日期：2012年I月27日
[0163] (3)登錄號(hào) NITE BP-1211 (雜交瘤 mp5B7)
[0164] NITE BP-1212 (雜交瘤 mp7B4)
[0165] WTE BP-1213 (雜交瘤 mpl3D4)
[0166] WTE BP-1214(雜交瘤 mpl3Hll)
[0167] 本發(fā)明的單克隆抗體可W是包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段。例如，通過(guò)IgG酶促消化 產(chǎn)生的包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段可在本發(fā)明中用作抗體。具體地，通過(guò)用木瓜蛋白酶 或胃蛋白酶進(jìn)行消化，可獲得抗體片段例如F油或F(油'）2。此外，包含其中植入某一單克 隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)的可變區(qū)的免疫球蛋白片段包括在包含抗原結(jié)合區(qū)的片段中。 眾所周知，該些抗體片段可用作對(duì)抗原具有結(jié)合親和力的抗體分子?；蛘撸墒褂猛ㄟ^(guò)基因 重組構(gòu)建的抗體，只要其維持抗原結(jié)合所必需的活性。通過(guò)基因重組構(gòu)建的抗體的實(shí)例包 括，例如，嵌合抗體、CDR移植抗體、單鏈Fv、雙特異性抗體（雙體）、線性抗體和通過(guò)抗體片 段形成的多特異性抗體等?；趩慰寺】贵w獲得該樣的抗體的方法或產(chǎn)生其的抗體產(chǎn)生性 細(xì)胞是已知的。
[0168] 本發(fā)明的單克隆抗體可通過(guò)使用重組PUM-Ig融合蛋白或表達(dá)人PLD4的轉(zhuǎn)化細(xì) 胞作為免疫原來(lái)獲得。目P，本發(fā)明涉及制備產(chǎn)生結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體的細(xì) 胞的方法，所述方法包括下列過(guò)程。
[0169] (1)給免疫動(dòng)物施用包含PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的外源蛋白的過(guò)程，和
[0170] (2)從免疫動(dòng)物的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞選擇產(chǎn)生結(jié)合PLD4的抗體的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞 的過(guò)程。
[0171] 可培養(yǎng)該樣獲得的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞或抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的永生化細(xì)胞，可從培養(yǎng)物 收集期望的單克隆抗體。已知多種方法為用于永生化抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的方法。
[0172] 可W例如通過(guò)制備其中W可表達(dá)的方式保留下文描述的編碼包含PLD4細(xì)胞外結(jié) 構(gòu)域的氨基酸序列的外源性多核巧酸（a)的細(xì)胞，來(lái)獲得在本發(fā)明中用作免疫原的轉(zhuǎn)化細(xì) 胞。
[0173] 本發(fā)明中的外源性多核巧酸是指通過(guò)人工引入宿主細(xì)胞的多核巧酸。在其中人細(xì) 胞用作細(xì)胞的情況下，將人基因引入人細(xì)胞。在該樣的組合中，人工引入的多核巧酸也稱為 外源性多核巧酸。因此，PLD4的異位表達(dá)包括在外源性多核巧酸表達(dá)中。
[0174] 本發(fā)明的PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域是指對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1中所述的氨基酸序列的細(xì) 胞外結(jié)構(gòu)域的位置54-506的氨基酸序列。例如，按下列順序從N末端側(cè)包含每一個(gè)區(qū)域的 氨基酸序列優(yōu)選在本發(fā)明中作為包含PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
[0175] [細(xì)胞內(nèi)區(qū)域+跨膜結(jié)構(gòu)域+細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域]
[0176] 或者，如下描述的部分缺乏細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的氨基酸序列也包括在本發(fā)明的包含PLD4 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中。
[0177] [部分細(xì)胞內(nèi)區(qū)域+跨膜結(jié)構(gòu)域+細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域]
[0178] 此外，如下描述的缺乏細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的結(jié)構(gòu)包括在本發(fā)明的包含PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域的氨基酸序列中。
[0179] [跨膜結(jié)構(gòu)域+細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域]
[0180] 上述結(jié)構(gòu)中除細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域外的其它區(qū)域可W是選自由SEQ ID NO 1所示的氨基 酸序列的序列，或可W是與另一個(gè)同源氨基酸序列的組合。例如，構(gòu)成信號(hào)序列、跨膜結(jié)構(gòu) 域和細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的氨基酸序列可用作除PLD4外的PLD家族分子的氨基酸序列?；蛘?，還可 組合除人外的其它物種的PLD家族的氨基酸序列。此外，構(gòu)成除細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域外的其它區(qū) 域的氨基酸序列可在其中可維持區(qū)域的每一個(gè)功能的范圍內(nèi)包含突變。此外，可將其它區(qū) 域插在所述區(qū)域的每一個(gè)區(qū)域之間。例如，在信號(hào)序列與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域之間，還可插入表位 標(biāo)記例如FLAG。具體地，信號(hào)序列是在蛋白質(zhì)翻譯后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜的步驟中經(jīng)歷加工，隨后 除去的區(qū)域。因此，誘導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)穿過(guò)細(xì)胞膜的任意氨基酸序列可用作信號(hào)序列。更 具體地，PLD4的氨基酸序列（SEQ ID NO 1)優(yōu)選作為包含PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序 列。
[0181] 因此，本發(fā)明的上述多核巧酸（a)可W是編碼構(gòu)成上述結(jié)構(gòu)[細(xì)胞內(nèi)區(qū)域+跨膜 結(jié)構(gòu)域+細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域]的氨基酸序列的任意堿基序列。例如，SEQ ID NO 1的氨基酸序 列由SEQ ID NO 44中描述的cDNA堿基序列編碼。
[0182] 作為本發(fā)明的免疫原的重組PUM-Ig融合蛋白可通過(guò)將W可表達(dá)的方式保留上 述多核巧酸的表達(dá)載體引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞來(lái)獲得。重組PUM-Ig融合蛋白的CDNA堿基 序列由SEQ ID NO 125表示，氨基酸序列由SEQ ID NO 126表示。
[0183] 本發(fā)明的宿主細(xì)胞優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。具體地，來(lái)源于人、猴、小鼠或大鼠的 細(xì)胞可用作宿主細(xì)胞。具體地，人來(lái)源的細(xì)胞優(yōu)選作為宿主細(xì)胞。例如，肥K-293T細(xì)胞為 可優(yōu)選在本發(fā)明中用作宿主細(xì)胞的人胚胎來(lái)源的腎細(xì)胞株。肥K-293T細(xì)胞可作為ATCC 邸L-11268來(lái)獲得。除此W外，來(lái)源于免疫動(dòng)物的細(xì)胞可用作宿主細(xì)胞。如果來(lái)源于免疫動(dòng) 物的細(xì)胞用作免疫原，針對(duì)宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)是小的。因此，可有效地獲得外源性地表達(dá) 的抗PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體。因此，例如，當(dāng)小鼠用作免疫動(dòng)物時(shí)，來(lái)源于小鼠的細(xì)胞也 可用作巧王細(xì)胞。
[0184] 可將上述多核巧酸加載至可在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)的載體，W轉(zhuǎn)化細(xì)胞?？墒褂?可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)的商購(gòu)可得的載體。例如，表達(dá)載體例如pCMV-Script (R)載 體、pSG5 載體（由 Stratagene 生產(chǎn)的）、pcDNA3. 1 (由 Invitrogen 生產(chǎn)的）、pMXs-IP 逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體（由Cell Bi化油S生產(chǎn)的）等可用于本發(fā)明。
[0185] 將該樣獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞與另外的組分例如佐劑（必要時(shí)）一起給免疫動(dòng)物施 用。作為佐劑，可使用弗氏完全佐劑等。在其中小鼠用作免疫動(dòng)物的情況下，將純化的重組 PUM-Ig融合蛋白給BALB/c小鼠施用。作為佐劑，使用完全和不完全弗氏佐劑（由SIGMA 生產(chǎn)的），在第一次W 200 y g/小鼠施用，在第二次至第四次W 50 y g/小鼠施用。通常地， 間隔性地多次施用免疫原，直至抗體滴度增加。例如，在短時(shí)間免疫法的情況下，W 2至4 天，更具體地3天的間隔施用轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在施用2至3次后，收集抗體產(chǎn)生性細(xì)胞。此外，還 可在W每周約1次的間隔施用5至6次后收集抗體產(chǎn)生性細(xì)胞。
[0186] 為了獲得本發(fā)明的單克隆抗體，克隆收集的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞。為了進(jìn)行克隆， 優(yōu)選使抗體產(chǎn)生性細(xì)胞永生化。例如，可將W雜交瘤法為代表的細(xì)胞融合法或通過(guò) Epstein-Barr病毒巧BV)進(jìn)行的轉(zhuǎn)化用作永生化抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的方法。
[0187] 抗體產(chǎn)生性細(xì)胞每一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生一種抗體。因此，如果可建立來(lái)源于一個(gè)細(xì)胞的 細(xì)胞群（也就是說(shuō)，克隆），則可獲得單克隆抗體。雜交瘤法是指其中將抗體產(chǎn)生性細(xì)胞與 適當(dāng)?shù)募?xì)胞株融合、永生化，隨后克隆的方法。永生化的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞可通過(guò)方法例如有 限稀釋法來(lái)克隆。許多用于雜交瘤法的細(xì)胞株是已知的。該些細(xì)胞株在基于淋己細(xì)胞的細(xì) 胞的永生化效率上是優(yōu)秀的，并且具有選擇細(xì)胞融合已獲成功的細(xì)胞所必需的各種基因標(biāo) 志物。此外，在其中期望獲得抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的情況下，還可使用缺乏抗體產(chǎn)生能力的細(xì)胞 株。
[0188] 例如，小鼠骨髓瘤 P3x63A妍.653(ATCC C化-1580)或 P3x63A妍U. !(ATCC 0?L-1597)普遍用作用于小鼠或大鼠的細(xì)胞融合法的有用細(xì)胞株。一般而言，雜交瘤通過(guò)同 種的細(xì)胞的融合來(lái)制備。然而，還可從近緣的異種物種之間的異種雜交瘤獲得單克隆抗體。
[0189] 細(xì)胞融合的具體方案是已知的。也就是說(shuō)，將免疫動(dòng)物的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞與適當(dāng) 的融合伴侶混合，和經(jīng)歷細(xì)胞融合。作為抗體產(chǎn)生性細(xì)胞，可使用脾細(xì)胞、從淋己結(jié)收集的 淋己細(xì)胞、外周血B細(xì)胞等。作為融合伴侶，可使用上述各種細(xì)胞株。對(duì)于細(xì)胞融合，使用 聚己二醇法或電融合法。
[0190] 隨后，基于融合細(xì)胞具有的選擇標(biāo)志物選擇細(xì)胞融合已獲成功能的細(xì)胞。例如，在 其中將HAT敏感性細(xì)胞株用于細(xì)胞融合的情況下，通過(guò)選擇在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞來(lái) 選擇細(xì)胞融合已獲成功的細(xì)胞。此外，確認(rèn)由選擇的細(xì)胞產(chǎn)生的抗體是否具有期望的反應(yīng) 性。
[0191] 基于抗體的反應(yīng)性篩選每一個(gè)雜交瘤。也就是說(shuō)，通過(guò)上述方法選擇產(chǎn)生結(jié)合 PLD4的抗體的雜交瘤。優(yōu)選，在其中亞克隆選擇的雜交瘤并且期望的抗體的產(chǎn)生最終被確 認(rèn)的情況下，將雜交瘤選擇作為產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤。
[0192] 具體地，可基于與人細(xì)胞的反應(yīng)性或與表達(dá)PLD4基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的反應(yīng)性來(lái)選 擇期望的雜交瘤?？筛鶕?jù)免疫測(cè)定的原理檢測(cè)結(jié)合細(xì)胞的抗體。例如，可將其中將細(xì)胞用 作抗原的化ISA用于檢測(cè)期望的抗體。具體地，將雜交瘤的培養(yǎng)上清液與固定人pDC或用 作免疫原的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的載體接觸。在其中培養(yǎng)上清液包含期望的抗體的情況下，抗體被固 定在載體上的細(xì)胞捕獲。隨后，將固相與培養(yǎng)上清液分離，必需時(shí)洗涂，隨后可檢測(cè)被捕獲 在固相上的抗體。在抗體的檢測(cè)中，可使用識(shí)別抗體的抗體。例如，可利用抗-小鼠免疫球 蛋白抗體檢測(cè)小鼠的抗體。如果識(shí)別抗體的抗體已被標(biāo)記，則其檢測(cè)非常容易。作為標(biāo)記， 可使用酶、英光色素、發(fā)光色素等。
