專利名稱：二咖啡酰奎寧酸制備方法與應(yīng)用的制作方法
二咖啡?？鼘幩嶂苽浞椒ㄅc應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及二咖啡?？鼘幩?，還涉及一種由金銀花葉提取二咖啡?？鼘幩岬姆椒?，還涉及所述二咖啡?？鼘幩岬挠猛尽?b>背景技術(shù)：
金銀花(Lonicera japonica Thunb)為忍冬科植物忍冬，我國大部分地區(qū)均產(chǎn)，其莖葉和花是常用的抗病原微生物、抗炎解熱、保肝利膽的中藥，目前主要用金銀花花蕾入藥，而且還作為提取綠原酸的工業(yè)原料，用量較大，價格較高。金銀花葉片是生產(chǎn)金銀花的副產(chǎn)品，產(chǎn)量很大，是花蕾的10倍左右，藥源豐富，應(yīng)該充分利用。金銀花葉片及其粗提物在臨床上及現(xiàn)代抑菌試驗中均表現(xiàn)出和花蕾相當(dāng)，甚至好于花蕾的抑菌效果，但現(xiàn)有技術(shù)對金銀花葉抑菌方面的研究只是基于金銀花葉的粗提物，抑菌活性目標(biāo)成分不清晰，雜質(zhì)多，干擾重。
梅林在“秀山金銀花、葉、莖中綠原酸的檢測及其抑菌作用研究”，《藥物研究》，第3期(2001年)中公開檢測金銀花花蕾、葉片和莖的綠原酸含量，并比較了不同部位抑菌活性，結(jié)果表明金銀花葉提取物有較好的抑菌效果，具較高的開發(fā)價值。武雪芬、景小琦在“金銀花葉藥用成 分的提取及抑菌試驗”，《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》，第3期(2001年)中、趙彥杰在“金銀花葉提取物的抑菌效果研究”，《食品科學(xué)》，第7期(2007年)中都對金銀花葉提取物的抗菌作用進行了初步研究，比較了金銀花葉粗提物及粗黃酮、酚酸的抑菌活性，沒有對最佳的抑菌活性物進行追蹤。李玉杰在“微粉化技術(shù)對金銀花葉抑菌效果的研究”，《吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院學(xué)報》，第4期(2010年)中探討了金銀花葉粉碎粒度對抑菌活性物質(zhì)提取效果的影響，認為金銀花葉對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果較強，沒有涉及抑菌活性成分純化。張寧、曹光群在“金銀花葉的抑菌活性和抗氧化性研究”，《牙膏工業(yè)》第3期(2008年)中提出，金銀花葉乙醇提取物抗菌譜較廣，乙酸乙酯萃取物的抑菌效果最為顯著。
食品是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，應(yīng)當(dāng)具有營養(yǎng)價值、安全性。近十多年隨著經(jīng)濟日益全球化和國際食品貿(mào)易的日益擴大，由致病菌引起的重大食品安全事件屢屢發(fā)生。目前人們常使用化學(xué)防腐劑減少致病菌，盡管化學(xué)防腐劑對微生物有一定的抑制作用，但它具有一定的毒副作用，對人體健康存在潛在的危害，以我國廣泛使用的食品防腐劑苯甲酸為例，苯甲酸及其鈉鹽因有積蘊中毒現(xiàn)象的報道，國際上對其使用一直存有爭議，歐共體兒童保護集團認為它不宜用于兒童食品中，日本也對它的使用做出了嚴(yán)格限制。因此研發(fā)使用方便，效果好且無毒副作用的天然食品防腐劑已受到世界各國的普遍重視。
中草藥以其獨特的理念及對疾病的獨特療效而倍受世人的關(guān)注，其有效性與安全性在漫長的歷史中得到了證實。將中草藥用作食品防腐劑，不僅可以避免化學(xué)防腐劑的毒性危害，且病原菌不易產(chǎn)生耐藥性，而且還可以賦予食品獨特的風(fēng)味，是一種深受消費者歡迎的，具有廣闊前景的新型天然防腐劑。
鑒于現(xiàn)有食品技術(shù)存在的一些技術(shù)缺陷，針對化學(xué)防腐劑在食品保鮮中出現(xiàn)的問題，本發(fā)明人經(jīng)過大量實驗研究，終于完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容
[要解決的技術(shù)問題]
本發(fā)明的目的是提供一種從金銀花葉片中提取二咖啡?？鼘幩岬姆椒ā?br> 本發(fā)明的另一個目的是提供所述的二咖啡?？鼘幩?。
本發(fā)明的另一個目的是提供所述二咖啡?？鼘幩岬挠猛尽?br> [技術(shù)方案]
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明涉及一種從金銀花葉片中提取二咖啡?？鼘幩岬姆椒ā?br> 該提取方法的步驟如下:
A、原料采收及預(yù)處理
6-8月份采收的金銀花葉，置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中在溫度38 42°C下鼓風(fēng)干燥6 10小時，干燥的綠色金銀花葉片進行粉碎，通過40目篩得到金銀花葉粉。
金銀花為常綠植物，一年四季均可采收葉片，5月份為金銀花的盛花期，收獲花以后，6 8月份天氣晴好，有效成分富集，有效成分含量為一年中最高。因此，6 8月份為采收金銀花葉的最佳時期。將采收的葉片均勻放于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，其厚度約1.5cm，于溫度40°C下鼓風(fēng)干燥8小時，其中的多酚類成分保持完好。本發(fā)明使用的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱例如是吳江新億陽烘箱制造廠生產(chǎn)的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。
