一種檵木中銀椴苷的提取純化方法及檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種檵木中銀椴苷的提取純化方法及檢測(cè)方法，取檵木藥材粉末，60%乙醇回流，提取物采用大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，70%乙醇洗脫物以甲醇溶解，減壓硅膠柱層析，乙酸乙酯/甲醇梯度洗脫，流份A以甲醇溶解，過(guò)濾，沉淀反復(fù)重結(jié)晶，再用乙酸乙酯溶解，進(jìn)行聚酰胺柱層析，乙酸乙酯/甲醇梯度洗脫。反復(fù)ODS柱層析，甲醇水梯度洗脫，再經(jīng)MCI-gel柱層析，甲醇/水梯度洗脫，得銀椴苷。經(jīng)核磁及質(zhì)譜鑒定為銀椴苷C30H26O13，經(jīng)本發(fā)明檢測(cè)方法測(cè)定，含量為96.14%。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種繼木中銀椴苷的提取純化方法及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檣木中銀椴苷的提取純化方法及檢測(cè)方法，特別是涉及一種白花檣木中銀椴苷的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]銀椴苷（11111'081(16)，又名山奈酚-3-0-0-0-(6 ‘’-0-反式-對(duì)羥基桂皮酰基）吡喃葡萄糖苷，是一種黃酮類(lèi)化合物，為黃色針晶，mp. 246~248°C，分子式C3tlH26O13,分子量594. 52。研究顯示銀椴苷在植物中分布比較普遍，在白花檣木、紅花檣木、地桃花、巴西甘薯葉、蜀葵 花、白頭翁地上部分等植物中均有分離得到，其中在白花檣木莖中含量達(dá)0. 018%，白花檣木葉中含量達(dá)0. 13% ;紅花檣木莖中含量達(dá)0. 0018%，紅花檣木葉中含量達(dá)0. 12%。據(jù)報(bào)道，銀椴苷具有較強(qiáng)的抗氧化性、清除自由基活性和抗炎活性，對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的補(bǔ)體途徑顯示出非常有潛力的抗補(bǔ)體活性（IC5(I=5.4X10_5M)，其活性甚至比公認(rèn)的補(bǔ)體系統(tǒng)抑制劑迷迭香酸活性還強(qiáng)。
[0003]銀椴苷的提取分離方法一般都采用95%乙醇回流提取、濃縮后用水混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等非極性溶劑萃取，這些分離純化工藝都需經(jīng)過(guò)反復(fù)柱層析步驟，存在分離時(shí)間長(zhǎng)、重現(xiàn)性差、使用大量有毒溶劑等缺點(diǎn)。本發(fā)明克服了以上現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種從檣木中提取分離高純度的銀椴苷的新方法。同時(shí)建立了其檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種檣木中銀椴苷的提取純化方法及檢測(cè)方法，以克服現(xiàn)有工藝的不足，填補(bǔ)檣木中銀椴苷檢測(cè)的空白，更好地滿(mǎn)足研發(fā)需要。
[0005]為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種檣木中銀椴苷的提取純化方法，其特征在于包括以下步驟：
(1)取檣木藥材，粉碎，以8倍量60%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，減壓干燥；
(2)提取物采用大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，得水洗脫物、10%乙醇洗脫物、70%乙醇洗脫物及95%乙醇洗脫物；
(3)70%乙醇洗脫物，甲醇溶解，硅膠拌樣后進(jìn)行減壓硅膠柱層析，乙酸乙酯/甲醇梯度洗脫，共得10個(gè)流份(Fr. A^J)；
(4)取Fr.A，甲醇溶解，過(guò)濾，沉淀反復(fù)重結(jié)晶得Lor-4，上層溶液，揮干溶劑，再用乙酸乙酯溶解，進(jìn)行聚酰胺柱層析，乙酸乙酯/甲醇梯度洗脫，共得8個(gè)流份（Fr. Af 8)。取Fr. A6反復(fù)ODS柱層析，甲醇/水梯度洗脫，再經(jīng)柱層析，甲醇/水梯度洗脫，即得到高純度銀椴苷。銀椴苷ESI質(zhì)譜圖見(jiàn)附圖1，核磁氫譜圖見(jiàn)附圖2，核磁碳譜圖見(jiàn)附圖3，高效液相色譜圖見(jiàn)附圖4。
