專利名稱：一種東海烏參酶溶性膠原蛋白的提取純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種東海烏參酶溶性膠原蛋白的提取純化方法。背景技術(shù)：
膠原蛋白富含人體需要的甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸等氨基酸。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中最重要的組成部分，是一種細(xì)胞外蛋白質(zhì)，膠原蛋白是3條肽鏈擰成螺旋形的纖維狀蛋白質(zhì)，肽鏈由大量的重復(fù)Gly-X-Y-序列構(gòu)成(X:脯氨酸，Y:羥脯氨酸)，端肽(C-和N-端)的15 20個(gè)氨基酸殘基不參與三股螺旋結(jié)構(gòu)，大多數(shù)殘基是賴氨酸和羥賴氨酸及其醛基衍生物組成，形成分子間和分鐘內(nèi)的共價(jià)交聯(lián)鍵，三股螺旋結(jié)構(gòu)依靠肽鏈內(nèi)和鏈間的氫鍵維持。
膠原蛋白是人體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，占全身總蛋白質(zhì)的1/3。主要存在于人體皮膚、骨骼、眼睛、牙齒、肌腱、內(nèi)臟(包括心、胃、腸、血管)等部位，其功能是維持皮膚和組織器官的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，也是修復(fù)各損傷組織的重要原料物質(zhì)。在人體皮膚成分中，有70%是由膠原蛋白所組成。自然界廣泛存在I型膠原蛋白，如牛皮、豬皮等哺乳動(dòng)物、魚類、軟體動(dòng)物等，根據(jù)不同組織和部位提取得到的膠原蛋白種類分為三類:分別為(I)間隙膠原1-1II型，主要存在于皮膚和肌腱等組織中，是細(xì)胞之間的膠原蛋白，有很強(qiáng)的抗張性，其中II型膠原由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生。(2)基膜膠原有IV-Vn型膠腺為基膜膠原，主要存在于臟器當(dāng)中。(3)軟骨膠原有IX-XI型為軟骨中微量膠原與軟骨形成有關(guān)。膠原蛋白是人體組織的主要成份，它與人體各器官組織及細(xì)胞有著不可分隔的關(guān)系，所以應(yīng)用于人體器官組織的修補(bǔ)及再生。膠原蛋白在醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面主要是各種功能膠原生物材料，包括膠原蛋白海綿，絲腺，薄膜(外科止血，用于心臟血管，神經(jīng)，口腔，骨科，皮膚，婦產(chǎn)手術(shù)等)傷口敷料，人工皮膚，血管，心瓣膜，眼角膜保護(hù)材料，注射式膠原蛋白(用于除皺，軟組織豐滿填補(bǔ)，治療尿失禁，尿液回流，骨科組織再生填料)，藥物輔助機(jī)制，膠原蛋白基質(zhì)模板等用途。膠原蛋白在化妝品和美容保健方面的應(yīng)用保濕抗皺抗氧化等功能，膠原蛋白是維持皮膚緊實(shí)和彈性的主要成份。此外膠原蛋白也在食品保健品中添加使用。
目前市場(chǎng)上有很多關(guān)于膠原蛋白和膠原肽或蛋白粉的產(chǎn)品，消費(fèi)者無(wú)法區(qū)分產(chǎn)品的功能和作用，因此有必要從概念和應(yīng)用上區(qū)分三者的關(guān)系。膠原蛋白肽是一類由膠原蛋白或含膠原蛋白比較豐富的產(chǎn)品為原料利用生物酶在一定的溫度和PH條件下水解制成的小分子多肽混合物，由兩個(gè)和兩個(gè)以上的氨基酸組成，根據(jù)水解條件和水解程度的不同，多肽的氨基酸組成和分子量范圍是決定功能的主要因素，多肽可以直接被人體吸收。蛋白粉由二個(gè)或二個(gè)以上氨基酸組成，一般為含高蛋白質(zhì)含量的產(chǎn)品通過(guò)加入生物催化酶制劑在適當(dāng)條件下水解生成的多肽混合物，目前較多的蛋白粉來(lái)源于大豆蛋白粉、乳清蛋白粉等。膠原蛋白是一類具有特殊結(jié)構(gòu)和獨(dú)特生物學(xué)應(yīng)用的單一蛋白組成的物質(zhì)，需要經(jīng)過(guò)分離純化得到的蛋白質(zhì)。膠原蛋白可以作為生物醫(yī)學(xué)輔助材料，是一般的膠原肽或蛋白粉等產(chǎn)品不可替代的功能性生物材料。