[0193] 在另一個(gè)方面，作為固定細(xì)胞的載體，可使用顆?；蛭⒘康味ò宓膬?nèi)壁。塑料制成 的顆?；蛉萜鞯谋砻婵赏ㄟ^(guò)物理吸附固定細(xì)胞。例如，聚苯己帰制成的珠?；蚍磻?yīng)容器可 用作用于固定細(xì)胞的載體。
[0194] 在選擇雜交瘤中，可存在預(yù)測(cè)的不是抗PLD4抗體的產(chǎn)生，而是針對(duì)用作免疫原的 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的宿主細(xì)胞的抗體的產(chǎn)生的情況。例如，當(dāng)如實(shí)施例中所示人細(xì)胞用作免疫原并 且小鼠用作免疫動(dòng)物時(shí)，人細(xì)胞被當(dāng)作外來(lái)物質(zhì)，并且預(yù)測(cè)產(chǎn)生結(jié)合其的抗體。在本發(fā)明 中，期望獲得識(shí)別PLD4的抗體。因此，識(shí)別除PLD4外的其它人細(xì)胞抗原的抗體的獲得不是 必需的。為了通過(guò)篩選排除產(chǎn)生該樣的抗體的雜交瘤，可在確認(rèn)抗體反應(yīng)性之前初步吸附 不期望的抗體。
[0195] 可利用結(jié)合預(yù)測(cè)存在的抗體的抗原吸附不期望的抗體。具體地，例如，可利用其中 可能未檢測(cè)到PLD4的表達(dá)的細(xì)胞吸附針對(duì)除PLD4外的其它人細(xì)胞抗原的抗體。在本發(fā)明 中，用于免疫原的宿主細(xì)胞優(yōu)選作為用于吸附不期望的抗體的抗原。
[0196] 必要時(shí)，確認(rèn)經(jīng)確認(rèn)具有對(duì)抗原的結(jié)合活性的單克隆抗體的對(duì)pDC的活性的實(shí)際 影響?？蒞例如通過(guò)下述方法確認(rèn)對(duì)pDC的影響。
[0197] 可從通過(guò)培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤獲得的培養(yǎng)物收集本發(fā)明的單克隆抗體。 可體外或體內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤。在體外培養(yǎng)中，可使用已知的培養(yǎng)基例如RPMI 1640來(lái)培養(yǎng)雜 交瘤。由雜交瘤分泌的免疫球蛋白積累在培養(yǎng)上清液中。因此，本發(fā)明的單克隆抗體可通 過(guò)收集培養(yǎng)上清液和必要時(shí)純化其來(lái)獲得。免疫球蛋白的純化在未添加有血清的培養(yǎng)基中 是非常容易的。然而，為了雜交瘤的快速生長(zhǎng)和抗體產(chǎn)量的提高，還可向培養(yǎng)基中添加10% 左右的胎牛血清。
[0198] 還可體內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤。具體地，可通過(guò)將雜交瘤接種至裸鼠的腹腔中來(lái)在腹腔中 培養(yǎng)雜交瘤。單克隆抗體在腹水中積累。因此，收集腹水，必要時(shí)純化其，W獲得必需的單 克隆抗體。取決于目的，可適當(dāng)?shù)匦揎椈蚣庸か@得的單克隆抗體。
[0199] 可通過(guò)從雜交瘤獲得編碼抗體的抗原結(jié)合區(qū)的cDNA，將其插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體來(lái) 表達(dá)本發(fā)明的單克隆抗體。用于獲得編碼抗體的可變區(qū)的CDNA并在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表 達(dá)其的技術(shù)是已知的。此外，其中將包含抗原結(jié)合區(qū)的可變區(qū)連接于恒定區(qū)W產(chǎn)生嵌合抗 體的方法是已知的。例如，可通過(guò)將可變區(qū)的基因連接于分別編碼人IgGl重鏈恒定區(qū)和人 IgK輕鏈恒定區(qū)的基因來(lái)產(chǎn)生嵌合抗體。此外，已知可通過(guò)將構(gòu)成可變區(qū)的CDR整合入另 一個(gè)免疫球蛋白分子的框架區(qū)來(lái)將單克隆抗體的抗原結(jié)合活性移植至所述另一個(gè)免疫球 蛋白。通過(guò)使用該樣的策略，建立了將異種免疫球蛋白所具有的抗原結(jié)合活性移植至人免 疫球蛋白的方法。例如，可存在其中將支持CDR的框架區(qū)的部分氨基酸序列從小鼠抗體的 可變區(qū)移植至人可變區(qū)的情況。隨后，可將人抗體的該些人源化、重建的可變區(qū)連接于人抗 體的恒定區(qū)，W獲得人源化抗體。
[0200] 本發(fā)明的優(yōu)選單克隆抗體的實(shí)例包括例如，由分別在登錄號(hào)；NITE BP-1211、NITE BP-1212、NITE BP-1213 和 NITE BP-1214 下保藏的雜交瘤 mp5B7、mp7B4、mpl3D4、mpl3Hll 等產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0201] 作為包含可變區(qū)的嵌合抗體，或其中構(gòu)成可變區(qū)的CDR是移植的人源化抗體，具 有來(lái)源于IgG或IgM的恒定區(qū)的抗體優(yōu)選包括在本發(fā)明的抗體中。具體地，本發(fā)明的抗體 更優(yōu)選為具有如下組合作為構(gòu)成抗體的可變區(qū)的CDR的序列的抗體：
[0202] 重鏈 CDRl ;DYNLH,
[0203] CDR2 ：YIYPYNGNTGYNQKFKR,
[0204] CDR3 ;GGIY孤YYDYAIDY 和
[0205] 輕鏈 CDRl ;RASENIYSHIA,
[0206] CDR2 =GATNLAH,
[0207] CDR3 =QHFWGTP,
[020引具有如下組合作為構(gòu)成可變區(qū)的CDR的序列的抗體：
[0209]重鏈 CDRl ;SHYYWT,
[0210] CDR2 ：YISYDGSNNYNPSLKN,
[0211] CDR3 ;EGPLYYGNPYWYFDV 和
[0212] 輕鏈 CDRl ;RAS孤IDNYLN,
[0213] CDR2 ：YTSRLHS,
[0214] CDR3 ：QQFNTLP,
[0215] 或具有如下組合作為構(gòu)成可變區(qū)的CDR的序列的抗體：
[0引引 重鏈 CDRl ;SHYYWS,
[0217] CDR2 ：YISYDGSNNYNPSLKN,
[0218] CDR3 ;EGPLYYGNPYWYFDV 和
[0219] 輕鏈 CDRl ;RAS孤IDNYLN,
[0220] CDR2 ;YTS化服，
[0221] CDR3 ; QQFNTLP。
[0222] 本發(fā)明人已確認(rèn)抗PLD4單克隆抗體對(duì)PLD4表達(dá)細(xì)胞具有CDC作用。因此，具有 IgG-或IgM-來(lái)源的恒定區(qū)的抗體對(duì)PLD4表達(dá)細(xì)胞具有通過(guò)CDC作用產(chǎn)生的細(xì)胞毒性的作 用。該樣的抗體用于抑制PLD4表達(dá)細(xì)胞例如pDC的細(xì)胞數(shù)目。
[0223] 識(shí)別PLD4的嵌合抗體或人源化抗體可使用編碼它們的多核巧酸，通過(guò)基因工程 來(lái)制備。
[0224] 未獲得可特異性識(shí)別PLD4的抗體。通過(guò)利用本發(fā)明的免疫原，已第一次提供了識(shí) 別PLD4的抗體。也就是說(shuō)，本發(fā)明提供了識(shí)別PLD4的抗體，其可通過(guò)下述方法來(lái)獲得。
[0225] (1)給免疫動(dòng)物施用包含PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的過(guò)程，
[0226] (2)從免疫動(dòng)物的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞選擇產(chǎn)生結(jié)合PLD4的抗體的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞 的過(guò)程，和
[0227] 做培養(yǎng)（2)中選擇的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞，從培養(yǎng)物收集識(shí)別PLD4的抗體的過(guò)程。 [022引已發(fā)現(xiàn)PLD4在人pDC中特異性表達(dá)。在人pDC中的特異性表達(dá)還由本發(fā)明人通 過(guò)利用SACiE的基因表達(dá)分析來(lái)獲得確認(rèn)。然而，在過(guò)去的報(bào)導(dǎo)中PLD4表達(dá)水平全都基于 mRNA來(lái)分析。此外，已知PLD4蛋白僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)PLD4也在細(xì)胞表面 上表達(dá)。由于未提供可檢測(cè)PLD4的抗體，因此沒有常規(guī)地進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)狀態(tài)的分析。由 本發(fā)明提供的結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體已實(shí)現(xiàn)了 PLD4蛋白的分析。
[0229] 如實(shí)際上由本發(fā)明人確認(rèn)的，基于本發(fā)明的結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗 體已特異性地檢測(cè)到人pDC。也就是說(shuō)，本發(fā)明涉及檢測(cè)漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的方法，其包括 步驟：將結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段與測(cè)試細(xì)胞接 觸，隨后檢測(cè)結(jié)合細(xì)胞的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段。
[0230] 通過(guò)基于本發(fā)明的PLD4的檢測(cè)，可確認(rèn)一些細(xì)胞是否是pDC。也就是說(shuō)，本發(fā)明提 供了使用PLD4作為指標(biāo)鑒定pDC的方法?；蛘?，可基于本發(fā)明分離對(duì)于其檢測(cè)到PLD4的 細(xì)胞，從而分離人pDC。也就是說(shuō)，本發(fā)明提供了使用PLD4作為指標(biāo)分離pDC的方法。
[0231] 在本發(fā)明中，結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段 可具有標(biāo)記。例如，可利用發(fā)光色素或英光色素標(biāo)記其來(lái)容易地檢測(cè)抗體。更具體地，將英 光色素標(biāo)記的抗體與可能含有PDC的細(xì)胞群接觸，隨后可使用英光色素作為指標(biāo)來(lái)檢測(cè)結(jié) 合本發(fā)明的抗體的細(xì)胞。此外，如果分離利用英光色素檢測(cè)到的細(xì)胞，可分離pDC?？筛鶕?jù) FACS的原理容易地進(jìn)行一系列步驟。
[0232] 或者，還可將本發(fā)明的抗體結(jié)合于固相載體例如磁珠。結(jié)合于固相載體的抗體識(shí) 別PLD4,從而將pDC捕獲在固相載體上。作為其結(jié)果，可檢測(cè)或分離pDC。
[0233] 基于本發(fā)明的pDC檢測(cè)法所必需的抗體可提供為用于檢測(cè)pDC的試劑。也就是 說(shuō)，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)PDC的試劑，其包含結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體或包 含其抗原結(jié)合區(qū)的片段。在本發(fā)明的用于檢測(cè)PDC的試劑中，除了抗體W外，還可組合陽(yáng)性 對(duì)照或陰性對(duì)照。例如，可將用作免疫原的表達(dá)PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)化細(xì)胞或從人收集 的pDC等用作陽(yáng)性對(duì)照。通常地，僅可從外周血獲得少量人pDC。因此，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在本發(fā)明 的試劑中特別優(yōu)選作為陽(yáng)性對(duì)照。另一方面，作為陰性對(duì)照，可使用不表達(dá)PLD4的任意細(xì) 胞。
[0234] 也就是說(shuō)，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)人pDC的試劑盒，其包含結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu) 域的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段。
[0235] 此外，本發(fā)明人分析了結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體對(duì)pDC的影響。作為其結(jié)果， 已確認(rèn)結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體抑制pDC活性。也就是說(shuō)，本發(fā)明涉及抑制干擾素生 成細(xì)胞的活性的方法，其包括將下列組分的任一種與pDC接觸的步驟：
[0236] (a)結(jié)合PLD4并抑制pDC活性的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，和
[0237] 化）其中植入單克隆抗體（a)的互補(bǔ)決定區(qū)的免疫球蛋白或包含其抗原結(jié)合區(qū)的 片段。
[023引或者，本發(fā)明涉及抑制活生物體中的pDC活性的方法，其包括給活生物體施用下 列組分的任一種的步驟：
[0239] (a)結(jié)合PLD4并抑制pDC活性的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，
[0240] 化）其中植入單克隆抗體（a)的互補(bǔ)決定區(qū)的免疫球蛋白或包含其抗原結(jié)合區(qū)的 片段，和
[0241] (C)編碼（a)或化）中描述的組分的多核巧酸。
[0242] 本發(fā)明的pDC是指具有IFN產(chǎn)生能力并且在細(xì)胞表面上表達(dá)PLD4的細(xì)胞。在 下文中，除非明確地另有所指，否則pDC不僅是作為樹突細(xì)胞的前體細(xì)胞的細(xì)胞，而且還 包括具有IFN產(chǎn)生能力和在細(xì)胞表面上表達(dá)PLD4的細(xì)胞。鑒定該樣的pDC的方法是已 知的。例如，可使用幾種細(xì)胞表面標(biāo)志物作為指標(biāo)區(qū)分pDC與其它血液細(xì)胞。具體地，人 pDC細(xì)胞表面標(biāo)志物的特征譜是如下文中描述的（Shodman,K.和Liu, YJ.化化re Reviews 2;151-161，2002)。近年來(lái)，還有報(bào)導(dǎo)將抓CA-2陽(yáng)性細(xì)胞指定為pDC(Dzione k，A.等人 J. Immunol. 165 :6037-6046, 2000)〇