[0006]步驟（2)中大孔樹(shù)脂型號(hào)為HPD 400。[0007]步驟（3)中硅膠為100-200目，減壓硅膠為300-400目。
[0008]步驟（3)、（4)中乙酸乙酯/甲醇梯度洗脫比例為：l:(Tl:l。
[0009]步驟（4)中最后階段層析柱型號(hào)為MCI-gel，甲醇/水梯度洗脫比例為：l:(Tl:l。
[0010]采用上述技術(shù)方案的有益效果是：采用乙酸乙酯/甲醇、甲醇/水梯度洗脫，與以往技術(shù)相比，具有分離能力強(qiáng)、樣品損失少、產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)等特點(diǎn)。
[0011]一種檣木中銀椴苷的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：
(1)精密稱(chēng)取上述自制銀椴苷5.13mg,置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取2ml置IOml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得每Iml中含0. 0252mg的溶液，搖勻，得銀椴苷對(duì)照溶液；
(2)取檣木藥材粉碎，過(guò)4號(hào)篩，取白花檣木藥材粉末lg，精密稱(chēng)定，置平底燒瓶瓶中，精密加入甲醇約50ml，稱(chēng)定重量，回流提取I小時(shí)，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)0. 45 ii m微孔濾膜，即供試品溶液。
[0012](3)以上兩種溶液各取10 U I注入高效液相色譜儀測(cè)定，色譜條件為：Waters高效液相色譜儀（Waters2695分離單元,Waters2996 二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站);Cosmosil C18色譜柱（4.6X250_ 5 y m);流動(dòng)相：甲醇-0. 1%磷酸水溶液（55 :45);檢測(cè)波長(zhǎng)320nm ;流速1.0ml/min。在此色譜條件下,銀鍛苷峰型較好,并且能夠較好的分離。以本發(fā)明檢測(cè)方法測(cè)定白花檣木中銀椴苷高效液相色譜圖見(jiàn)附圖5。
[0013]
下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0014]具體實(shí)施例：`
實(shí)施例I:
取白花檣木藥材12 kg，粉碎，以10倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收溶劑，減壓干燥。提取物采用HPD 400大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，得水洗脫物、10%乙醇洗脫物、70%乙醇洗脫物及95%乙醇洗脫物。70%乙醇洗脫物（456. 8 g)，甲醇溶解，100-200目硅膠拌樣后進(jìn)行減壓硅膠（300-400目）柱層析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脫（1:0-1:1 )，共得10個(gè)流份（Fr. A-J)。取Fr. A(75. 2g)，甲醇溶解，過(guò)濾，沉淀反復(fù)重結(jié)晶得Lor_4，上層溶液，揮干溶劑，再用乙酸乙酯溶解，進(jìn)行聚酰胺柱層析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脫（1:0-1:1 )，共得8個(gè)流份（Fr. A1-8)。取Fr. A6反復(fù)ODS柱層析，甲醇水梯度洗脫，再經(jīng)MCI-gel柱層析，甲醇水梯度洗脫，得銀椴苷。經(jīng)本發(fā)明檢測(cè)方法測(cè)定，其含量為95. 22%。
[0015]實(shí)施例2:
取白花檣木藥材12 kg，粉碎，以8倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收溶劑，減壓干燥。提取物采用HPD 400大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，得水洗脫物、10%乙醇洗脫物、70%乙醇洗脫物及95%乙醇洗脫物。70%乙醇洗脫物（365. 4 g)，甲醇溶解，100-200目硅膠拌樣后進(jìn)行減壓硅膠（300-400目）柱層析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脫（1:0-1:1)，共得10個(gè)流份（Fr.A-J)。取Fr.A (60. 15g),甲醇溶解,過(guò)濾,沉淀反復(fù)重結(jié)晶得Lor_4,上層溶液，揮干溶劑，再用乙酸乙酯溶解，進(jìn)行聚酰胺柱層析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脫(1:0-1:1),共得8個(gè)流份（Fr. A1-8)。取Fr. A6反復(fù)ODS柱層析，甲醇水梯度洗脫，再經(jīng)MCI-gel柱層析，甲醇水梯度洗脫，得銀椴苷。經(jīng)本發(fā)明檢測(cè)方法測(cè)定，其含量為95. 38%。
[0016]實(shí)施例3:取白花檣木藥材15 kg，粉碎，以10倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收溶劑，減壓干燥。提取物采用HPD 400大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，得水洗脫物、10%乙醇洗脫物、70%乙醇洗脫物及95%乙醇洗脫物。70%乙醇洗脫物（685. 2 g)，甲醇溶解，100-200目硅膠拌樣后進(jìn)行減壓硅膠（300-400目）柱層析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脫（1:0-1:1)，共得10個(gè)流份（Fr.A-J)。取Fr.A (112. 8g),甲醇溶解,過(guò)濾,沉淀反復(fù)重結(jié)晶得Lor_4,上層溶液，揮干溶劑，再用乙酸乙酯溶解，進(jìn)行聚酰胺柱層析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脫(1:0-1:1),共得8個(gè)流份（Fr. A1-8)。取Fr. A6反復(fù)ODS柱層析，甲醇水梯度洗脫，再經(jīng)MCI-gel柱層析，甲醇水梯度洗脫，得銀椴苷。經(jīng)本發(fā)明檢測(cè)方法測(cè)定，其含量為95. 55%。
[0017]實(shí)施例4: 取白花檣木藥材15 kg，粉碎，以8倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收溶劑，減壓干燥。提取物采用HPD 400大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，得水洗脫物、10%乙醇洗脫物、70%乙醇洗脫物及95%乙醇洗脫物。70%乙醇洗脫物（576. 2 g)，甲醇溶解，100-200目硅膠拌樣后進(jìn)行減壓硅膠（300-400目)柱層析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脫（1:0-1:1 )，共得10個(gè)流份（Fr. A-J)。取Fr. A(98. 8g)，甲醇溶解，過(guò)濾，沉淀反復(fù)重結(jié)晶得Lor_4，上層溶液，揮干溶劑，再用乙酸乙酯溶解，進(jìn)行聚酰胺柱層析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脫（1:0-1:1 )，共得8個(gè)流份（Fr. A1-8)。取Fr. A6反復(fù)ODS柱層析，甲醇水梯度洗脫，再經(jīng)MCI-gel柱層析，甲醇水梯度洗脫，得銀椴苷。經(jīng)本發(fā)明檢測(cè)方法測(cè)定，其含量為95. 73%。
[0018]實(shí)施例5:
取白花檣木藥材17 kg，粉碎，以8倍量60%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，回收溶劑，減壓干燥。提取物采用HPD 400大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，得水洗脫物、10%乙醇洗脫物、70%乙醇洗脫物及95%乙醇洗脫物。70%乙醇洗脫物（516. 2 g)，甲醇溶解，100-200目硅膠拌樣后進(jìn)行減壓硅膠（300-400目）柱層析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脫（1:0-1:1 )，共得10個(gè)流份（Fr. A-J)。取Fr. A (98. 75 g)，甲醇溶解，過(guò)濾，沉淀反復(fù)重結(jié)晶得Lor_4，上層溶液，揮干溶劑，再用乙酸乙酯溶解，進(jìn)行聚酰胺柱層析，乙酸乙酯：甲醇梯度洗脫(1:0-1:1)，共得8個(gè)流份（Fr.Al-8)。取Fr. A6反復(fù)ODS柱層析，甲醇水梯度洗脫，再經(jīng)MCI-gel柱層析，甲醇水梯度洗脫，得銀椴苷。經(jīng)本發(fā)明檢測(cè)方法測(cè)定，其含量為96. 14%。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖I為以本發(fā)明提取純化方法所得銀椴苷ESI質(zhì)譜圖。