近年來(lái)天然海洋產(chǎn)品——海參及其保健品市場(chǎng)占有率急劇上升，前景廣闊，從2000年開始，中國(guó)海參的產(chǎn)值開始呈現(xiàn)每年增長(zhǎng)30%的速度，到目前已經(jīng)十年有余，海參產(chǎn)業(yè)的養(yǎng)殖與生產(chǎn)地區(qū)以大連和山東海域?yàn)橹?。養(yǎng)殖、加工、銷售企業(yè)超過(guò)500家，年產(chǎn)值超過(guò)200億元，已經(jīng)成為我國(guó)漁業(yè)資源中單品產(chǎn)值最大的品種。東海烏參(AcaudinaLeucoprocta)是眾多海參品種中的重要一類，浙江沿海地區(qū)蘊(yùn)藏著豐富的東海烏參資源，僅浙江象山一帶年捕撈量就達(dá)到10萬(wàn)噸規(guī)模，據(jù)保守計(jì)算，10萬(wàn)噸東海烏參可產(chǎn)生100億產(chǎn)值，因此挖掘東海烏參資源，深度開發(fā)相關(guān)保健產(chǎn)品將對(duì)浙江海洋經(jīng)濟(jì)的發(fā)展產(chǎn)生重要意義。據(jù)2011年中國(guó)生物膠原蛋白市場(chǎng)分析及投資趨勢(shì)研究報(bào)告顯示，2011年中國(guó)膠原蛋白消費(fèi)約10000噸，預(yù)計(jì)到2015年需求量有望提升到20000噸，年復(fù)合增長(zhǎng)率達(dá)到25%，高于全球平均增幅，因此膠原蛋白的市場(chǎng)潛力十分可觀。現(xiàn)有的膠原蛋白主要來(lái)源于牛皮、豬皮等哺乳動(dòng)物，由于瘋牛病、口蹄疫等動(dòng)物疾病的發(fā)現(xiàn)，及動(dòng)物源過(guò)敏物質(zhì)和宗教傳統(tǒng)等因素的影響，急需尋找可替代的膠原蛋白來(lái)源，海洋產(chǎn)品是近年來(lái)研究最多的可替代資源，如魚類、軟體動(dòng)物類、海參類等組織中的膠原蛋白提取純化產(chǎn)品，但很多報(bào)道和研究?jī)H限于實(shí)驗(yàn)室，無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)加工，產(chǎn)量少、價(jià)格昂貴、沒(méi)有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
海參是一種高蛋白、低脂肪、不含膽固醇，富含海參皂甙、多糖等活性物質(zhì)，是，素來(lái)以滋補(bǔ)強(qiáng)身和藥用保健等功能被譽(yù)為“海中人參”和“八珍”之首的天然海洋資源。海參中的膠原蛋白非常高，占海參體總蛋白的70%。全世界約有1400多種海參，我國(guó)海域有100余種，目前可供食用的海參品種有梅花參、刺參、烏參、光參、瓜參、玉足參、東海烏參等20多種。