[024引[人pDC的細(xì)胞表面抗原的特征譜]
[0244] CD4陽(yáng)性和CDI23陽(yáng)性，
[0245] 譜系（CD3、CD14、CD16、CD19、CD20 和 CD56)陰性，CDllc 陰性
[0246] 因此，具有該些已知標(biāo)志物的表達(dá)特征譜和具有IFN產(chǎn)生能力的細(xì)胞也可稱為 pDC。此外，屬于具有與該些標(biāo)志物的表達(dá)特征譜的表達(dá)模式不同的特征譜，但具有在活生 物體中產(chǎn)生IFN的能力的細(xì)胞家族的細(xì)胞包括在pDC中。
[0247] 此外，由人pDC顯示的共同特征的實(shí)例包括下述特征。
[024引[細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征]
[0249] ?與漿細(xì)胞相似
[0250] ?具有平滑細(xì)胞表面的圓形細(xì)胞
[0巧1] ?相對(duì)大的細(xì)胞核
[0252][細(xì)胞的功能特征]
[0巧引 ?病毒感染時(shí)在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量I型IFN
[0254] ?病毒感染后分化成樹突細(xì)胞
[0巧引本發(fā)明中pDC活性的抑制是指pDC的至少一個(gè)功能的抑巧IJ。pDC功能的實(shí)例包括 IFN產(chǎn)生和細(xì)胞存活。細(xì)胞存活可另外地被稱為細(xì)胞數(shù)目。因此，該些功能的一個(gè)或兩個(gè) 的抑制稱為pDC活性的抑制。已發(fā)現(xiàn)由pDC產(chǎn)生的I型IFN是各種疾病的原因。因此，pDC 細(xì)胞數(shù)目或INF產(chǎn)生的抑制可用作治療該樣的疾病的策略。
[0巧引例如，已指出自身免疫疾病的病理狀態(tài)與IFNa的關(guān)系。大部分IFNa由pDC產(chǎn) 生。因此，如果其產(chǎn)生被抑制，則可緩解由IFNa引起的病理狀態(tài)。同時(shí)，在本發(fā)明中，pDC 的INF產(chǎn)生的抑制是指由pDC產(chǎn)生的至少一種IFN的產(chǎn)生的抑制。本發(fā)明的IFN優(yōu)選為I 型IFN。在它們當(dāng)中，IFNa是重要的。
[0巧7] 也就是說(shuō)，本發(fā)明涉及IFN產(chǎn)生的抑制劑，其包含結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體 作為活性成分?；蛘撸景l(fā)明提供了抑制IFN產(chǎn)生的方法，其包括施用結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié) 構(gòu)域的抗體的過(guò)程。此外，本發(fā)明涉及結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體在制備抑制IFN產(chǎn)生 的藥物組合物中的用途。
[0巧引在少量細(xì)胞中產(chǎn)生大量IFN的細(xì)胞包括在pDC中。例如，接受病毒等的刺激的樹 突細(xì)胞的前體細(xì)胞產(chǎn)生大部分由活生物體產(chǎn)生的IFN。產(chǎn)生大量IFN的pDC的細(xì)胞數(shù)目的 抑制的結(jié)果是導(dǎo)致IFN產(chǎn)生的抑制。因此，pDC細(xì)胞數(shù)目的抑制也可緩解由IFNa引起的 病理狀態(tài)。
[0巧9] 在本發(fā)明的優(yōu)選方面，確認(rèn)了抗-PLD4單克隆抗體結(jié)合PLD4表達(dá)細(xì)胞，并且通過(guò) 補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性（CDC)作用賦予細(xì)胞毒性。CDC作用是抗體藥物的重要作用機(jī)制之一。 本發(fā)明的抗-PLD4單克隆抗體還具有通過(guò)CDC作用產(chǎn)生的對(duì)于PLD4表達(dá)細(xì)胞例如pDC的 強(qiáng)細(xì)胞毒性作用。也就是說(shuō)，在優(yōu)選方面，可預(yù)期抗-PLD4單克隆抗體的不僅通過(guò)抑制IFN 產(chǎn)生的機(jī)制，而且還通過(guò)對(duì)于pDC的細(xì)胞毒性產(chǎn)生的抑制IFN產(chǎn)生的作用。
[0260] 本發(fā)明使用的識(shí)別PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體可基于上述方法獲得。本發(fā)明的抗 體可W是任何種類。此外，抗體所源自的生物種類不受限制。此外，包含抗體的抗原結(jié)合區(qū) 的片段可用作抗體。例如，通過(guò)IgG的酶促消化產(chǎn)生的包含抗原結(jié)合部位的抗體片段可用 作本發(fā)明的抗體。具體地，抗體片段例如F油或F(油'）2可通過(guò)利用木瓜蛋白酶或胃蛋白 酶的消化來(lái)獲得。眾所周知該些抗體片段可用作對(duì)抗原具有親和力的抗體分子?；蛘?，還 可使用通過(guò)基因重組構(gòu)建的抗體，只要其維持必需的抗原結(jié)合活性。通過(guò)基因重組構(gòu)建的 抗體的實(shí)例包括嵌合抗體、CDR移植抗體、單鏈Fv、雙特異性抗體（雙體）、線性抗體和由抗 體片段形成的多特異性抗體等?；趩慰寺】贵w獲得該些抗體的方法是已知的。
[0261] 必要時(shí)可修飾本發(fā)明的抗體。根據(jù)本發(fā)明，識(shí)別PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體具有抑 巧Ij PDC活性的作用。也就是說(shuō)，已預(yù)見了抗體本身具有對(duì)于pDC的細(xì)胞毒性的可能性。顯 示強(qiáng)效應(yīng)子作用的抗體的亞類是已知的?；蛘?，還可通過(guò)用細(xì)胞毒性劑修飾抗體來(lái)增強(qiáng)抑 制pDC活性的作用。細(xì)胞毒性劑的實(shí)例包括下述試劑。
[026引毒素；假單胞桿菌內(nèi)毒素牌)、白喉毒素和籬麻毒素 [026引 放射性同位素；Tc99m、Sr89、1131和Y90
[0264] 抗癌劑：卡奇霉素、絲裂霉素和紫杉醇。
[0265] 包含蛋白的毒素可通過(guò)雙功能試劑結(jié)合抗體、其片段等。或者，還可用編碼抗體的 基因綴合編碼毒性的基因來(lái)產(chǎn)生它們的融合蛋白。將放射性同位素與抗體結(jié)合的方法也是 已知的。例如，使用馨合劑，利用放射性同位素標(biāo)記抗體的方法是已知的。此外，可通過(guò)使 用糖鏈、雙功能試劑等將抗癌劑結(jié)合于抗體。
[0266] 在本發(fā)明中，還可將人工地結(jié)構(gòu)修飾的抗體用作活性組分。例如，已知增強(qiáng)抗體 的細(xì)胞毒性或穩(wěn)定性的各種修飾。具體地，其中重鏈的糖鏈被修飾的免疫球蛋白是已知的 (Shinkawa, T.等人J. Biol. Chem. 278 :3466-3473. 2003)。糖鏈的修飾增強(qiáng)免疫球蛋白的抗 體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC)活性。
[0267] 當(dāng)將結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體與pDC接觸時(shí)，其抑制pDC的活性。因此，該 樣的抗體可用作抑制PDC活性的試劑，或用于抑制pDC的方法。也就是說(shuō)，本發(fā)明提供了用 于抑制pDC活性的試劑，其包含至少一個(gè)種類的選自下述（a)至（C)的組分作為活性組分。 或者，本發(fā)明涉及抑制pDC活性的方法，其包括施用至少一個(gè)種類的選自下述（a)至（C)的 組分的步驟。此外，本發(fā)明涉及至少一個(gè)種類的選自下述（a)至（C)的組分用于制備用于 調(diào)節(jié)pDC活性的試劑的用途。
[026引 （a)結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，
[0269] 化）其中植入單克隆抗體（a)的互補(bǔ)決定區(qū)的免疫球蛋白或包含其抗原結(jié)合區(qū)的 片段。
[0270] 作為本發(fā)明的抑制pDC活性的單克隆抗體，可使用識(shí)別PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克 隆抗體?？蓪⒁粋€(gè)種類或多個(gè)種類的單克隆抗體用于本發(fā)明。例如，可混合多個(gè)種類的識(shí) 別PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體，將其用于本發(fā)明。
[027。 可W W下述方式確認(rèn)抗體具有抑制pDC的IFN產(chǎn)生活性的作用的事實(shí)。pDC在病毒 刺激后產(chǎn)生大量IFN。在病毒刺激之前、之后或與之同時(shí)給pDC提供抗體，將IFN產(chǎn)生能力 與其中未給pDC提供抗體的對(duì)照相比較?？赏ㄟ^(guò)測(cè)量pDC培養(yǎng)物的上清液中包含的IFN-a 或IFN-目來(lái)評(píng)價(jià)IFN產(chǎn)生能力。作為比較的結(jié)果，如果抗體的添加顯著地減少了上清液中 IFN的量，可確認(rèn)測(cè)試的抗體具有抑制IFN產(chǎn)生活性的作用。測(cè)量該些IFN的方法是已知 的。pDC是在活生物體中產(chǎn)生大部分IFN的細(xì)胞。因此，pDC的IFN產(chǎn)生活性的抑制可在活 生物體中調(diào)節(jié)IFN的產(chǎn)生狀態(tài)。
[0272] 本發(fā)明的pDC的活性包括pDC細(xì)胞數(shù)目的維持。因此，本發(fā)明的pDC活性的抑制 包括pDC細(xì)胞數(shù)目的抑制。如果確認(rèn)pDC細(xì)胞數(shù)目在抗體存在的情況下被抑制，則認(rèn)為抗 體抑制pDC活性。與IFN產(chǎn)生類似，可將來(lái)源于與活性待確認(rèn)的抗體的物種相同的動(dòng)物物 種的無(wú)活性免疫球蛋白用作比較的對(duì)照。可通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)定量比較pDC細(xì)胞數(shù)目?？捎?FACS或顯微鏡來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。
[0273] 此外，還假定作為病毒感染等的結(jié)果pDC分化成稱為樹突細(xì)胞2 (DC2)的誘導(dǎo)化2 的細(xì)胞。如果病毒刺激后產(chǎn)生IFN的pDC被抑制，則存在至化2的分化也可被抑制的可能 性。因此，還可預(yù)期抑制IFN產(chǎn)生的本發(fā)明的單克隆抗體具有針對(duì)各種過(guò)敏性疾病的治療 作用。
[0274] 在其中給與抗體所源自的生物物種不同的宿主施用識(shí)別PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗 體的情況下，期望將抗體加工成幾乎不被宿主識(shí)別為外來(lái)物質(zhì)的形式。例如，可通過(guò)如下所 述加工分子來(lái)使免疫球蛋白幾乎不被識(shí)別為外來(lái)物質(zhì)。下述加工免疫球蛋白分子的方法是 已知的。
[027引 ?從其刪除恒定區(qū)的包含抗原結(jié)合區(qū)的片段（Monoclonal AntibodiesiPrinciples and Practice,第 3 片反，Academic Press Limited. 1995: Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)
[0276] ?利用單克隆抗體的抗原結(jié)合區(qū)和宿主免疫球蛋白的恒定區(qū)構(gòu)成的嵌合抗體 (Gene Expression Experiment Manual, Kodansha Ltd. 1994 (由 Isao ISHIDA 和 Tamie ANDO編輯的））
[0277] ?其中用單克隆抗體的CDR置換了宿主免疫球蛋白中的互補(bǔ)決定區(qū)仰R)的CDR 置換抗體（Gene Expression Experiment Manual, Kodansha Ltd. 1994(由 Isao ISHIDA 和 Tamie ANDO 編輯的））
[027引或者，人免疫球蛋白可變區(qū)的基因還可通過(guò)瞻菌體展示法（McCaffedy J 等人，Nature 348:552-554,1990:Kretzschmar T 等人，Curr Opin Biotechnol. 2002Dec: 13(6) :598-602.)獲得。在瞻菌體展示法中，將編碼人免疫球蛋白可 變區(qū)的基因整合入瞻菌體基因。通過(guò)使用不同的免疫球蛋白基因作為來(lái)源，還可制備瞻菌 體文庫(kù)。瞻菌體將可變區(qū)表達(dá)為構(gòu)成其本身的蛋白質(zhì)的融合蛋白。由瞻菌體表達(dá)在瞻菌體 表面上的可變區(qū)維持對(duì)抗原的結(jié)合活性。因此，結(jié)合抗原或其中表達(dá)抗原的細(xì)胞等的瞻菌 體的選擇可從瞻菌體文庫(kù)篩選其中表達(dá)具有期望的結(jié)合活性的可變區(qū)的瞻菌體。此外，該 樣選擇的瞻菌體顆粒保留編碼具有期望的結(jié)合活性的可變區(qū)的基因。也就是說(shuō)，編碼具有 期望結(jié)合活性的可變區(qū)的基因可在瞻菌體展示法中使用可變區(qū)的結(jié)合活性作為指標(biāo)來(lái)獲 得。
[0279] 可將根據(jù)本發(fā)明的用于抑制pDC活性的試劑或抑制pDC活性的方法中的識(shí)別PLD4 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體或包含至少其抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段W蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)的多核 巧酸的形式進(jìn)行施用。在施用多核巧酸中，期望使用其中將編碼期望的蛋白質(zhì)的多核巧酸 置于適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制之下W表達(dá)期望的蛋白質(zhì)的載體。在載體中，還可放置增強(qiáng)子或終 止子。保留構(gòu)成免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的基因并且可表達(dá)免疫球蛋白分子的載體是已知 的?？杀磉_(dá)免疫球蛋白的載體可通過(guò)將其引入細(xì)胞來(lái)施用。在對(duì)活生物體的施用中，可經(jīng) 由施用至活生物體中來(lái)感染細(xì)胞的載體可就該樣直接施用?；蛘撸€可首先將載體引入從 活生物體分離的淋己細(xì)胞，隨后將其再返還至活生物體內(nèi)（離體）。
[0280] 在基于本發(fā)明的用于抑制pDC活性的試劑中或抑制pDC活性的方法中給活生物體 施用的單克隆抗體的量，通常為作為免疫球蛋白每化g的體重0. 5mg至lOOmg，例如Img至 50mg，優(yōu)選2mg至IOmg的量?？蛇m當(dāng)?shù)恼{(diào)整給活生物體施用抗體的間隔，W便可在治療期 間維持免疫球蛋白在生物體中的有效濃度。具體地，可W例如W 1至2周的間隔進(jìn)行施用。 施用途徑是任意的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在治療中適當(dāng)?shù)剡x擇有效施用途徑。具體地，施用 途徑的實(shí)例包括口服或非口服施用。例如，可通過(guò)靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、皮下 注射等全身性或局部施用抗體。本發(fā)明中用于非口服施用的適當(dāng)制劑的實(shí)例包括注射劑、 栓劑、噴霧劑等。此外，在其中給細(xì)胞施用免疫球蛋白的情況下，將免疫球蛋白W通常Iyg/ mU優(yōu)選IOy g/mL或更高，更優(yōu)選50]i g/mL或更高，更優(yōu)選0. 5mg/mL或更高的濃度施用至 培養(yǎng)液。
