人凝血因子輕鏈蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明通過(guò)體外抑菌活性檢測(cè)了人凝血因子輕鏈蛋白抗不同革蘭氏陰性菌的最低抑菌濃度，通過(guò)體內(nèi)抑菌活性檢測(cè)了人凝血因子輕鏈蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制作用，證明了人凝血因子輕鏈蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌具有明顯的抑制作用，以便開(kāi)發(fā)出一類治療革蘭氏陰性菌感染的新型藥物。通過(guò)質(zhì)譜及銀染檢測(cè)證明了人凝血因子輕鏈蛋白對(duì)內(nèi)毒素的水解及清除作用，以便開(kāi)發(fā)出一類治療內(nèi)毒素血癥的新型藥物。所述人凝血因子輕鏈蛋白為人凝血因子VD、IX、X輕鏈蛋白，以及與它們具有50%以上同源性的蛋白。
【專利說(shuō)明】人凝血因子輕鏈蛋白及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及人凝血因子輕鏈蛋白及其在制藥中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 革蘭氏陰性菌泛指在革蘭氏染色反應(yīng)中呈現(xiàn)紅色的細(xì)菌。由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的不 同，在革蘭氏染色過(guò)程中，不同的染料造成了其與革蘭氏陽(yáng)性菌著色的不同（陽(yáng)性菌為紫 色)。革蘭氏陰性菌以大腸桿菌為代表，還有變形桿菌、痢疾桿菌、肺炎桿菌、布氏桿菌、流感 (嗜血）桿菌、副流感(嗜血）桿菌、卡他(摩拉）菌、不動(dòng)桿菌屬等等。該類細(xì)菌的致病能力往 往與其細(xì)胞壁的特殊組分--脂多糖(又叫內(nèi)毒素）相關(guān)。在人體當(dāng)中，脂多糖會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體 產(chǎn)生大量細(xì)胞因子并激活免疫系統(tǒng)，最終形成有機(jī)體對(duì)病原菌的先天性免疫應(yīng)答。例如紅 腫就是細(xì)胞因子大量產(chǎn)生并釋放導(dǎo)致的。
[0003] 在革蘭氏陰性菌感染的治療中，除了清除感染灶及用相應(yīng)的支持對(duì)癥治療外，還 需使用抗生素。目前主要采用的是氨基糖苷類、β_內(nèi)酰胺類等抗生素。這些抗生素對(duì)各 種革蘭氏陰性菌有強(qiáng)大殺菌作用，而且對(duì)于銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌 等常見(jiàn)革蘭氏陰性桿菌都具有較長(zhǎng)時(shí)間的抗生素后效應(yīng)。除了抗生素以外，如前列腺素合 成酶抑制劑、左旋咪唑、吞噬肽等也被用于革蘭氏陰性菌感染的治療。然而，隨著抗生素的 廣泛應(yīng)用，臨床出現(xiàn)的抗生素濫用現(xiàn)象導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性已經(jīng)從單類耐藥發(fā)展成為多重耐 藥，使大量原本能夠有效替代的二線抗生素?zé)o效。其次，抗菌藥物在殺/抑菌的同時(shí)會(huì)誘導(dǎo) 內(nèi)毒素的產(chǎn)生，增加了疾病的治療難度，所以盡管不斷有新的殺傷力強(qiáng)的抗生素問(wèn)世及先 進(jìn)的支持療法出現(xiàn)，革蘭氏陰性菌感染所致的內(nèi)毒素血癥的處理仍是臨床上棘手的問(wèn)題， 尤其是其20?30%的死亡率更是令人難以接受。據(jù)報(bào)道脂多糖是導(dǎo)致革蘭氏陰性菌感染后 發(fā)生的一系列毒性反應(yīng)的主要病源物。雖然抗生素對(duì)清除細(xì)菌具有較好的效果，但對(duì)已游 離于血液中的脂多糖以及由其持續(xù)刺激靶細(xì)胞產(chǎn)生的多種有害細(xì)胞因子無(wú)能為力，所以臨 床選用抗菌藥物時(shí)應(yīng)對(duì)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其誘導(dǎo)內(nèi)毒素釋放的特性進(jìn)行綜合考慮。第三，因 為脂多糖在革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁表面，使得很多舊型抗生素不能有效抑制此類細(xì)菌?；?于這些原因，近年來(lái)人們正在積極開(kāi)拓治療革蘭氏陰性菌感染的新領(lǐng)域。
[0004] 抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs)是指具有抗菌活性的短肽，這類活性肽 多數(shù)具有熱穩(wěn)定性、強(qiáng)堿性及廣譜抗菌等特點(diǎn)。目前人們已經(jīng)從不同的生物體中鑒定出約 2000多個(gè)AMPs，這些AMPs經(jīng)誘導(dǎo)而合成，在機(jī)體抵抗病原體的入侵方面起著重要的作用， 被認(rèn)為是生物非特異性免疫功能的重要防御成分。因此尋找新型抗革蘭氏陰性菌的APMs 成為研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。
[0005] 人凝血因子W (human factor VLhF W)是人體內(nèi)天然存在的蛋白質(zhì)，其分子量約 為50kD。其分子包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域：N末端膜結(jié)合的γ羧基谷氨酸結(jié)構(gòu)域（Gla結(jié)構(gòu)域)，兩 個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域（EGFUEGF2)和一個(gè)C端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。它在人體內(nèi)還存 在一些序列同源性較高的類似物，如人凝血因子IX (human factor IX，hFIX)、人凝血因子X(jué) (human factor X，hFX)等。迄今為止，尚未見(jiàn)以人凝血因子W、人凝血因子IX、人凝血因 子X(jué)三者的輕鏈作為抑菌藥物治療細(xì)菌感染的相關(guān)報(bào)道及制備治療革蘭氏陰性菌所致的 內(nèi)毒素血癥的藥物的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一是提供人工制備的人凝血因子輕鏈蛋白，本發(fā)明的另一目的是 證明所述人凝血因子輕鏈蛋白對(duì)革蘭氏陰性菌具有抑制作用，以便開(kāi)發(fā)出一類治療革蘭氏 陰性菌感染的新型藥物及治療革蘭氏陰性菌所致的內(nèi)毒素血癥的藥物。