東海烏參(Acaudina Ieucoprocta):學(xué)名白肛海地瓜，是棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)> 海參綱(Holothuroidea)、芋參目(Molpadida)、尻參科(Caudinidae)、海地瓜屬(Acaudina)的一種海參綱動(dòng)物。廣泛的生長(zhǎng)于東海大陸架，從浙江舟山群島到海南島等海域，此外伊朗，澳大利亞西北部也有分布，資源豐富。由于東海烏參(AcaudinaLeucoprocta)長(zhǎng)年生長(zhǎng)于海底淤泥上，其體表分泌的粘液與含重金屬沉積物的海底淤泥牢固地結(jié)合，形成了致密堅(jiān)硬的體表污垢層，隨著海水的污染日益加劇，其體表污垢層有害重金屬如汞、砷、鉛元素的含量嚴(yán)重超標(biāo)。東海烏參體表積累的大量金屬元素及致密堅(jiān)硬的組織特征問(wèn)題，嚴(yán)重限制了東海烏參這一優(yōu)質(zhì)資源的加工利用，尤其是在膠原蛋白的提取方面困難重重，因此東海烏參一直被當(dāng)?shù)貪O民視為低值的廢棄資源。研究開發(fā)高附加值的東海烏參產(chǎn)品對(duì)低值海洋產(chǎn)品的深加工領(lǐng)域的意義重大，同時(shí)為可替代資源的開發(fā)利用提供一個(gè)廣闊的應(yīng)用前景。`
不同種屬的海參個(gè)體差異很大，我國(guó)沿海最名貴的海參是遼參，梅花參和刺參的市場(chǎng)售價(jià)較高，目前有關(guān)海參膠原蛋白的專利有兩項(xiàng)，一項(xiàng)是《海參膠原、膠原蛋白的提取方法》(CN101215315B)中的海參原料為刺參，對(duì)膠原和膠原蛋白的工藝進(jìn)行描述，此工藝適合易泡發(fā)和勻漿的海參組織，但不適合于被海水嚴(yán)重污染的東海烏參，其組織堅(jiān)硬，難以破碎勻漿，重金屬和各類化學(xué)元素含量超標(biāo)，東海烏參組織中大量金屬元素的蓄積，嚴(yán)重影響提取效率，用該專利方法提取東海烏參膠原蛋白的產(chǎn)率極低，無(wú)法實(shí)現(xiàn)全部提取膠原蛋白，且產(chǎn)物中金屬元素含量超標(biāo)，因此有必要對(duì)專利中的工藝進(jìn)行改進(jìn)，以適合于東海烏參組織中膠原和膠原蛋白的提取。
另一項(xiàng)專利是《一種東海烏參膠原蛋白的制造方法》(CN102251006A)，該專利為東海烏參的膠原蛋白直接水解方法，并非膠原蛋白的提取方法，其產(chǎn)物為小分子膠原多肽粉，目前東海烏參中膠原蛋白的提取技術(shù)還未見(jiàn)報(bào)道。海參相關(guān)的其它專利或文獻(xiàn)均未涉及東海烏參品種的膠原蛋白提取或制作，由于東海大陸架蘊(yùn)藏著巨大產(chǎn)量的東海烏參，海水中金屬元素的污染導(dǎo)致其無(wú)法直接食用，屬于低值海洋資源，需要脫除化學(xué)元素后才能使用，因此有必要對(duì)其進(jìn)行深度加工開發(fā)為高附加值的膠原蛋白產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種操作簡(jiǎn)便，成本低，收益高，對(duì)環(huán)境友好的東海烏參膠原蛋白提取純化的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種東海烏參酶溶性膠原蛋白的提取純化方法，所述方法包括:(I)取潔凈塊狀東 海烏參樣品用0.2M、pH8.0的EDTA溶液浸泡5 6天，每天更換EDTA溶液；所述潔凈塊狀東海烏參可取新鮮東海烏參用4°C水沖洗，去除泥沙、內(nèi)臟，切成小塊(5 10mmX5 10mm)，也可將東海烏參冷凍切塊后再用4°C水沖洗去除泥沙和內(nèi)臟；(2)塊狀樣品水洗后，加入冰塊，用不銹鋼勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿均質(zhì)后，離心取沉淀物進(jìn)行下一步操作；(3)步驟(2)沉淀加入10 20倍體積(溶液體積毫升數(shù)與沉淀質(zhì)量克數(shù)之比，下同)的0.1M、pH8.0的Tris-HCl溶液，攪拌2 4天，充分溶解組織蛋白，離心后取沉淀物進(jìn)行下一步操作Jris-HCl溶液也可以添加0.5M NaCl，4 50mM EDTA和0.2Μβ -巰基乙醇，也可以不含β-巰基乙醇，或NaCl和EDTA，提取結(jié)果無(wú)顯著差異。