對(duì)TGF-β具有特異性的抗體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本公開(kāi)總體上涉及用于對(duì)包括TGFβ1、TGFβ2以及TGFβ3在內(nèi)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ）具有特異性的抗體的物質(zhì)和方法，以及這些抗體用于治療患有癌癥、眼睛疾病、病狀或病癥、包括眼科纖維化或眼睛纖維化在內(nèi)的纖維化以及與TGFβ表達(dá)相關(guān)的其他病狀或病癥的受試者的用途。
【專(zhuān)利說(shuō)明】對(duì)TGF-β具有特異性的抗體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本公開(kāi)總體上涉及用于對(duì)包括TGF β 1、TGF β 2和/或TGF β 3在內(nèi)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子iKTGFii )具有特異性的抗體的物質(zhì)和方法以及這些抗體用于治療患有癌癥、眼睛疾病、病狀或病癥、包括眼睛纖維化或眼科纖維組織形成在內(nèi)的纖維化以及與TGFii表達(dá)相關(guān)的其他病狀或病癥的受試者的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGFi3 )蛋白質(zhì)家族由哺乳動(dòng)物中存在的三種獨(dú)特的亞型(TGFβ 1、TGFβ 2以及TGFii 3)組成。TGFβ蛋白活化并且調(diào)節(jié)影響包括細(xì)胞增殖性病狀、炎癥病狀以及心血管病狀在內(nèi)的疾病病況的多種基因反應(yīng)。TGFii是一種多功能的細(xì)胞因子，最初因它能夠使正常的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成能夠進(jìn)行非貼壁依賴(lài)性生長(zhǎng)的細(xì)胞而得名。TGF^分子主要由造血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生并且可以調(diào)節(jié)，即刺激或抑制來(lái)自多種正常和贅生性組織起源的細(xì)胞生長(zhǎng)和分化(Sporn等，Science, 233:532(1986))，并且刺激不同的基質(zhì)細(xì)胞形成和擴(kuò)充。
[0003]已知TGF0牽涉到許多增殖性和非增殖性細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞增殖和分化、胚胎發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)形成、骨骼發(fā)育、傷口愈合、造血作用以及免疫和炎癥反應(yīng)。參見(jiàn)例如Pircher 等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，136:30-37(1986) ；ffakefield 等，GrowthFactors, 1:203-218 (1989) ;Roberts 和 Sporn,第 419-472 頁(yè)，Handbook of ExperimentalPharmacology, M.B.Sporn 和 A.B.Roberts 編著(Springer, Heidelberg,1990)；Massague 等，Annual Rev.Cell Biol.，6:597-646 (1990) ；Singer 和 Clark,NewEng.J.Med.，341:738-745 (1999)。并且，TGF β被用于治療和預(yù)防腸粘膜疾病(W02001/24813)。還已知TGF0對(duì)不同的免疫細(xì)胞類(lèi)型具有強(qiáng)烈的免疫抑制作用，包括抑制細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞(CTL) (Ranges 等，J.Exp.Med.，166:991, 1987 ;Espevik 等，J.1mmunol.，140:2312，1988) ;B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增殖和κ輕鏈表達(dá)減少(Lee等，J.Exp.Med.，166:1290, 1987);負(fù)向調(diào)節(jié)造血作用(Sing 等，Blood, 72:1504, 1988);下調(diào)腫瘤細(xì)胞上的HLA-DR表達(dá)(Czarniecki等，J.1mmunol., 140:4217, 1988);以及抑制抗原活化的B淋巴細(xì)胞響應(yīng)于B細(xì)胞生長(zhǎng)因子的增殖(Petit-Koskas等,Eur.J.1mmunol., 18: 111, 1988)。還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利7，527，791。
[0004]針對(duì)TGF β 的抗體已經(jīng)在美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 7，527，791 -J, 927，593 -J, 494，651 ；7，369，111 ;7，151，169 ;6，492，497 ;6，419，928 ;6，090，383 ;5，783，185 ;5，772，998 ；5，571，714 ;以及7，723，486中有所描述。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本公開(kāi)提供了用于治療與TGF0表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥的方法和組合物。本公開(kāi)提供了結(jié)合TGFii 1、TGFii 2以及TGFii 3的抗體。條件是本文所描述的抗體可以對(duì)任何或所有TGFii亞型具有差別親和力。此外，本文發(fā)現(xiàn)所公開(kāi)的TGFii特異性抗體出人意料地調(diào)節(jié)腫瘤中的免疫細(xì)胞(例如滲透到腫瘤中)并且預(yù)期能夠治療與TGF β表達(dá)相關(guān)的腫瘤以及與TGFii表達(dá)相關(guān)的其他病狀或病癥。