[0007] 本發(fā)明所述人凝血因子輕鏈基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO :1所述，或與SEQ ID NO :1所述氨基酸序列具有50%以上的同源性的蛋白。與序列表中 SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列具有50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO :3 所述。
[0008] 或本發(fā)明所述人凝血因子輕鏈基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO :2所述，或與SEQ ID NO :2所述氨基酸序列具有50%以上的同源性的蛋白。與序列 表中SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列具有50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列為序列表中 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :3 所述。
[0009] 或本發(fā)明所述人凝血因子輕鏈基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO :3所述，或與SEQ ID NO :3所述氨基酸序列具有50%以上的同源性的蛋白。與序列 表中SEQ ID NO :3所述的氨基酸序列具有50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列為序列表中 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 所述。
[0010] 氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO :1所述列的人凝血因子輕鏈蛋白命名為 LhF VL氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO :2所述的人凝血因子輕鏈蛋白命名為L(zhǎng)hF IX，氨 基酸序列為序列表中SEQ ID NO :3所述的人凝血因子輕鏈蛋白命名為L(zhǎng)hF X。
[0011] 上述人凝血因子輕鏈基因所編碼的蛋白，由原核重組質(zhì)粒表達(dá)而成，或真核重組 質(zhì)粒表達(dá)而成，或通過(guò)化學(xué)合成制備。
[0012] 本發(fā)明所述人凝血因子輕鏈的原核重組質(zhì)粒、真核重組質(zhì)粒，由序列表中SEQ ID NO :4所述的核苷酸序列或與序列表中SEQ ID NO :4所述的核苷酸序列具有50%以上同源 性的基因分別與原核載體或真核載體構(gòu)建而成。與序列表中SEQ ID NO :4所述的核苷酸序 列具有50%以上同源性的基因的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6所 述。所述原核載體為pET質(zhì)粒系統(tǒng)，包括pET-14b、pET-19b、pET-21a( + )、pET-28a( + )、 pET-42a ( + );所述真核載體為 pcDNA3. I ( + )、pcDNA3. 1 (_)。
[0013] 本發(fā)明所述人凝血因子輕鏈的原核重組質(zhì)粒、真核重組質(zhì)粒，由序列表中SEQ ID NO :5所述的核苷酸序列或與序列表中SEQ ID NO :5所述的核苷酸序列具有50%以上同源 性的基因分別與原核載體或真核載體構(gòu)建而成。與序列表中SEQ ID NO :5所述的核苷酸序 列具有50%以上同源性的基因的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6所 述。所述原核載體為pET質(zhì)粒系統(tǒng)，包括pET-14b、pET-19b、pET-21a( + )、pET-28a( + )、 pET-42a ( + );所述真核載體為 pcDNA3. I ( + )、pcDNA3. 1 (_)。
[0014] 本發(fā)明所述人凝血因子輕鏈的原核重組質(zhì)粒、真核重組質(zhì)粒，由序列表中SEQ ID NO :6所述的核苷酸序列或與序列表中SEQ ID NO :6所述的核苷酸序列具有50%以上同源 性的基因分別與原核載體或真核載體構(gòu)建而成。與序列表中SEQ ID NO :6所述的核苷酸序 列具有50%以上同源性的基因的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所 述。所述原核載體為pET質(zhì)粒系統(tǒng)，包括pET-14b、pET-19b、pET-21a( + )、pET-28a( + )、 pET-42a ( + );所述真核載體為 pcDNA3. I ( + )、pcDNA3. 1 (_)。
[0015] 本發(fā)明所使用的方法：
[0016] (1)通過(guò)PCR反應(yīng)，獲取編碼重組LhFW、LhF IX、LhF X蛋白的基因或與它們具有 50%以上同源性的基因；
[0017] (2)將上述擴(kuò)增的各基因片段分別插入到原核載體或真核載體構(gòu)建原核重組質(zhì)粒 或真核重組質(zhì)粒，再將原核重組質(zhì)?；蛘婧酥亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行培養(yǎng)，然后 篩選出含有正確插入片段的重組質(zhì)粒測(cè)序；