獲得綠色的干燥葉片，使用中藥材加工技術(shù)領(lǐng)域里通常使用的粉碎設(shè)備，例如青島邁科隆粉末技術(shù)設(shè)備有限公司生產(chǎn)的MZ-50中藥粉碎機進行粉碎，然后使用中藥材加工技術(shù)領(lǐng)域里通常使用的篩分設(shè)備，例如華恒機械設(shè)備有限公司生產(chǎn)的HH-800-2S800直篩機進行篩分，收集40目篩下金銀花葉粉末，然后置于杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司、北京興運科諾科貿(mào)中心、北京杰韋弗有限公司銷售的玻璃干燥器中保存?zhèn)溆谩?br> B、有效成分提取
按照以kg計金銀花葉粉與以L計提取溶劑的比1:15 20，使用55 65重量％乙醇水溶液提取溶劑，對步驟A得到的金銀花葉粉在溫度68 72°C的條件下加熱回流提取1.5 2.5h，然后進行離心分離，得到的上清液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在溫度52 58°C與壓力0.001 0.0lMPa的條件下進行減壓濃縮，其濃縮物在溫度-55°C下再進行冷凍干燥，得到一種粗提物。
使用乙醇水 溶液提取溶劑提取金銀花葉粉時所使用的設(shè)備是目前化工技術(shù)領(lǐng)域里通常使用的設(shè)備，例如衡陽市合創(chuàng)藥機科技有限公司銷售的DTQ系列多功能提取罐等設(shè)備。
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀主要用于在減壓條件下連續(xù)蒸餾大量易揮發(fā)性溶劑，從而可以分離和純化反應(yīng)產(chǎn)物。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀通常配備蒸餾燒瓶、回流蛇形冷凝管、恒溫水槽、減壓泵與接收燒瓶等。本發(fā)明使用的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如上海羌強儀器設(shè)備有限公司銷售的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
冷凍干燥是將含水物料冷凍到冰點以下，使水轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，然后在較高真空下將冰升華為蒸氣而除去水的干燥方法。物料可先在冷凍裝置內(nèi)冷凍，再進行干燥。升華生成的水蒸氣借冷凝器除去。冷凍干燥機是由干燥箱、凝結(jié)器、冷凍機組、真空泵、加熱/冷卻裝置等組成。本發(fā)明使用的冷凍干燥機是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如上海市比朗儀器有限公司銷售的冷凍干燥機。
優(yōu)選地，步驟A得到的金銀花葉粉在溫度70°C的條件下加熱回流提取2.0h。
C、大孔吸附樹脂預(yù)處理
大孔吸附樹脂用無水乙醇浸泡20 28小時，讓其充分溶脹，然后用無水乙醇淋洗直至得到的析出液與等量蒸餾水混合后無白色渾濁現(xiàn)象，再用去離子水淋洗至無乙醇，然后依次用4 6重量％鹽酸、純水、4 6重量％氫氧化鈉水溶液進行浸泡,流過樹脂柱,其浸泡液與樹脂的體積比為2 4 ;最后用大量純水進行洗滌，洗滌至流出水為中性，然后浙干樹脂，待用；
大孔吸附樹脂是一種不含交換基團，但具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹脂，具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，可以通過物理吸附從水溶液中選擇地吸附有機物，在環(huán)保、食品、醫(yī)藥技術(shù)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。大孔吸附樹脂在其內(nèi)部存在一些未聚合的單體、殘存的致孔劑、分散劑與引發(fā)劑等，因此在使用前需要進行預(yù)處理。
本發(fā)明使用的大孔吸附樹脂是HPD500大孔吸附樹脂或NKA-2大孔吸附樹脂。它們都是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如鄭州勤實科技有限公司銷售的HPD500大孔吸附樹脂。
D、柱層析分離
稱取25 35克在步驟B得到的粗提物溶解于18 22重量％乙醇水溶液中，讓其以130 200ml/min通過5cmX60cm大孔吸附樹脂層析柱進行吸附，再分別讓水、40 45重量％乙醇水溶液、52 58重量％乙醇水溶液洗脫劑以流速0.8 1.2BV/h分別通過其層析柱進行梯度洗脫，各洗脫劑的總量為4 6BV，分步收集洗脫液，采用高效液相色譜法檢測其成分，合并含有相似成分的洗脫液，然后進行真空濃縮，冷凍干燥，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的高效液相色譜和質(zhì)譜對比確定，其52 58重量％乙醇洗脫液凍干物為二咖啡?？鼘幩?。它是一種含有3，5- 二 -0-咖啡?？鼘幩岷?，5- 二 -0-咖啡?？鼘幩岬幕旌衔?，即二咖啡?？鼘幩岱栏瘎?。
其HPLC洗脫梯度如下:
權(quán)利要求