[0020]圖2為以本發(fā)明提取純化方法所得銀椴苷核磁氫譜圖。
[0021]圖3為以本發(fā)明提取純化方法所得銀椴苷核磁碳譜圖。
[0022]圖4為以本發(fā)明檢測(cè)方法測(cè)定銀椴苷高效液相色譜圖。
[0023]圖5為以本發(fā)明檢測(cè)方法測(cè)定白花檣木中銀椴苷高效液相色譜圖。
【權(quán)利要求】
1.一種檣木中銀椴苷的提取純化方法及檢測(cè)方法，其特征在于： (1)取檣木藥材，粉碎，以8倍量60%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，減壓干燥； (2)提取物采用大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，得水洗脫物、10%乙醇洗脫物、70%乙醇洗脫物及95%乙醇洗脫物； (3)70%乙醇 洗脫物，甲醇溶解，硅膠拌樣后進(jìn)行減壓硅膠柱層析，乙酸乙酯/甲醇梯度洗脫，共得10個(gè)流份(Fr. A^J)； (4)取Fr.A，甲醇溶解，過(guò)濾，沉淀反復(fù)重結(jié)晶得Lor-4，上層溶液，揮干溶劑，再用乙酸乙酯溶解，進(jìn)行聚酰胺柱層析，乙酸乙酯/甲醇梯度洗脫，共得8個(gè)流份（Fr. Af 8). 取Fr. A6反復(fù)ODS柱層析，甲醇/水梯度洗脫，再經(jīng)柱層析，甲醇/水梯度洗脫，即得到高純度銀椴苷。
2.—種檣木中銀椴苷的檢測(cè)方法，其特征在于： (1)精密稱(chēng)取權(quán)利要求1制備得到的銀椴苷5.13mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取2ml置IOml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得每Iml中含0. 0252mg的溶液，搖勻，得銀椴苷對(duì)照溶液； (2)取檣木藥材粉碎，過(guò)4號(hào)篩，取白花檣木藥材粉末lg，精密稱(chēng)定，置平底燒瓶瓶中，精密加入甲醇約50ml，稱(chēng)定重量，回流提取I小時(shí)，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)0. 45 ii m微孔濾膜，即供試品溶液. (3)以上兩種溶液各取IOiU注入高效液相色譜儀測(cè)定，色譜條件為：Waters高效液相色譜儀（Waters2695分離單元，Waters2996 二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站);Cosmosil C18色譜柱（4.6X250_ 5 y m);流動(dòng)相：甲醇-0. 1%磷酸水溶液（55 :45);檢測(cè)波長(zhǎng)320nm ;流速1.0ml/min.在此色譜條件下,銀鍛苷峰型較好,并且能夠較好的分離。
3.如權(quán)利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：大孔樹(shù)脂型號(hào)為HPD400。
4.如權(quán)利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：硅膠為100-200目，減壓硅膠為300-400 目。
5.如權(quán)利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：乙酸乙酯/甲醇梯度洗脫比例為：1:0~1:1。
6.如權(quán)利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：最后階段層析柱型號(hào)為MCI-gel，甲醇/水梯度洗脫比例為：l:(Tl:l。
【文檔編號(hào)】C07H1/08GK103694293SQ201310189414
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月21日
【發(fā)明者】饒毅, 馮育林, 魏慧珍, 張武崗, 楊世林, 金浩鑫, 呂尚 申請(qǐng)人:江西本草天工科技有限責(zé)任公司