[0018] (3)將測(cè)序結(jié)果正確的原核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入工程菌中進(jìn)行表達(dá)，分離純化表達(dá)的 蛋白即獲得重組LhF W蛋白、LhF IX蛋白、LhF X蛋白或與它們具有50%以上同源性的蛋白； 或?qū)⒄婧酥亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，建立穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行真核表達(dá)，然后分 離純化的蛋白即獲得重組LhF W蛋白、LhF IX蛋白、LhF X蛋白或與它們具有50%以上同源 性的蛋白；
[0019] (4)重組LhF W、LhF IX、LhF X蛋白或與它們具有50%以上同源性的蛋白的體外 抑菌活性檢測(cè)；
[0020] (5)重組LhF W、LhF IX、LhF X蛋白或與它們具有50%以上同源性的蛋白的體內(nèi) 抑菌活性檢測(cè)；
[0021] (6)重組LhF W、LhF IX、LhF X蛋白或與它們具有50%以上同源性的蛋白水解脂 多糖的質(zhì)譜檢測(cè)；
[0022] (7)重組LhF W、LhF IX、LhF X蛋白或與它們具有50%以上同源性的蛋白水解脂 多糖的銀染檢測(cè)；
[0023] 所述原核載體為pET質(zhì)粒系統(tǒng)，所述pET質(zhì)粒系統(tǒng)包括pET-14b、pET-19b、 pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-42a(+)等原核表達(dá)質(zhì)粒；所述真核載體為 pcDNA3. I ( + )、 pcDNA3. 1 (-)等。
[0024] 人凝血因子輕鏈蛋白的化學(xué)合成通常委托專業(yè)公司。
[0025] 本發(fā)明所述LhF W、LhF IX、LhF X蛋白能夠水解革蘭氏陰性菌的脂多糖(又稱內(nèi) 毒素，為革蘭氏陰性菌外膜的主要成分)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，進(jìn)而起到殺菌的作用。同 時(shí)，研究表明輕鏈蛋白與組織因子具有很強(qiáng)的結(jié)合作用。當(dāng)有機(jī)體受到創(chuàng)傷時(shí)，組織因子會(huì) 大量暴露于傷口處，使得輕鏈蛋白隨之聚集在傷口處，起到對(duì)傷口的靶向抑菌作用。體外抑 制革蘭氏陰性菌活性檢測(cè)表明：LhF W、LhF IX、LhF X蛋白體對(duì)革蘭氏陰性菌具有明顯的抑 制作用，它們對(duì)大腸桿菌DH5 α、大腸桿菌BL21、綠膿桿菌、肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、 嗜水氣單胞菌、異型枸櫞酸桿菌、卡他莫拉菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、粘質(zhì)沙雷氏桿 菌的最低抑菌濃度（MIC)如下：
[0026]

【權(quán)利要求】
1. 人凝血因子輕鏈基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO :1所述， 或與SEQ ID NO :1所述氨基酸序列具有50%以上的同源性的蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述人凝血因子輕鏈基因所編碼的蛋白，其特征在于與序列表中 SEQID NO :1所述的氨基酸序列具有50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO :3 所述。
3. 人凝血因子輕鏈基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO :2所述， 或與SEQ ID NO :2所述氨基酸序列具有50%以上的同源性的蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述人凝血因子輕鏈基因所編碼的蛋白，其特征在于與序列表中 SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列具有50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :3 所述。
5. 人凝血因子輕鏈基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO :3所述， 或與SEQ ID NO :3所述氨基酸序列具有50%以上的同源性的蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述人凝血因子輕鏈基因所編碼的蛋白，其特征在于與序列表中 SEQ ID NO :3所述的氨基酸序列具有50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 所述。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述人凝血因子輕鏈基因所編碼的蛋白，其特 征在于由原核重組質(zhì)粒表達(dá)而成，或真核重組質(zhì)粒表達(dá)而成，或通過(guò)化學(xué)合成制備。
8. 權(quán)利要求1至7所述人凝血因子輕鏈基因所編碼的蛋白在制備治療革蘭氏陰性菌感 染的藥物中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1至7所述人凝血因子輕鏈基因所編碼的蛋白在制備治療革蘭氏陰性菌所 致的內(nèi)毒素血癥的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/745GK104211802SQ201310206823
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月29日
【發(fā)明者】宋旭, 陳金武, 廖東升, 馬登佼 申請(qǐng)人:四川大學(xué)