1.一種從金銀花葉片中提取二咖啡酰奎寧酸的方法，其特征在于該方法的步驟如下: A、原料采收及預(yù)處理 6-8月份采收的金銀花葉，置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中在溫度38 42°C下鼓風(fēng)干燥6 10小時，干燥的綠色金銀花葉片進行粉碎，通過40目篩得到金銀花葉粉； B、有效成分提取按照以kg計金銀花葉粉與以L計提取溶劑的比1:15 20，使用55 65重量％乙醇水溶液提取溶劑，對步驟A得到的金銀花葉粉在溫度68 72°C的條件下加熱回流提取.1.5 2.5h，然后進行離心分離，上清液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在溫度52 58°C與壓力0.001 .0.0lMPa的條件下進行減壓濃縮，濃縮物在溫度_55°C下再進行冷凍干燥，得到粗提物； C、大孔吸附樹脂預(yù)處理 大孔吸附樹脂用無水乙醇浸泡20 28小時，讓其充分溶脹，然后用無水乙醇淋洗直至得到的析出液與等量蒸餾水混合后無白色渾濁現(xiàn)象，再用去離子水淋洗至無乙醇，然后依次用4 6重量％鹽酸、純水、4 6重量％氫氧化鈉水溶液進行浸泡,流過樹脂柱,其浸泡液與樹脂的體積比為2 4 ;最后用大量純水進行洗滌，洗滌至流出水為中性，然后浙干樹脂，待用; D、柱層析分離 稱取25 35克在步驟B得到的粗提物溶解于18 22重量％乙醇水溶液中，讓其以130 200ml/min通過5cmX 60cm大孔吸附樹脂層析柱進行吸附,再分別讓水、40 45重量％乙醇水溶液、52 58重量％乙醇水溶液洗脫劑以流速.0.8 1.2BV/h分別通過其層析柱進行梯度洗脫，各洗脫劑的總量為4 6BV，分步收集洗脫液，采用高效液相色譜法檢測其成分，合并含有相似成分的洗脫液，然后進行真空濃縮，冷凍干燥，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的高效液相色譜和質(zhì)譜對比確定，其52 58重量％乙醇洗脫液凍干物為二咖啡?？鼘幩帷?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的大孔吸附樹脂是HPD500大孔吸附樹脂或NKA-2大孔吸附樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其HPLC洗脫梯度如下:
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的高效液相色譜法在下述條件下進行檢測: 色譜柱:250mmX4.6mmAlItimaC18柱，粒徑5 y m ;流動相A為色譜純乙腈，流動相B為.0.2%磷酸水溶液；柱溫40°C ;流速0.7mL/min ;檢測波長238nm ;靈敏度2.000AUFS ;進樣量IOiiL;每個樣品平行測定3次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的質(zhì)譜在下述條件下進行檢測: 質(zhì)譜檢測采用Agilent6540超高解析度四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀，離子極性，ESI(±)，掃描范圍:130-800amu，干燥氣流速(氮氣)7L/min,干燥氣溫度400°C，負離子模式:S.V.:-4000V, 0.V.:-101V, F.R.V.:_380V。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項權(quán)利要求所述方法得到的二咖啡?？鼘幩?，其特征在于它是3，5- 二 -0-咖啡?？鼘幩崤c4，5- 二 -0-咖啡?？鼘幩岬幕旌衔?。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的二咖啡?？鼘幩嵩谝种拼竽c桿菌與金黃色葡萄球菌中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的二咖啡?？鼘幩嶙鳛槿馄贩栏瘎┑挠猛?。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于將二咖啡?？鼘幩崴?5 25重量％乙醇乙醇溶液加到肉品中，混勻進行保鮮，其二咖啡?？鼘幩岬牧渴撬鋈馄分亓康?.3%。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于所述的肉品是豬肉或鴨肉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由金銀花葉提取二咖啡?？鼘幩岬姆椒ǎ€涉及所述二咖啡?？鼘幩峒捌溆猛?。該方法包括原料采收及預(yù)處理、有效成分提取、大孔吸附樹脂預(yù)處理與柱層析分離等步驟。本發(fā)明的二咖啡?？鼘幩釋θ馄分写竽c桿菌、金黃色葡萄球菌具有很好的抑制效果，對肉品保鮮效果好，能很好地控制肉品顏色、揮發(fā)性鹽基氮、細菌總數(shù)等的變化。本發(fā)明方法使用乙醇作為提取溶劑，避免使用化學(xué)防腐劑所帶來的不安全性，本方法操作簡單，成本低廉，便于廣泛推廣使用。
文檔編號C07C67/48GK103214371SQ20131013369
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月17日
發(fā)明者熊建華, 洪艷平, 湯凱潔, 林麗萍, 杜華英, 張清峰, 張鳳英, 王文君 申請人:江西農(nóng)業(yè)大學(xué)