[0281] 在本發(fā)明的用于抑制pDC活性的試劑或抑制pDC活性的方法中，可通過(guò)任何方法 將單克隆抗體給活生物體施用。通常地，將單克隆抗體與藥學(xué)上可接受的載體混合。必要 時(shí)，可將添加劑例如增稠劑、穩(wěn)定劑、防腐劑和增溶劑與單克隆抗體混合在一起。該樣的載 體或添加劑的實(shí)例包括乳糖、巧樣酸、硬脂酸、硬脂酸鎮(zhèn)、藏糖、淀粉、滑石、明膠、瓊脂、植物 油、己二醇等。稱為"藥學(xué)上可接受的"的術(shù)語(yǔ)是指由每一個(gè)國(guó)家的政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的，或 每一個(gè)國(guó)家的藥典或被廣泛承認(rèn)的藥典中列出的用于動(dòng)物、哺乳動(dòng)物和特別地人的那些。 還可W W單次劑量或多份劑量的凍干粉劑或片劑的形式提供本發(fā)明的用于抑制pDC活性 的試劑。還可在施用前將凍干粉劑或片劑與無(wú)菌水、生理鹽水或注射用緩沖液組合W將組 合物溶解至期望的濃度。
[0282] 此外，在其中W免疫球蛋白表達(dá)載體的形式施用本發(fā)明的用于抑制pDC活性的試 劑的情況下，用分開的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染重鏈和輕鏈，可W W每Ikg體重0. 1至IOmg,例如，1至 Smg的量施用每一種質(zhì)粒。此外，將1至SygAO6個(gè)細(xì)胞的載體用于體外引入細(xì)胞。在下 文中，將基于實(shí)施例更具體地解釋本發(fā)明。
[0283] 同時(shí)，將本說(shuō)明書中引用的全部現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本說(shuō)明書。
[0284] 盡管將利用下文中的實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明，但本發(fā)明絕不限于該樣的實(shí)施 例。 實(shí)施例 陽(yáng)2財(cái) 連施例1
[0286] A. PLD4表達(dá)的分析
[0287] A-1)使用SAGE文庫(kù)的分析
[028引利用SAGE?(基因表達(dá)系列分析）法比較靜息pDC、人單核細(xì)胞和利用滅活瘡疹病 毒化SV-1)處理的活化pDC中的基因表達(dá)。分析方法是如下描述的。
[0289] 從人外周血將單核細(xì)胞分離為CD14陽(yáng)性細(xì)胞，利用抓CA-4+分離試劑盒 (Miltenyi Biotec公司）和MACS系統(tǒng)（MiItenyi Biotec公司）將人pDC細(xì)胞分離為 抓CA-4陽(yáng)性細(xì)胞。此外，在滅活的HSV-I存在的情況下培養(yǎng)人pDC細(xì)胞12小時(shí)，從而制 備活化的pDC(pDC+HSV)。從每一種細(xì)胞提取總RNA，使用I-SAGE?試劑盒（Invitrogen公 司）制備SAGE文庫(kù)。利用SAGE2000分析軟件（Invitrogen公司）分析獲得的約100, 000 個(gè)標(biāo)記的堿基序列的數(shù)據(jù)。作為其結(jié)果，單核細(xì)胞/pDC/pDC+HSV的分值為0/9/0基因，也 就是說(shuō)，發(fā)現(xiàn)了 PLD4(磯脂酶D家族，成員4，C14或fl75:GenBank登錄號(hào)；NM_138790. 2)， 其為已知的基因，為顯示靜息pDC細(xì)胞特異性表達(dá)的基因（圖1，Tao等人，化t. Methods 2 巧），591-598 (2005): Clark 等人，Genome Res. 13 (10) ,2265-2270 (2003))。PLD4 為由 SEQ ID N0;44所示的堿基序列編碼的506個(gè)氨基酸的序列（SEQ ID N0;1)。PLD4蛋白 具有兩個(gè)假定的PDE區(qū)域（磯酸二醋酶基序）（由兩個(gè)在C末端區(qū)域中保守的HKD基序 化is-x-Lys-x-x-x-x-Asp氨基酸序列，X為其它氨基酸）構(gòu)成）和假定的磯酸化位點(diǎn)（T虹 472)。PLD4蛋白的結(jié)構(gòu)被預(yù)測(cè)為II型單變跨膜蛋白。此外，PLD4蛋白在N末端區(qū)域不具 有PX區(qū)域化OX同源性結(jié)構(gòu)域）和PH區(qū)域（Pleckstrin同源性結(jié)構(gòu)域），所述區(qū)域?yàn)閷儆?經(jīng)典PLD家族的PLDl和PLD2所具有（圖I和2)。
[0290] A-2)通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行的人的負(fù)責(zé)免疫的各種細(xì)胞中PUMmRNA的表達(dá)分析。
[0291] 已特別地檢查了 PUMmRNA在血細(xì)胞中的表達(dá)。從人外周血通過(guò)細(xì)胞分選器分離 和獲取每一種細(xì)胞。從每一個(gè)分離和獲取的細(xì)胞家族提取RNA，隨后合成cDNA。通過(guò)使用 獲得的CDNA作為模板，進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR，分析PUMmRNA的表達(dá)水平。
[029引 對(duì)于定量實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，使用Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG試劑盒 (Invitrogen公司）利用ABI PRISM 7000進(jìn)行定量PCR。將序列檢測(cè)系統(tǒng)軟件（Applied Biosystem公司）用于數(shù)據(jù)分析。PCR反應(yīng)條件和使用的引物的堿基序列如下。
[029引 PLD4 的正向引物：5, ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3'（沈Q ID NO ;扣）
[0294] PLD4 的反向引物；5'TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3'（SEQ ID NO ;46)
[029引 GAPDH 的正向引物；5'AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3'（SEQ ID NO ;47)
[0296] GAPBH 的反向引物；5'GCC CAA TAC GAC CAA ATC C 3'（SEQ ID NO ;48)
[0297] 1個(gè)循環(huán)，于58 C進(jìn)行2分鐘，
[029引 1個(gè)循環(huán)，于95 C進(jìn)行10分鐘，
[0299] 50個(gè)循環(huán)[于95 C進(jìn)行15砂，和于6(TC進(jìn)行60砂]，
[0300] 檢查了 pDC、利用服V刺激的pDC(pDC+服V)、B細(xì)胞（CD19+細(xì)胞）、活化的B細(xì)胞 (CD19+細(xì)胞）、T細(xì)胞（CD3+細(xì)胞）和利用肌霉素和PMA((12-)十四酸佛波醋（-13-)己 酸鹽）刺激的活化的T細(xì)胞。作為結(jié)果，顯示了 PLD4表達(dá)在處于靜止期的pDC中特別高， 在CDI9+B細(xì)胞中低。其它人血級(jí)分cDNA使用抓? MTC多組織cDNA板（Multiple Tissue cDNA Panels) (Cat. No. 636750, hkara Bio 公司）（圖 5)。
[030。 A-3)通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行的人組織中PUMmRNA的表達(dá)分析
[030引 此外，使用ABI PRISM 7000(Applied Biosystem公司）通過(guò)定量PCR檢查其 它器官或組織中的表達(dá)。作為cDM板，使用抓? MTC多組織CDNA板（Human I:化t. No. 636742, Human immune: Cat. No. 636748:全部來(lái)自 Takara Bio 公司）。使用的引物的堿 基序列顯示如下。
[030引 PLD4 的正向引物；5'ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3'（SEQ ID NO ;49)
[0304] PLD4 的反向引物：5'TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3'（SEQ ID NO ;50)
[030引 GAPDH 的正向引物；5'AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3'（SEQ ID NO ;51)
[030引 GAPDH 反向引物；5'GCC CAA TAC GAC CAA ATC C 3'（SEQ ID NO ;52)
[0307]使用 Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG 試劑盒（Invitrogen 公司）利 用ABI PRISM 7000進(jìn)行定量PCR。使用序列檢測(cè)系統(tǒng)軟件（Applied Biosystem公司）進(jìn) 行分析。反應(yīng)條件描述如下。
[030引步驟1 ; 1個(gè)循環(huán)，于5(TC進(jìn)行2分鐘
[0309] 步驟2 ; 1個(gè)循環(huán)，于95 C進(jìn)行10分鐘
[0310] 步驟3 ; 50個(gè)循環(huán)，于95 C進(jìn)行15砂和于6(TC進(jìn)行1分鐘
[0311] 通過(guò)利用GAPDH(甘油酵-3-磯酸脫氨酶）的基因表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)比較每 一個(gè)組織之間的PLD4基因的表達(dá)，已知GAPDH原狀穩(wěn)定地表達(dá)。作為其結(jié)果，PUMmRNA在 脾和外周血白細(xì)胞中顯示相對(duì)高的表達(dá)。此外，已發(fā)現(xiàn)PUMmRNA廣泛地在其它組織中表 達(dá)。然而，PUMmRNA的表達(dá)水平少于靜息pDC細(xì)胞的表達(dá)水平的1/100 (圖6)。
[0312] 人PLD4表達(dá)載體的制備
[0313] 進(jìn)行PLD4基因表達(dá)載體的制備W表達(dá)人PLD4蛋白。利用EcoRI酶從整合入 PCR4-T0P0 克隆性載體（Open Biosystem, Cat, No. M服4771-99610856)的 PUMcDNA 克隆僅 取出PLD4基因，隨后將其整合入PCDNA3. 1表達(dá)載體（人PLD4-PCDNA3. 1載體）。通過(guò)使 用獲得的人PLD4-PCDNA3. 1質(zhì)粒作為模板，利用包含EcoRI、Not I和Kozak序列佑CC GCC ACC)的引物（引物的信息如下所述）擴(kuò)增PLD4基因。利用pMX-IP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（人 PLD4-PMX-IP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）將PCR產(chǎn)物克隆在EcoRI和Not I位點(diǎn)。在PCR反應(yīng)中，使 用1個(gè)單位的KOD Plus DNA聚合酶（T0Y0B0公司），反應(yīng)條件為1個(gè)循環(huán)（于94C進(jìn)行2 分鐘），隨后于94C進(jìn)行15砂和于68C進(jìn)行1分鐘30砂的25個(gè)循環(huán)。
[0314] 正向引物（SEQ ID NO ;53) GAA TTC gcc gcc acc ATG CTG AAG CCT 3'（30-聚體） 峽巧]反向引物（SEQ ID NO ;54) :5'aaa gcg gcc gcT CAG CCC TGC CAA ACG CAG TCC T 3'（34-聚體）
[0316] 與序列分析一起，利用人PLD4-PMX-IP逆轉(zhuǎn)錄病毒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肥K (人胚胎腎）-293T 細(xì)胞（在下文中，293T細(xì)胞），通過(guò)細(xì)胞染色，隨后進(jìn)行FACS法來(lái)確認(rèn)人PLD4是否在293T 細(xì)胞的表面上表達(dá)。 陽(yáng)317] 連施例2
[031引抗-人PLD4抗體的特異性的檢查
[0319] 可利用其中強(qiáng)制表達(dá)每一個(gè)PLD家族的細(xì)胞來(lái)確認(rèn)抗-PLD4單克隆抗體不與PLD 家族的其它分子交叉反應(yīng)的事實(shí)。人PLD4屬于PLD家族，存在多個(gè)具有高度同源性的分子。 人口0)4顯示與人？0)3的約41%的同源性，和與人？0)5的約29.3%的同源性（圖4)。
[0320] 1)人PLD3和人PLD5的表達(dá)載體的制備
[032U 對(duì)于人 PLD3(cDNA SEQ ID NO ;55,氨基酸 SEQ ID NO ;127)和人 PLD5(cDNA SEQ ID N0;56,氨基酸SEQ ID側(cè)；123)，利用？0?從整合入9〔1￥-5?0^6載體的人？0)3克隆 化.K. DNAFORM 公司，Cat. No 5189261)，和整合入 pCR-Blunt II-TOPO 載體的人 PLD5 克隆 化.K. DNAFORM公司，Cat. No 40025860)僅擴(kuò)增PLD3和PLD5基因，將每一個(gè)基因克隆在 Flag-標(biāo)記的pcDNA3. 1 (Invitrogen公司）的Hind III和EcoRI位點(diǎn)上，從而制備表達(dá)載 體（引物的信息是如下描述的）。
[0322] (對(duì)于人 PLD3)
[0323] 正向引物；huPLD3-IF化ind III)
[0324] 序列；5' ttt MG CTT gcc gcc acc ATG MG CCT MA CTG ATG TAC 3'（39-聚體） 沈Q ID NO ;57)
[032引 反向引物；huPLD4-1518R(EcoRI)
[032引 序列：5' ttt gaa ttc TCA ctt ate gtc gtc ate ctt gta ate GAG CAG GCG GCA GGC GTT GCC 3,巧7-聚體）（SEQ ID NO ;58)
[0327] (對(duì)于人 PLD5)
[0328] 正向引物；huPLD5-IF化ind III)。
[0329] 序列；5' ttt MG CTT gcc gcc acc ATG GGA GAG GAT GAG GAT GGA 3'（39-聚體） (SEQ ID NO :59)
[0330] 反向引物；huPLD5-1383R (EcoRI)
[0331] 序列；5'ttt gaa ttc TCA ctt ate gtc gtc ate ctt gta ate TAC GTT CCG GGG ATC CTT TCC 3' 巧7-聚體）（SEQ ID NO ;60)
[0332] 在上述引物序列中，加W下劃線的部分代表編碼添加的FLAG標(biāo)簽的堿基序列，斜 體字類型代表限制性內(nèi)切酶的Hind III切割位點(diǎn)或EcoRI位點(diǎn)。