該方法可以有效去除污染的化學(xué)元素，同時(shí)使膠原纖維充分溶解膨脹，但又不影響膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)；(4)步驟(3)沉淀加入10 20倍體積的0.1M NaOH溶液攪拌2 4天，每天更換NaOH溶液，離心、取沉淀再加入10 20倍體積的0.1MNaOH攪拌24h，離心、取沉淀用水洗至中性，離心取沉淀物進(jìn)行下一步操作，或者將該沉淀物水洗至中性后直接凍干，得到粗膠原纖維進(jìn)行下一步酶解操作；該步驟可以除去非膠原物質(zhì)并去除海參內(nèi)源性生物酶的活性，可以有效去除皂甙、多糖、雜蛋白等非膠原物質(zhì)，提高膠原蛋白的產(chǎn)率，同時(shí)起到抑制海參體內(nèi)生物活性物質(zhì)的降解作用；(5)步驟(4)所得沉淀(或粗膠原纖維)加入足量(20倍體積以上)含300w 800wU/L胃蛋白酶(豬胃粘膜來(lái)源)的0.5M乙酸溶液提取2 4天，離心得到上清液1，沉淀物再次加入足量含300w 800w U/L胃蛋白酶的0.5M乙酸溶液提取24h，離心得到上清液2 ;粗膠原纖維用豬胃粘膜來(lái)源的胃蛋白酶酶解提取膠原纖維，可以有效減弱和去除膠原纖維分子間化學(xué)鍵的相互交叉作用，使不溶性膠原纖維充分溶解在酸性溶液中，將不溶性的膠原纖維轉(zhuǎn)化成可溶性的膠原蛋白。(6)合并上清液I和上清液2，加入4M NaCl至NaCl終濃度為0.8M，鹽析，靜置I 2h后，離心、取沉淀物；(7)步驟(6)所得沉淀物加入9 10倍體積的0.5M乙酸溶液溶解，用截留分子量7000Da的透析膜進(jìn)行透析，先用0.02M、pH8.0的Na2HPO4溶液透析48h，換0.1M乙酸溶液透析48h，再換去離子水透析48h，產(chǎn)物凍干，即為所述酶溶性膠原蛋白；用NaCl鹽析和透析膜透析，可以有效純化膠原蛋白產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)蛋白電泳和凝膠層析色譜測(cè)定，膠原蛋白產(chǎn)物中不含雜蛋白，經(jīng)氨基酸、金屬元素含量、產(chǎn)率等測(cè)定分析，該方法的提取純化技術(shù)可以得到高產(chǎn)率和高純度的膠原蛋白產(chǎn)品，是可以大規(guī)模生產(chǎn)和豐富的可替代哺乳動(dòng)物來(lái)源海產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)膠原蛋白資源。
上述步驟(I) (7)均在4°C下進(jìn)行。
優(yōu)選的，步驟(3) Tris-HCl溶液中還添加有:0.5M NaCl,4 50mMEDTA和0.2Μβ-巰基乙醇。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:采用EDTA螯合劑去除海參組織中高污染濃度的化學(xué)元素，脫除效率達(dá)到90%以上，胃蛋白酶水解膠原纖維后的膠原蛋白產(chǎn)物有效的去除了化學(xué)鍵內(nèi)、鍵間的交聯(lián)效應(yīng)，能夠最大限度的提取溶解膠原蛋白，經(jīng)過(guò)氯化鈉鹽析、透析等純化步驟，膠原蛋白產(chǎn)物的蛋白電泳分析和凝膠色譜層析色譜測(cè)定，提取得到的膠原蛋白產(chǎn)物純度達(dá)到90%以上，產(chǎn)率為56.99% 61.52% (干重)，占東海烏參蛋白中總膠原蛋白含量的97.1% 102.5%，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)率提取東海烏參中膠原蛋白含量的技術(shù)。