[0333] 與序列分析一起，利用人PLD3-PCDNA3. 1載體或人PLD5-PCDNA3. 1載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞染色，隨后通過(guò)FACS法確認(rèn)人PLD4是否在293T細(xì)胞的表面上表達(dá)。
[0334] 作為其結(jié)果，抗體不與其中顯示表達(dá)人PLB3或人PLD5的細(xì)胞反應(yīng)，該表明該些 抗-PLD4抗體特異性識(shí)別人PLD4分子（圖8)。
[0335] 人PLD4表達(dá)細(xì)胞穩(wěn)定株的制備
[0336] 將制備的人PLD4-PMX-IP載體與作為逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝載體的P化-Eco載體 (IMGE肥X，化t. No. 10045巧一起共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，從而進(jìn)行基因引入?；蛞雽?shí)驗(yàn) 使用化GENE(注冊(cè)商標(biāo)）皿轉(zhuǎn)染劑（Roche)作為轉(zhuǎn)染劑。2天后，收集其中分泌了含有人 PLD4基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用其感染CT125細(xì)胞株（2B4小鼠T細(xì)胞淋己細(xì) 胞腫瘤細(xì)胞系）。根據(jù)PMX-IP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包含抗嘿嶺霉素基因的事實(shí)，在嘿嶺霉素存 在的情況下培養(yǎng)感染的CT125細(xì)胞僅允許表達(dá)人PLD4的細(xì)胞存活，從而導(dǎo)致其選擇。通過(guò) FACS分選術(shù)進(jìn)一步將已選擇的人PLD4表達(dá)CT125細(xì)胞（在下文中，人PLD4-CT125)選擇 為僅允許人PLD4的更高表達(dá)的CT125細(xì)胞，培養(yǎng)所述細(xì)胞。為了確定人PLD4表達(dá)，利用調(diào) 整至5 y g/mL的商購(gòu)可得的小鼠抗-人PLD4多克隆抗體（Abnova，Cat#:冊(cè)0122618-B01巧 對(duì)CT125細(xì)胞進(jìn)行染色，隨后進(jìn)行FACS分析。作為其結(jié)果，建立了人PLD4-CT125細(xì)胞穩(wěn)定 株，將其用于雜交瘤的FACS篩選。
[0337] 食蟹猴和恒河猴的PLD4表達(dá)載體的構(gòu)建，和人PLD4表達(dá)細(xì)胞穩(wěn)定株的制備 [033引為了表達(dá)食蟹猴和恒河猴的PLD4蛋白，進(jìn)行猴PLD4基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu) 建。
[0339] 1)食蟹猴PLD4和恒河猴PLD4基因的克隆
[0340] 在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)狂M_002805227. 1)等中報(bào)道了恒河猴的PLD4的cDNA序列（但 為部分），其全長(zhǎng)CDNA未見報(bào)道。此外，由于食蟹猴的PLD4基因序列仍無(wú)報(bào)導(dǎo)，因此從食蟹 猴和恒河猴的 PBMC (分別地 10血；SHIN NIPPON BIOMEDICAL LABORATORIES, LTD.)進(jìn)行基 因克隆。
[0341] 從猴子的外周血提取總RNA，使用寡-dT引物和Superscript Choice System for cDNA Synthesis試劑盒從5 y g的總RNA合成cDNA。
[0342] 通過(guò)使用制備的cDNA作為模板，使用具有下列堿基序列的引物，利用PCR法擴(kuò)增 食蟹猴PLD4和恒河猴PLD4基因。
[034引 正向引物（cynoPLD4-32巧；5'AGA TGC TGA AGC CTC TTC GGA GAG Cg 3'（沈Q ID NO ：61)
[0344]反向引物（cynoPLD4-1554R) ;5'TCA GCC CTG CCA AAC GCA GTC CTG G3'（SEQ ID NO :62)
[034引使用1 %瓊脂糖凝膠通過(guò)電泳分離經(jīng)擴(kuò)增的食蟹猴PLD4的約1521個(gè)堿基對(duì)和恒 河猴PUMcDNA片段的1521個(gè)堿基對(duì)，收集其，使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning試劑盒 (Invitrogen公司）將其克隆入pCR4Blunt-T0P0質(zhì)粒載體（Invitrogen公司）。分析獲得 的基因的堿基序列，所述序列由SEQ ID NO ;63和SEQ ID NO ;124表示。確認(rèn)了期望的食蟹 猴PLD4和恒河猴PLD4基因能夠被克隆。
[0346] 人PLD4蛋白顯示與食蟹猴PLD4(SEQ ID NO ;129)具有約94. 4%的蛋白質(zhì)序列同 一性，和與恒河猴PLD4(SEQ ID N0;130)具有約94%的蛋白質(zhì)序列同一性。圖14舉例說(shuō) 明人口0)4與食蟹猴口0)4、恒河猴口0)4和小鼠口0)4(。0臟569 10^;131，氨基酸569 10 NO ;132)的蛋白質(zhì)序列的同源性。
[0347] 2)食蟹猴PLD4表達(dá)細(xì)胞穩(wěn)定株的制備
[0348] 食蟹猴PLD4表達(dá)細(xì)胞穩(wěn)定株通過(guò)使用制備的食蟹猴PLD4-PMX-IP載體W與制備 人PLD4表達(dá)細(xì)胞穩(wěn)定株的方法相同的方法，在嘿嶺霉素存在的情況下培養(yǎng)利用逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體感染的CT125細(xì)胞來(lái)建立。
[0349] 為了確定食蟹猴的PLD4表達(dá)，用商購(gòu)可得的小鼠抗-人PLD4多克隆抗體（其還 代表與猴PLD4的交叉反應(yīng)性）（Abnova，Cat# ;冊(cè)0122618-B01巧對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，隨后進(jìn)行 FACS分析。作為其結(jié)果，建立了食蟹猴PLD4-CT125細(xì)胞穩(wěn)定株，將其用于雜交瘤的FACS篩 選（圖16)。
[0350] 人PUM-Ig融合蛋白的制備
[0351] 為了用作抗-人PLD4單克隆抗體的制備中的免疫原，利用2步PCR法擴(kuò)增其中融 合人PLD4蛋白的細(xì)胞外區(qū)域（56-506a. a)與小鼠IgG2a化片段（包含重鏈較鏈的部分、 C肥和C冊(cè)的234個(gè)a. a)的2142bp的DNA片段，構(gòu)建人PUM-Ig PCDNA3. 1和人PUM-Ig 祀E14. 4的表達(dá)載體質(zhì)粒（cDNA和蛋白質(zhì)的序列示于序列表中）。 防35引為了從培養(yǎng)上清液獲得蛋白質(zhì)，將Maxi-prep DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至化eest^e 293F細(xì) 胞（在下文中，293F細(xì)胞，catalog No.R790-07:Invitrogen)。在轉(zhuǎn)染后7天，將共轉(zhuǎn)染 的293F細(xì)胞的培養(yǎng)液收集在50mL管中，在4°C于2, 070g的條件下離也5分鐘。利用具有 0. 45 y m孔徑的注射器式濾器（catalog No. 431220: CORNING)過(guò)濾上清液，將培養(yǎng)上清液 收集在一起。
[0巧3] 利用AKTA-FPLC系統(tǒng)的蛋白A親和柱純化收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，純化重組人 PUM-Ig融合蛋白的蛋白質(zhì)（圖7)。 。巧4] 連施例3
[0355] A.抗-人PLD4單克隆抗體的制備 [0巧6] A-1)免疫
[0巧7] 使用上述重組PUM-Ig融合蛋白作為免疫原。將PUM-Ig融合蛋白皮下施用至3 只BALB/c小鼠的背部。將弗氏佐劑（完全和不完全）（SIGMA)用作佐劑，第一次W 200 y g/ 小鼠施化第二至第四次W 50 y g/小鼠施用。
[0巧引 A-2)抗-血清滴度的確認(rèn)
[0巧9] 在第3次免疫和第4次免疫后收集血液，利用化ISA評(píng)估血清中的抗-PUM-Ig滴 度。
[0360] 將PUM-Ig融合蛋白固相化于96孔微量滴定板中。將抗血清從1，000倍開始乘3 逐步稀釋，將稀釋系列制備至729, 000倍。將每一個(gè)樣品W 50 y L添加至抗原固相化的板 中，進(jìn)行初次反應(yīng)。洗涂后，利用HRP標(biāo)記抗-小鼠IgG(K, A)抗體進(jìn)行二次反應(yīng)，隨后利 用OPD (鄰-苯二胺）進(jìn)行顏色檢測(cè)（490nm)。
[036。 A-3)細(xì)胞融合
[036引從對(duì)于其抗血清滴度的增加得到驗(yàn)證的小鼠分離脾細(xì)胞。利用陽(yáng)G法融合分離的 脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（P3U1)，從HAT培養(yǎng)基進(jìn)行融合脾細(xì)胞的選擇和培養(yǎng)。
[0363] 使用CAL-I細(xì)胞的雜交瘤的FACS篩選
[0364] 利用FACS評(píng)價(jià)產(chǎn)生獲自HAT選擇培養(yǎng)的融合脾細(xì)胞的每一個(gè)克隆的抗體。將 2 X IO5個(gè)人pDC樣細(xì)胞株CAkl細(xì)胞與50 y L的每一個(gè)下述雜交瘤的培養(yǎng)上清液在4°C反 應(yīng)15分鐘。用FACS緩沖液（1% FBS+PBS)洗涂細(xì)胞2次，隨后離也，取出上清液。使用PE 標(biāo)記抗-小鼠IgG抗體炬D Bioscience :550589)作為第二抗體在4°C反應(yīng)20分鐘。將從 HAT選擇培養(yǎng)開始10天后的培養(yǎng)液用作每一個(gè)克隆的培養(yǎng)上清液的原始倍數(shù)。作為其結(jié) 果，雜交瘤培養(yǎng)上清液的 3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1 和 11G9. 6 與 CAL-I細(xì)胞良好反應(yīng)（圖11)。
[0365] 使用人PLD4-CT125穩(wěn)定細(xì)胞株的雜交瘤的FACS篩選
[0366] 利用FACS評(píng)價(jià)產(chǎn)生獲自HAT選擇培養(yǎng)的融合脾細(xì)胞的每一個(gè)克隆的抗體。將 2 X IO5個(gè)人PLD4-CT125與50 y L的每一個(gè)下述雜交瘤的培養(yǎng)上清液在4°C反應(yīng)15分鐘。用 FACS緩沖液（1 % FBS+PBS)洗涂細(xì)胞2次，隨后離也，取出上清液。使用陽(yáng)標(biāo)記抗-小鼠IgG 抗體炬D Bioscience :550589)作為第二抗體在4°C反應(yīng)20分鐘。作為其結(jié)果，雜交瘤培 養(yǎng)上清液的 3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1 和 11G9. 6 與人 PLD4-CT125 細(xì)胞良好反應(yīng)（圖12)。
[0367] A-5)使用人外周血pDC的FACS篩選 [036引[人PBMC的分離]
[036引收集20血的健康個(gè)體的外周血，使用HIST0PAQ肥-1077 (SIGMA公司）利用比重離 也機(jī)分離外周血單核細(xì)胞（PBMC)。將每一個(gè)樣品的IX IO6PBMC染色。用FACS緩沖液洗 涂細(xì)胞，隨后添加化封閉試劑（Militenyi公司）的5倍稀釋物25 y L在4°C反應(yīng)15分 鐘。用FACS緩沖液洗涂細(xì)胞，隨后添加50 y L的每一個(gè)雜交瘤的細(xì)胞培養(yǎng)上清液和小鼠 IgG2b，K，在4°C反應(yīng)20分鐘。用FACS緩沖液洗涂細(xì)胞，隨后添加PE標(biāo)記抗-小鼠IgG抗 體，在4°C反應(yīng)20分鐘。用FACS緩沖液洗涂細(xì)胞，隨后添加APC標(biāo)記抗-BDCA2抗體的10 倍稀釋物50 y L，在4°C反應(yīng)20分鐘。用FACS緩沖液洗涂細(xì)胞，隨后將其重息浮于300 y L 的FACS緩沖液中，利用FACS Calibur炬D)進(jìn)行分析。mpllG9. 6抗體顯示對(duì)pDC的結(jié)合（圖 10)。
[0370]此外，9 個(gè)類型的 PLD4 抗體 3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11 和 14C1 顯示對(duì)于pDC細(xì)胞群的特異性結(jié)合反應(yīng)，所述pDC細(xì)胞是抓CA2陽(yáng)性細(xì)胞（圖13)。
[037。 A-6)抗-PLD4抗體對(duì)猴的交叉反應(yīng)性
[0372] 使用食蟹猴PLD4-CT125穩(wěn)定細(xì)胞株和恒河猴PLD4-293T瞬時(shí)轉(zhuǎn)染子細(xì)胞的雜交 瘤的FACS篩選
[0373] 利用FACS評(píng)價(jià)產(chǎn)生獲自HAT選擇培養(yǎng)的融合脾細(xì)胞的每一個(gè)克隆的抗體。將 2X IO5個(gè)人PLD4-CT125與50 y L的每一個(gè)下述雜交瘤的培養(yǎng)上清液在4°C反應(yīng)15分鐘。 用FACS緩沖液（1% FBS+PBS)洗涂細(xì)胞2次，隨后離也，取出上清液。使用陽(yáng)標(biāo)記抗-小 鼠IgG抗體炬D Bioscience :550589)作為第二抗體在4°C反應(yīng)20分鐘。作為其結(jié)果，10 個(gè)類型的PLD4抗體中有7個(gè)類型的抗體384、587、784、1304、13化1、14(：1和1169.6與食蟹 猴PLD4-CT125細(xì)胞和恒河猴PLD4-293T細(xì)胞良好反應(yīng)（圖15,圖16和圖17)。
[0374] A-7)抗-PLD4抗體對(duì)猴PBMC的交叉反應(yīng)性
[037引 使用 96% Ficol^化que (商標(biāo)）化US (GE Healthcare 公司，Cat No. 17-1440-02) 利用比重從外周血（10血:SHIN NIPPON BIOMEDICAL LABORATORIES, LTD.)離也恒河猴的 PBMC。對(duì)于FACS,每樣品使用5X IO5個(gè)細(xì)胞。用FACS緩沖液洗涂細(xì)胞，隨后添加10 y L 的10%的利用FACS緩沖液稀釋的食蟹猴血清，在4°C反應(yīng)20分鐘。用FACS緩沖液洗涂細(xì) 胞，隨后添加IOOy L的每一個(gè)雜交瘤的細(xì)胞培養(yǎng)上清液和IOy g/血的小鼠IgG2a，K或 小鼠IgGl, K，在4°C反應(yīng)15分鐘。用FACS緩沖液洗涂細(xì)胞，隨后添加1 y g/mL的APC標(biāo) 記抗-小鼠IgG抗體，在4°C反應(yīng)20分鐘。用FACS緩沖液洗涂細(xì)胞，隨后添加FITC標(biāo)記 抗-譜系1抗體、陽(yáng)標(biāo)記抗-CD123抗體和化rCP-切5. 5標(biāo)記抗-HLA-DR抗體的10倍稀釋 物25 y L，在4°C進(jìn)行15分鐘。用FACS緩沖液洗涂細(xì)胞，隨后重息浮于300 y L的FACS緩 沖液中，用FACS calibur進(jìn)行分析。使用的雜交瘤培養(yǎng)上清液特異于PLD4,選擇與CAkl 細(xì)胞或人 pDC 良好結(jié)合的 10 種類型；3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1 和 11G9. 6。作為其結(jié)果，5個(gè)類型的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液即5B7、7B4、13D4、13H11和14C1特 異性結(jié)合食蟹猴的pDC細(xì)胞群（譜系-CD123+HLA-DR+)(圖18)。
[0376] A-8)通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行的雜交瘤的克隆
[0377] 1)通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行的克隆和第2次篩選
[0378] 為了 克隆經(jīng)選擇的 9 個(gè)類型（3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11 和 14C1)的雜交瘤（除11G9. 6雜交瘤外），進(jìn)行有限稀釋。將有限稀釋物接種在2塊96孔板 上。接種后6天，在顯微鏡下觀察細(xì)胞，收集所有孔中作為單克隆來(lái)源的并且顯示良好生長(zhǎng) 的培養(yǎng)上清液。W收集的培養(yǎng)上清液作為樣品進(jìn)行FACS分析。
[0379] 在FACS分析中，使用每一個(gè)克隆的培養(yǎng)上清液來(lái)對(duì)細(xì)胞株CAL-I的表面抗原進(jìn)行 染色，隨后將PE標(biāo)記抗-小鼠IgG抗體炬D Bioscience :550589)用作第二抗體來(lái)染色。 作為每一個(gè)克隆的培養(yǎng)上清液，將有限稀釋物接種后7天的培養(yǎng)液用作原始倍數(shù)。
[0380] 2)克隆和第3次篩選
[0381] 基于第2次篩選的FACS分析結(jié)果和每一個(gè)孔中的細(xì)胞狀態(tài)，從每一個(gè)克隆選擇1 個(gè)孔，再次進(jìn)行有限稀釋。如2)類似地進(jìn)行有限稀釋，W收集的培養(yǎng)上清液作為樣品進(jìn)行 FACS分析（第3次）?；贔ACS分析數(shù)據(jù)等，通過(guò)有限稀釋法克隆了下列9個(gè)類型（3B4、 5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11和14C1)的克隆，并將抗-人PLD4抗體生成雜交瘤 建立為穩(wěn)定細(xì)胞株。
[0382] 3)至單個(gè)11G9. 6雜交瘤的轉(zhuǎn)化
[038引收集11G9. 6雜交瘤而非上述9個(gè)類型，用分選緩沖液（1% FBS/PB巧將其息浮至 lXl05個(gè)細(xì)胞/mL。使用FACS Aria炬D)進(jìn)行單細(xì)胞分選。整合數(shù)據(jù)，將整合的數(shù)據(jù)產(chǎn)生 為X軸：FSC和Y軸；SSC的二維點(diǎn)陣圖。在點(diǎn)陣圖上，用口（gate)包圍活細(xì)胞。將口覆蓋 W從活細(xì)胞口中的細(xì)胞排除雙聯(lián)體，分離細(xì)胞群體，將其置于96孔平板中至為1個(gè)細(xì)胞/ 孔。將單細(xì)胞分選后的細(xì)胞培養(yǎng)在HAT培養(yǎng)基（RPMI1640+2mM k谷氨醜胺，10化it/mL青 霉素-鏈霉素，IOmM肥陽(yáng)S，ImM丙麗酸軸，50 y M 2-ME) +雜交瘤生長(zhǎng)補(bǔ)充劑HFCS (Roche 公司）中。隨后，使用雜交瘤的細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)CAL-I細(xì)胞、人PLD4-CT125表達(dá)穩(wěn)定細(xì) 胞株、人PBMC和猴PLD4-CT125表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行染色，選擇單個(gè)雜交瘤的11G9. 6。
[0384] 4)冷凍細(xì)胞小瓶的制備和培養(yǎng)上清液的收集
[0385] 基于上述FACS分析結(jié)果和每一個(gè)孔的細(xì)胞狀態(tài)，從每一個(gè)克隆選擇1個(gè)孔。對(duì)于 選擇的孔，W 50mL規(guī)模進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。培養(yǎng)基為包含10% FCS和青霉素-鏈霉素的RPMI 1640。將細(xì)胞培養(yǎng)至亞匯合，冷凍，W IX IO6個(gè)細(xì)胞/管的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行保藏。作為用于 冷凍和保藏的液體，使用BAMBANKER(NIPPON Genetics, Co. Ltd.)。此外，收集和保藏此時(shí)的 培養(yǎng)上清液。
[0386] 實(shí)施例4
[0387] 抗體的純化
[038 引 通過(guò)使用蛋白 A 親和柱（rProtein A Se 地 arose Fast Flow (catalog No. 17-1279-01，GE Healthcare公司）的純化從雜交瘤的培養(yǎng)上清液獲得10個(gè)類型（3B4、 5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1 和 11G9. 6)的純化的抗體。使用 Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司）確認(rèn)同種型。 作為其結(jié)果，3B4和14C1為小鼠IgGl，K，l0C3為小鼠IgG2a，K，其它為小鼠IgG2b，K。進(jìn) 行內(nèi)毒素濃度的測(cè)量，因?yàn)槿绻麅?nèi)毒素包含在純化的抗體中，則其可對(duì)性質(zhì)測(cè)定試驗(yàn)的結(jié) 果具有影響。使用的試劑盒為化dospecy ES-50M set、Toxicolor DIA-MP set和內(nèi)毒素標(biāo) 準(zhǔn)CSE-L set (SEIKAGAKU BIOBUSI肥SS CORPORATION公司）。作為其結(jié)果，任何純化的抗體 的內(nèi)毒素濃度為作為參照值的0. 3抓/mg或更少的Ab。
[0389] 純化的抗體的反應(yīng)性的檢查
[0390] 利用為人pDC樣細(xì)胞株的CAL-I細(xì)胞確認(rèn)純化的抗體的結(jié)合能力。作為結(jié)果，可 確認(rèn)任何抗體維持對(duì)細(xì)胞表面上的人PLD4的結(jié)合能力（圖11)。此外，抗體還特異性結(jié)合 人外周血的pDC細(xì)胞群炬DCA化）（圖13)。
[0391] 純化的PLD4抗體的Kd值的計(jì)算
[0392] 對(duì)于純化的抗體的結(jié)合能力，將人PLD4-CT125表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株在低濃度至高濃 度化OOl y g/mL至30 y g/mL)的純化的PLD4抗體濃度上反應(yīng)至幾乎100%的陽(yáng)性染色率。 使用Graph Pad Prism第5版軟件對(duì)染色陽(yáng)性的細(xì)胞的頻率和抗體進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，WnM為 單位計(jì)算解離常數(shù)摩爾濃度（Kd值）。根據(jù)抗-PLD4抗體的Kd值（nM)都為InM或更小或差 不多InM (除2個(gè)克隆3B4和14C1外）的事實(shí)，抗-PLD4抗體非常強(qiáng)地結(jié)合人PLD4-CT125 細(xì)胞（圖19)。
[039引 連施例5
[0394] 抗-PLD4抗體對(duì)于表達(dá)人PLD4-CT125細(xì)胞的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性活性
[0395] 使用未成熟兔血清作為補(bǔ)體來(lái)源針對(duì)表達(dá)人PLD4的CT125細(xì)胞穩(wěn)定株（在下 文中，稱為化PLD4-CT-125)測(cè)量抗-PLD4抗體的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性活性（在下文中， 稱為CDC活性）?；钚缘闹笜?biāo)為從由細(xì)胞釋放的乳糖酶脫氨酶（LDH)的測(cè)量值計(jì)算的細(xì) 胞毒性。將每一種細(xì)胞W 2X IO4個(gè)細(xì)胞/50 y L/孔分配至96孔U底板。在CDC培養(yǎng)基 (RPMI1640+0. 1% BSA+lOmM肥陽(yáng)S+2mM心谷氨醜胺+1%化n-Strep)中制備1%幼兔補(bǔ) 體仰DARLANE公司）。給細(xì)胞添加IOy g/mL的小鼠同種型對(duì)照抗體（小鼠IgG2b，K )和 10 個(gè)類型的抗-PLD4 小鼠純化抗體（3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1 和 11G9. 6)，反應(yīng) 1 小時(shí)。關(guān)于測(cè)定系統(tǒng)，使用切toTox 96Non-Radioactive 切totoxicity Assay(Promega公司）試劑盒。作為其結(jié)果，對(duì)于祀細(xì)胞HuPLD4-CT-125,8個(gè)類型的PLD4 抗體巧 B7、7B4、8Cll、10C3、llD10、13D4、13Hll和llG9.6)在10yg/mL的抗體濃度上顯示 約33. 5%至71. 1%的CDC活性（除2個(gè)類型的其重鏈同種型為小鼠IgGl的PLD4抗體3B4 和14C外）（圖20)。
[0396] 實(shí)施例6
[0397] 濃度依賴性、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性活性
[0398] 將抗-PLD4抗體（11G9. 6)的小鼠同種型對(duì)照抗體（小鼠IgG2b，K )、抗-PLD4小 鼠抗體（mpllG9. 6Ab)、人同種型對(duì)照抗體（人IgGl, K )和抗-PLD4嵌合抗體（chllG9Ab) 調(diào)整至0. 1 y g/mL至30 y g/mL的總共6個(gè)點(diǎn)的抗體濃度。作為測(cè)定系統(tǒng)，使用切toTox 96Non-Radioactive切totoxicity Assay(Promega公司）試劑盒。作為其結(jié)果，對(duì)于革己細(xì) 胞11證〇)4-口'-125，11^1169.646在311肖/血的抗體濃度上顯示約70%的濃度依賴性〔0(：活 性。在另一方面，作為嵌合抗體的chllG9Ab甚至在30y g/mL的高濃度上顯示10%或更小 的CDC活性（圖21)。
[039引 連施例7
[0400] 嵌合抗體的制備
[0401] 將10個(gè)類型制備為產(chǎn)生小鼠抗-PLD4抗體的雜交瘤，并使用。
[0402] 1.恒定區(qū)的同種型的確認(rèn)
[0403] 確認(rèn)從產(chǎn)生抗-PLD4抗體的雜交瘤產(chǎn)生的小鼠抗-PLD4抗體的恒定區(qū)的同種型。 使用 Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping 試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公 司）從 10 個(gè)類型（3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1 和 11G9. 6)的雜交瘤 的培養(yǎng)上清液確認(rèn)同種型。作為其結(jié)果，3B4和14C1為小鼠IgGl和小鼠IgK，10C3為小鼠 IgG2a和小鼠IgK，其它為小鼠IgG化和小鼠IgK。
[0404] 2.編碼小鼠抗-PLD4抗體的可變區(qū)的cDNA的克隆
[040引 2-1)總RNA的分離
[0406] 按照試劑盒所附說(shuō)明書，使用商購(gòu)可得試劑盒"RNeasy Mini試劑盒"(Qiagen公 司，catalog No. :74106)從11G9. 6雜交瘤分離總RNA。從細(xì)胞數(shù)目為5X IO6個(gè)的雜交瘤 細(xì)胞株制備其，獲得約79 y g總RNA。
[0407] 2-2)編碼小鼠重鏈可變區(qū)的CDNA的擴(kuò)增和片段化
[040引使用5y g在2-1)中分離的總RNA，通過(guò)5'RACE PCR法擴(kuò)增編碼小鼠重鏈可變區(qū) 的cDNA。在擴(kuò)增中，使用商購(gòu)可得試劑盒"5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, 2.0 版試劑盒"（Invitrogen 公司，catalog No. :18374-058)。細(xì)節(jié)如下。首 先，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶從2-1)中獲得的總RNA合成單鏈cDNA。此時(shí)，使用的反義引物佑SP1)如 下。取決于每一條小鼠重鏈的同種型，不同地使用CDNA擴(kuò)增中使用的GSPl引物。
[0409] 例如，在具有小鼠IgGl重鏈的3B4和14C1雜交瘤的重鏈可變區(qū)的克隆中，使用下 列反義引物。
[0410] GSPl 引物；mu IgGlVH-GSPl
[0411] 序列；5' -CCA GGA GAG TGG GAG AGG CTC TTC TCA GTA TGG TGG-3'（36-聚體） (SEQ ID NO ：64)
[0412] GSP2 引物：mu IgGlVH-GSP2
[0413] 序列；5' -GGC TCA GGG AAA TAG CCC TTG ACC AGG CAT CC-3,（32-聚體）（SEQ ID NO ;化）
[0414] 在具有小鼠IgG2a重鏈的10C3雜交瘤的重鏈可變區(qū)的克隆中，使用下列反義引 物。
[04巧]GSPl 引物：mu IgGHy I-GSPl
[041 引 序列：5, TCC AGA GTT CCA GGT CAC TGT CAC 3'（24-聚體）（SEQ ID NO ;66)
[0417] GSP2 引物：mu IgGHy 1-GSP2
[041 引 序列：5, AGG GGC CAG TGG ATA GAC AGA TGG 3'（24-聚體）（SEQ ID NO ;67)
[0419] 在具有小鼠 IgG化重鏈的 5B7、7B4、8C11、11D10、13D4、13H11 和 11G9. 6 雜交瘤的 重鏈可變區(qū)的克隆中，使用下列反義引物。
[0420] GSPl 引物；mu IgGHy 2B-GSP1
[04引]序列：5, TCC AGA GTT CCA AGT CAC AGT CAC 3'（24-聚體）（SEQ ID NO ;68)
[0422] GSP2 引物：mu IgGH Y 2B-GSP2
[0423] 序列：5, AGG GGC CAG TGG ATA GAC TGA TGG 3'（24-聚體）（SEQ ID NO ;69)
[0424] 此外，使用末端脫氧核巧醜轉(zhuǎn)移酶（TdT)向單鏈CDNA的3'末端添加為核巧酸同 聚物的dC。隨后，使用在3'末端具有與dC(銷定序列）互補(bǔ)的核巧酸聚合物的銷定引物 (SEQ ID N0;70)和反義引物佑SP2)通過(guò)PCR法擴(kuò)增cDNA。此外，使用獲得的PCR產(chǎn)物作 為模板和使用AUAP引物（SEQ ID NO ;71)和表1中顯示的反義引物佑SP2)，通過(guò)巢式PCR 法擴(kuò)增cDNA。此外，通過(guò)1. 5 %的低烙點(diǎn)瓊脂糖法純化該P(yáng)CR產(chǎn)物。
[042引用于5' RACE的銷定引物（SEQ ID NO ;70)