圖1為實(shí)施例3膠原蛋白的SDS-PAGE譜圖，PSC:東海烏參酶溶性膠原蛋白，M:分子量標(biāo)記物，CSC:牛皮膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
實(shí)施例1:
1.新鮮東海烏參(市購(gòu)，產(chǎn)自浙江象山一帶)樣品用4°C自來(lái)水沖洗，去除泥沙、內(nèi)臟后，切成小塊5mm*5mm，取200g塊狀樣品用IOOOmL0.2M EDTA (pH8.0)浸泡攪拌5天，每天更換溶液，去除鈣、鐵、錳、鎂、鉛等污染元素及殘留雜質(zhì)。
2.水洗后，加入冰塊IOOg (使溶液溫度降至4°C以下)，用不銹鋼勻漿機(jī)(IKAT25Homogenizer)勻衆(zhòng)均質(zhì)，18000rpm, 20min,離心后取沉淀物A。
3.沉淀物A加入20倍體積(溶液20mL/lg沉淀)的0.1M Tris-HCl (pH8.0)，攪拌48h，充分溶解組織蛋白，離心后取沉淀物B。
4.沉淀物B加入20倍體積的0.1M NaOH攪拌48h，每天更換溶液，除去非膠原物質(zhì)并去除內(nèi)源性生物酶的活性，12000G離心30min。棄去上清液，沉淀物C再次用20倍體積的0.1M NaOH攪拌24h，離心后的沉淀物用`水洗至中性，離心取沉淀物D。
5.沉淀物D加入20倍體積的含0.5g/L胃蛋白酶(Sigma胃蛋白酶，600-1200units/mg)的0.5M乙酸溶液提取3天，12000G離心30min,取上清液I,沉淀物再次提取24h，12000G離心30min，取上清液2。
6.合并兩次上清溶液I和2，加入4M NaCl至溶液NaCl終濃度0.8M，鹽析，靜置Ih后，12000G離心20min，取沉淀物E。
7.沉淀物E用9倍體積(9mL溶液/Ig沉淀)的0.5M乙酸溶液溶解，透析膜(截留分子量:7000Da)透析，先用0.02M、pH8.0的Na2HPO4溶液透析48h，換0.1M乙酸溶液透析48h,再換去離子水透析48h，產(chǎn)物凍干，即為酶溶性膠原蛋白。
實(shí)施例2:1.新鮮東海烏參樣品冷凍后直接切成顆粒(大小為5mm*5mm)，用冰水清洗攪拌三次，去除泥沙、內(nèi)臟等雜質(zhì)后，取200g塊狀樣品用2000mL0.2M EDTACpH8.0)浸泡攪拌5天，
每天更換溶液，去除鈣、鐵、錳、鎂、鉛等污染元素。2.水洗后，加入冰塊200g (使溶液溫度降至4°C以下)，用不銹鋼勻漿機(jī)(IKAT25Homogenizer), 18000rpm 勻衆(zhòng) 20min,離心后取沉淀物 A。3.沉淀物 A 加入 20 倍體積的 0.1M、pH8.0Tris-HCl+0.5MNaCl+50mMEDTA+0.2M β -巰基乙醇，攪拌提取72h，離心后取沉淀物B。4.沉淀物B加入20倍體積的0.1M NaOH攪拌72h每天更換溶液，除去非膠原物質(zhì)并去除內(nèi)源性生物酶的活性，12000G離心30min。棄去上清液，沉淀物C水洗至中性，(可加少量乙酸調(diào)整PH)，產(chǎn)物凍干得粗膠原纖維。5.取5g的粗膠原纖維用5L0.5M乙酸溶液溶解，加入0.1g胃蛋白酶(3200-4500units/mg)攪拌提取72h，12000G離心30min，沉淀物D再次用含0.lg/L胃蛋白酶的0.5M乙酸溶液提取24h，12000G離心30min。6.合并兩次上清溶液，加入4M NaCl至溶液NaCl終濃度0.8M，鹽析，靜置Ih后，12000G離心20min，取沉淀物E。7.沉淀物E用9倍體積的0.5M乙酸溶液溶解，透析膜(截留分子量:7000Da)透析，先用0.02M、pH8.0的Na2PO4溶液透析48h，換0.1M乙酸溶液透析48h，再換去離子水透析48h，產(chǎn)物凍干，即為酶溶性膠原蛋白。實(shí)施例3:1.新鮮東海烏參組織含水率83.61 ±0.2%，灰分3.9±0.05%,蛋白質(zhì)13.71±0.1%，脂肪0.9±0.05%。重金屬元素含量嚴(yán)重超標(biāo)，見(jiàn)下表:
權(quán)利要求
1.一種東海烏參酶溶性膠原蛋白的提取純化方法，所述方法包括: (1)取潔凈塊狀東海烏參用0.2M、pH8.0的EDTA溶液浸泡5 6天，每天更換EDTA溶液； (2)水洗后，加入冰塊，用不銹鋼勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿均質(zhì)后，離心取沉淀物進(jìn)行下一步操作； (3)步驟(2)沉淀加入10 20倍體積的0.1M、pH8.0的Tris-HCl溶液，攪拌2 4天，充分溶解組織蛋白，離心后取沉淀物進(jìn)行下一步操作； (4)步驟(3)沉淀加入10 20倍體積的0.1M NaOH攪拌2 4天，每天更換NaOH溶液，離心、取沉淀再加入10 20倍體積的0.1M NaOH攪拌24h，離心、取沉淀用水洗至中性，離心取沉淀物進(jìn)行下一步操作；(5)步驟(4)所得沉淀加入足量含300w 800w U/L胃蛋白酶的0.5M乙酸溶液提取2 4天，離心得到上清液1，沉淀物再次加入足量含300w 800wU/L胃蛋白酶的0.5M乙酸溶液提取24h，離心得到上清液2 ； (6)合并上清液I和上清液2，加入4MNaCl至NaCl終濃度為0.8M，鹽析，靜置I 2h后，離心、取沉淀物；· (7)步驟(6)所得沉淀物加入9 10倍體積的0.5M乙酸溶液溶解，用截留分子量7000Da的透析膜進(jìn)行透析，先用0.02M、pH8.0的Na2HPO4溶液透析48h，換0.1M乙酸溶液透析48h，再換去離子水透析48h，產(chǎn)物凍干，即為所述酶溶性膠原蛋白；上述步驟(I) (7)均在4 °C下進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)Tris-HCl溶液中還添加有:0.5MNaCl，4 50mM EDTA 和(λ 2Μβ -巰基乙醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種東海烏參酶溶性膠原蛋白的提取純化方法，所述方法包括取潔凈塊狀東海烏參樣品先用EDTA溶液浸泡，再進(jìn)行勻漿均質(zhì)，接著依次用Tris-HCl溶液、NaOH溶液、胃蛋白酶乙酸溶液提取，再進(jìn)行鹽析、透析，得到所述酶溶性膠原蛋白；采用EDTA螯合劑去除海參組織中高污染濃度的化學(xué)元素，脫除效率達(dá)到90%以上，胃蛋白酶水解膠原纖維后的膠原蛋白產(chǎn)物有效的去除了化學(xué)鍵內(nèi)、鍵間的交聯(lián)效應(yīng)，能夠最大限度的提取溶解膠原蛋白，經(jīng)過(guò)氯化鈉鹽析、透析等純化步驟，提取得到的膠原蛋白產(chǎn)物純度達(dá)到90%以上，產(chǎn)率為56.99%～61.52%(干重)，占東海烏參蛋白中總膠原蛋白含量的97.1%～102.5%，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)率提取東海烏參中膠原蛋白含量。
文檔編號(hào)C07K1/14GK103184262SQ20131009479
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月22日
發(fā)明者鄭裕國(guó), 林賽君, 薛亞平, 單恩莉, 沈寅初 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)