[0426] 5' -GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3' 36-聚體）
[0427] 用于 5' RACE 的 AUAP 引物（SEQ ID NO ;71)
[0428] 5, -GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3, 20-聚體）
[0429] 2-3)編碼小鼠輕鏈可變區(qū)的CDNA的擴(kuò)增和片段化
[0430] 與2-。類似地，從在2-1)中分離的總RNA擴(kuò)增編碼小鼠輕鏈可變區(qū)的cDNA。此 時(shí)，取決于每一條小鼠輕鏈的同種型，不同地使用用于CDNA擴(kuò)增的GSPl引物。
[0431] 由于10個(gè)類型的PLD4抗體具有小鼠IgK輕鏈，因此將下列反義引物用于輕鏈克 隆。
[0432] GSPl 引物：mu IgG VLk -GSPl
[0433] 序列；5,-CAC TAC TTC CTG TTG AAG CTC TTG ACG ATG G-3,（31-聚體）（SEQ ID NO ：72)
[0434] GSP2 引物：mu IgG VLk -GSP2
[04巧]序列；5' -GTG AGT GGC CTC ACA GGT ATA GC-3,（23-聚體）（SEQ ID NO ;7：3)
[0436] 通過(guò)1. 5%的低烙點(diǎn)瓊脂糖法純化獲得的PCR產(chǎn)物。
[0437] 2-4) CDNA堿基序列的確認(rèn)和CDR區(qū)的確定
[0438] 按照試劑盒所附說(shuō)明書，使用商購(gòu)可得試劑盒"Zero Blunt TOPO PCR Cloning 試劑盒"（Invitrogen 公司，catalog No. :1325137),利用pCR4Blunt-T0P0 載體分別克隆 2-2)中獲得的重鏈可變區(qū)和2-3)中獲得的輕鏈可變區(qū)的cDNA片段，將克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞W獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。從該轉(zhuǎn)化子獲得質(zhì)粒，將質(zhì)粒DNA樣品送至 Operon Biotechnology Co. Ltd公司（Tokyo)進(jìn)行序列分析，確認(rèn)質(zhì)粒中的cDNA堿基序列。 在序列分析中，使用"Sequencher DNA sequence assembly and analysis 軟件 4. 2. 2 版 (Gene Codes Co 巧 oration)"和"GE 肥 TYX-MAC 11. I. I 版軟件（GE 肥 TYX CORPORATION)"的 軟件。
[0439] 提取正確序列的轉(zhuǎn)錄物，不包括無(wú)活性RNA的轉(zhuǎn)錄物（因?yàn)橐拼a、無(wú)義突變等 存在于互補(bǔ)決定區(qū)（在下文中稱為"CDR區(qū)"）的周圍）。此外，對(duì)于質(zhì)粒中包含的CDNA 堿基序列，確認(rèn)與免疫球蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性（I濁LAST,冊(cè)L ；www. ncbi. nlm. nih. rov/ I油last/)，按照K油at編號(hào)系統(tǒng)的分析方法化油at尊人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242,第 5 片反，united States Department of Health and Human Services, Bethesda, MD)，測(cè)定每 一個(gè)可變區(qū)中的CDR區(qū)（CDR:CDR1、CDR2和CDR3)、FW區(qū)（構(gòu)架區(qū)）和可變區(qū)的序列。
[0440] 獲得的小鼠11G9. 6抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;74,氨基酸序列 為SEQ ID NO ;75。小鼠11G9. 6抗體的重鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分 別為沈Q ID NO ;2、SEQ ID NO ;3 和沈Q ID NO ;4。
[0441] 獲得的小鼠3B4抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;76,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;77。小鼠3B4抗體的重鏈可變區(qū)的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;8、SEQ ID NO ;9 和沈Q ID NO ; 10。
[0442] 獲得的小鼠5B7抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;78,氨基酸序列為 SEQ ID N0;79。小鼠地7抗體的重鏈可變區(qū)的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO; 14、沈Q ID NO; 15 和沈Q ID NO; 16。
[0443] 獲得的小鼠7B4抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;80,氨基酸序列為 SEQ ID N0;81。小鼠7B4抗體的重鏈可變區(qū)的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO; 14、SEQ ID NO; 15和SEQ ID NO; 16。7B4抗體為具有與地7抗體的重鏈和輕鏈可變 區(qū)CDR序列相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)CDR序列的抗體。
[0444] 獲得的小鼠8C11抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;82,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;83。小鼠8C11抗體的重鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為 沈Q ID NO ;20、沈Q ID NO ;21 和沈Q ID NO ;22。
[044引獲得的小鼠10C3抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;84,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;85。小鼠10C3抗體的重鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為 沈Q ID NO ;26、沈Q ID NO ;27 和沈Q ID NO ;28。
[0446] 獲得的小鼠IlDlO抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;86,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;87。小鼠IlDlO抗體的重鏈可變區(qū)的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為 SEQ ID NO ;26、SEQ ID NO ;27 和 SEQ ID NO ;28。IlDlO 抗體為具有與 10C3 抗體的重鏈相 同的輕鏈可變區(qū)CDR序列的抗體。然而，重鏈同種型（10C3為小鼠IgG2a的恒定區(qū)，IlDlO 為小鼠IgG化的恒定區(qū)）不同。
[0447] 獲得的小鼠13D4抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;88,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;89。小鼠13D4抗體的重鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為 沈Q ID NO ;32、沈Q ID NO ;33 和沈Q ID NO ;34。
[0448] 獲得的小鼠13化1抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;90,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;91。小鼠13H11抗體的重鏈可變區(qū)的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為 沈Q ID NO ;38、沈Q ID NO ;39 和沈Q ID NO ;40。
[0449] 獲得的小鼠14C1抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;92,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;93。小鼠14C1抗體重鏈可變區(qū)的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;38、SEQ ID NO ;39和SEQ ID NO ;40。14C1抗體為具有與13H11抗體的重鏈和輕鏈 可變區(qū)的CDR序列相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)的CDR序列的抗體。然而，重鏈同種型（13H11 為小鼠IgG化的恒定區(qū)，14C1為小鼠IgGl的恒定區(qū)）是不同的。
[0450] 小鼠11G9. 6抗體的輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;94,氨基酸序列為SEQ ID NO ;95。小鼠11G9. 6抗體的輕鏈可變區(qū)的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;5、SEQ ID NO ;6 和沈Q ID NO ;7。
[045。 小鼠3B4抗體的輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;96,氨基酸序列為SEQ ID NO ;97。小鼠3B4抗體的輕鏈可變區(qū)的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO : 11、沈Q ID N0;12 和沈Q ID N0;13。
[045引小鼠地7抗體的輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;98,氨基酸序列為SEQ ID NO ;99。小鼠地7抗體的輕鏈可變區(qū)的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO : 17、沈Q ID N0;18 和沈Q ID N0;19。
[0453] 小鼠7B4抗體的輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ; 100,氨基酸序列為SEQ ID NO ;101。小鼠7B4抗體的輕鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID N0;17、沈Q ID N0;18 和沈Q ID N0;19。
[0454] 小鼠8C11抗體的輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;102,氨基酸序列為SEQ ID NO ;103。小鼠8C11抗體的輕鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID N0;23、沈Q ID N0;24 和沈Q ID N0;25。
[045引小鼠10C3抗體的輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;104,氨基酸序列為SEQ ID NO ;105。小鼠10C3抗體的輕鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID N0;29、沈Q ID N0;30 和沈Q ID N0;31。
[045引小鼠IlDlO抗體的輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;106,氨基酸序列為SEQ ID NO ;107。小鼠IlDlO抗體的輕鏈可變區(qū)的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;29、沈Q ID NO ;30 和沈Q ID NO ;31。
[0457] 小鼠13D4抗體的輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;108,氨基酸序列為SEQ ID NO ;109。小鼠13D4抗體的輕鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;35、沈Q ID NO ;36 和沈Q ID NO ;37。
[045引小鼠13化1抗體的輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;100,氨基酸序列為SEQ ID NO ;111。小鼠13H11抗體的輕鏈可變區(qū)的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;41、沈Q ID NO ;42 和沈Q ID NO ;43。
[0459] 小鼠14C1抗體的輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO ;112,氨基酸序列為SEQ ID NO ;113。小鼠14C1抗體的輕鏈可變區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;41、沈Q ID NO ;42 和沈Q ID NO ;43。
[0460] 3.嵌合抗體11G9. 6的表達(dá)載體的制備
[0461] 3-1.編碼人Ig恒定區(qū)的cDNA的克隆
[0462] 按照試劑盒所附說(shuō)明書，使用商購(gòu)可得試劑盒"Zero Blunt TOPO PCR Cloning試 劑盒"（由 Invitrogen 公司生產(chǎn)的，catalog No. :1325137),分別用 pCR4Blunt-T0P0 載 體從人PBMC的總RNA克隆人IgGl重鏈恒定區(qū)和人Ig K輕鏈恒定區(qū)的cDNA，將其轉(zhuǎn)化至 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞W獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。從該轉(zhuǎn)化子獲得質(zhì)粒，將質(zhì)粒DNA樣品送至 Operon Biotechnology Co. Ltd(Tokyo)進(jìn)行序列分析，確認(rèn)質(zhì)粒中的cDNA堿基序列。
[046引 3-2.編碼嵌合PLD4抗體的重鏈的cDNA的制備
[0464] 通過(guò)與具有在2-2中獲得的小鼠11G9. 6抗體的重鏈可變區(qū)和人IgGl的重鏈恒定 區(qū)的祀E6. 4載體表達(dá)載體的連接來(lái)制備編碼嵌合PLD4抗體的重鏈的cDNA。利用PCR法擴(kuò) 增小鼠11G9. 6抗體的重鏈可變區(qū)，獲得約450個(gè)堿基長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物。此時(shí)，引物是如表 1中顯示的。通過(guò)1. 5%的低烙點(diǎn)瓊脂糖法純化獲得的PCR產(chǎn)物。
[0465] [表 1]
[0466] 表 1
[0467]

【權(quán)利要求】
1. 一種結(jié)合磷脂酶D4(PLD4)蛋白的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段。
2. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有作為 CDR1的序列SYWMH、作為CDR2的序列DIYPGSDSTNYNEKFKS以及作為CDR3的序列GGWLDAMDY。
3. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū)中具有作為 CDR1的序列RASQDISNYLN、作為CDR2的序列YTSRLHS，以及作為CDR3的序列QQGNTLPW。
4. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有作為 CDR1的序列SYWMH、作為CDR2的序列DIYPGSDSTNYNEKFKS以及作為CDR3的序列GGWLDAMDY， 并且在輕鏈可變區(qū)中具有作為CDR1的序列RASQDISNYLN、作為CDR2的序列YTSRLHS以及作 為 CDR3 的序列 QQGNTLPW。
5. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有作為 CDR1的序列TYWMH、作為CDR2的序列MYPGNSETSYNQKFKG以及作為CDR3的序列GYSDFDY。
6. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū)中具有作為 CDR1的序列HASQGIRSNIG、作為CDR2的序列HGTNLED以及作為CDR3的序列VQYVQFP。
7. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有作為 CDR1的序列TYWMH、作為CDR2的序列MYPGNSETSYNQKFKG以及作為CDR3的序列GYSDFDY， 并且在輕鏈可變區(qū)具有作為CDR1的序列HASQGIRSNIG、作為CDR2的序列HGTNLED以及作為 CDR3 的序列 VQYVQFP。
8. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有 作為CDR1的序列DYNLH、作為CDR2的序列HYPYNGNTGYNQKFKR以及作為CDR3的序列 GGIYDDYYDYAIDY。
9. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū)中具有作為 CDR1的序列RASENIYSHIA、作為CDR2的序列GATNLAH以及作為CDR3的序列QHFWGTP。
10. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有 作為CDR1的序列DYNLH、作為CDR2的序列HYPYNGNTGYNQKFKR以及作為CDR3的序列 GGIYDDYYDYAIDY，并且在輕鏈可變區(qū)中具有作為CDR1的序列RASENIYSHIA、作為CDR2的序 列GATNLAH以及作為CDR3的序列QHFWGTP。
11. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有 作為⑶R1的序列SYYLY、作為⑶R2的序列LINPTNSDTIFNEKFKS以及作為⑶R3的序列 EGGYGYGPFAY(8C11 抗體）。
12. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū)中具有 作為⑶R1的序列TSSQTLVHSNGNTYLH、作為⑶R2的序列KVSNRFS以及作為⑶R3的序列 HSTHVP。
13. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有 作為⑶R1的序列SYYLY、作為⑶R2的序列LINPTNSDTIFNEKFKS以及作為⑶R3的序列 EGGYGYGPFAY，并且在輕鏈可變區(qū)具有作為CDR1的序列TSSQTLVHSNGNTYLH、作為CDR2的序 列KVSNRFS以及作為CDR3的序列HSTHVP。
14. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有 作為CDR1的序列SYGMS、作為CDR2的序列TISSGGSYRYPESVKG以及作為CDR3的序列 LYGGRRGYGLDY。
15. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū)中具有 作為CDR1的序列RSSKSLLHSDGITYLY、作為CDR2的序列QMSNLAS以及作為CDR3的序列 AQNLEL。
16. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有 作為CDR1的序列SYGMS、作為CDR2的序列TISSGGSYRYPESVKG以及作為CDR3的序列 LYGGRRGYGLDY，并且在輕鏈可變區(qū)具有作為CDR1的序列RSSKSLLHSDGITYLY、作為CDR2的序 列QMSNLAS以及作為CDR3的序列AQNLEL。
17. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有 作為CDR1的序列SHYYWT、作為CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作為CDR3的序列 EGPLYYGNPYffYFDV〇
18. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū)中具有作 為CDR1的序列RASQDIDNYLN、作為CDR2的序列YTSRLHS以及作為CDR3的序列QQFNTLP。
19. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有 作為CDR1的序列SHYYWT、作為CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作為CDR3的序列 EGPLYYGNPYWYFDV，并且在輕鏈可變區(qū)中具有作為⑶R1的序列RASQDIDNYLN、作為⑶R2的序 列YTSRLHS以及作為CDR3的序列QQFNTLP。
20. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有 作為⑶R1的序列SHYYWS、作為⑶R2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作為⑶R3的序列 EGPLYYGNPYffYFDV〇
21. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在輕鏈可變區(qū)中具有作 為CDR1的序列RASQDIDNYLN、作為CDR2的序列YTSRLHS以及作為CDR3的序列QQFNTLP。
22. 權(quán)利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其在重鏈可變區(qū)中具有 作為⑶R1的序列SHYYWS、作為⑶R2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作為⑶R3的序列 EGPLYYGNPYWYFDV，并且在輕鏈可變區(qū)具有作為⑶R1的序列RASQDIDNYLN、作為⑶R2的序列 YTSRLHS以及作為CDR3的序列QQFNTLP。
23. -種單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其由在登錄號(hào)：NITE BP-121UNITE BP-1212、NITE BP-1213 和 NITE BP-1214 下保藏的雜交瘤 mp5B7、mp7B4、mpl3D4 和 mpl3Hll 之任一個(gè)產(chǎn)生。
24. -種雜交瘤，其產(chǎn)生權(quán)利要求1或2的單克隆抗體之任一個(gè)。
25. 雜交瘤 mp5B7、mp7B4、mpl3D4 或 mpl3Hll，其在登錄號(hào)：NITE BP-1211、NITE BP-1212、NITE BP-1213 或 NITE BP-1214 下進(jìn)行了保藏。
26. -種制備單克隆抗體的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求25的雜交瘤：和從培養(yǎng)物收集單 克隆抗體。
27. -種制備產(chǎn)生結(jié)合PLD4的單克隆抗體的細(xì)胞的方法，包括下列過(guò)程： 1) 給免疫動(dòng)物施用編碼包含PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的重組PLD4-Ig融合蛋 白的過(guò)程，和 2) 從免疫動(dòng)物的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞選擇產(chǎn)生結(jié)合PLD4的抗體的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的過(guò) 程。
28. 權(quán)利要求27的方法，其中表達(dá)PLD4的細(xì)胞是以可表達(dá)的方式保留編碼包含PLD4 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的外源性多核苷酸的細(xì)胞。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中所述細(xì)胞為人來(lái)源的細(xì)胞。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中所述人來(lái)源的細(xì)胞為HEK-293T細(xì)胞。
32. 權(quán)利要求27-31的任一項(xiàng)的方法，包括遞增地克隆獲得的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞的過(guò)程。
33. -種制備結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體的方法，包括：培養(yǎng)通過(guò)權(quán)利要求 29的方法獲得的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞：和從培養(yǎng)物收集單克隆抗體。
34. -種識(shí)別PLD4的單克隆抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其能通過(guò)下列過(guò)程獲 得： 1) 給免疫動(dòng)物施用編碼包含PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的重組PLD4-Ig融合蛋 白， 2) 從免疫動(dòng)物的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞選擇產(chǎn)生結(jié)合PLD4的抗體的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞，和 3) 培養(yǎng)過(guò)程2)中選擇的抗體產(chǎn)生性細(xì)胞，和從培養(yǎng)物收集識(shí)別PLD4的抗體。
35. -種用于制備結(jié)合PLD4的抗體的免疫原，其包含（a)以可表達(dá)的方式外源性地保 留編碼包含PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的多核苷酸的動(dòng)物細(xì)胞，或其細(xì)胞膜級(jí)分。
36. 權(quán)利要求35的免疫原，其中所述動(dòng)物細(xì)胞為人來(lái)源的細(xì)胞。
37. -種檢測(cè)漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的方法，其包括：將結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆 抗體或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段與測(cè)試細(xì)胞接觸：和檢測(cè)結(jié)合細(xì)胞的單克隆抗體或包含 其抗原結(jié)合區(qū)的片段。
38. -種用于檢測(cè)漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的試劑，其包含：結(jié)合PLD4細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的單克 隆抗體；或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段。
39. -種抑制漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性的方法，包括：將下述組分的任一種與所述漿 細(xì)胞樣樹突細(xì)胞接觸： (a) 結(jié)合PLD4并抑制漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性的單克隆抗體，或包含其抗原結(jié)合區(qū)的 片段，和 (b) 免疫球蛋白或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了單克隆抗 體（a)的互補(bǔ)決定區(qū)。
40. -種抑制活生物體中的漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性的方法，包括：給活生物體施用 下述組分的任一種： (a) 結(jié)合PLD4并抑制漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性的單克隆抗體，或包含其抗原結(jié)合區(qū)的 片段，和 (b) 免疫球蛋白或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了單克隆抗 體（a)的互補(bǔ)決定區(qū)。
41. 權(quán)利要求39或40的方法，其中漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性是干擾素生成活性和干擾 素生成性細(xì)胞的存活之一，或兩者。
42. -種用于抑制漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性的試劑，其包含：下述組分之任一種作為 活性組分： (a)結(jié)合PLD4并抑制漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的活性的單克隆抗體，或包含其抗原結(jié)合區(qū)的 片段，和 (b)免疫球蛋白或包含其抗原結(jié)合區(qū)的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了單克隆抗 體（a)的互補(bǔ)決定區(qū)。
43.權(quán)利要求42的用于抑制干擾素生成性細(xì)胞的活性的試劑，其中漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞 的活性是干擾素生成活性和干擾素生成性細(xì)胞的存活之一，或兩者。
【文檔編號(hào)】C07K16/40GK104284903SQ201380018285
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月31日
【發(fā)明者】趙民權(quán), 山崎智英, 遠(yuǎn)藤真由木, 石田晃司 申請(qǐng)人:Sbi生物技術(shù)有限公司