[0006]在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了一種結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGFβ ) 1、TGFβ 2以及TGFβ 3的抗體，所述抗體包含:(a)表1或SEQ ID NO: 13、19以及25中所示出的重鏈互補(bǔ)決定重復(fù)區(qū)(⑶R)1氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體；(b)表1或SEQID NO: 14,20以及26中所示出的來(lái)自于與(a)相同的重鏈可變區(qū)的重鏈⑶R2氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體；以及(c)表1或SEQ ID NO: 15,21以及27中所示出的來(lái)自于與(a)相同的重鏈可變區(qū)的重鏈CDR3氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體。
[0007]在一個(gè)相關(guān)方面，本公開(kāi)提供了一種結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGFβ )l、TGFi3 2以及TGF^ 3的抗體，所述抗體包含:(a)表1或SEQ ID NO: 13、19以及25中所示出的重鏈⑶Rl氨基酸序列，或其與其具有至少70%同一性的變體；(b)表1或SEQ ID NO: 14,20以及26中所示出的來(lái)自于與(a)相同的重鏈可變區(qū)的重鏈CDR2氨基酸序列，或其與其具有至少70%同一性的變體；以及(c)表1或SEQ ID NO: 15,21以及27中所示出的來(lái)自于與(a)相同的重鏈可變區(qū)的重鏈CDR3氨基酸序列，或其與其具有至少70%同一性的變體。
[0008]在另一個(gè)方面，本公開(kāi)涵蓋了一種結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGFβ ) 1、TGFβ 2以及TGF^ 3的抗體，所述抗體包含:(a)表1或SEQ ID NO: 13、19以及25中所示出的重鏈⑶Rl氨基酸序列，或其與其具有至少70%同一性的變體；(b)表1或SEQ ID NO: 14,20以及26中所示出的經(jīng)過(guò)獨(dú)立選擇的重鏈CDR2氨基酸序列，或其與其具有至少70%同一性的變體；以及(c)表1或SEQ ID NO: 15,21以及27中所示出的經(jīng)過(guò)獨(dú)立選擇的重鏈⑶R3氨基酸序列，或其與其具有至少70%同一性的變體。
[0009]在某些實(shí)施方 案中，重鏈⑶R1XDR2或⑶R3氨基酸序列中的至少兩個(gè)示出于表1或SEQ ID NO: 13-15,19-21以及25-27中。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，重鏈CDRl、CDR2以及CDR3氨基酸序列中的三個(gè)示出于表1或SEQ ID NO: 13-15、19-21以及25-27中。
[0010]在一些實(shí)施方案中，預(yù)期所述抗體包含與表1或SEQ ID N0:2、6以及10中所示出的重鏈可變區(qū)氨基酸序列具有至少85%同一'丨生的氨基酸序列。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所述抗體包含與表1或SEQ ID N0:2、6以及10中所示出的重鏈可變區(qū)氨基酸序列具有至少95%同一'丨生的氨基酸序列。
[0011]在另外的其他實(shí)施方案中，所述抗體包含氨基酸序列與重鏈可變區(qū)中的所有三個(gè)HCDR具有至少70%同一性的多肽序列，HCDRl、HCDR2以及HCDR3的氨基酸序列示出于SEQID NO: 13-15、19-21 以及 25-27 中。
[0012]在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)重鏈框架氨基酸已被另一個(gè)人類(lèi)抗體氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)氨基酸置換。
[0013]預(yù)期本文所述的抗體進(jìn)一步包含表1或SEQ ID NO: 16_18、22_24以及28-30中所示出的輕鏈⑶R氨基酸序列中的任一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，抗體包含表1或SEQ IDNO: 16-18,22-24以及28-30中所示出的輕鏈⑶R氨基酸序列中的至少兩個(gè)。在其他實(shí)施方案中，抗體包含表1或SEQ ID N0:16-18、22-24以及28-30中所示出的輕鏈CDR氨基酸序列中的至少三個(gè)。
[0014]在另一個(gè)方面，本文所描述的抗體包含(a)表1或SEQ ID NO: 16,22以及28中所示出的輕鏈CDRl氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體；(b)表1或SEQ IDNO: 17,23以及29中所示出的來(lái)自于與(a)相同的輕鏈可變區(qū)的輕鏈CDR2氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體；以及(c)表1或SEQ ID NO: 18,24以及30中所示出的來(lái)自于與(a)相同的輕鏈可變區(qū)的輕鏈CDR3氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體。
[0015]在替代性實(shí)施方案中，本文所涵蓋的抗體包含:(a)表1或SEQ ID NO: 16,22以及28中所示出的輕鏈CDRl氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體；(b)表1或SEQ ID NO: 17,23以及29中所示出的經(jīng)過(guò)獨(dú)立選擇的輕鏈⑶R2氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體；以及(c)表1或SEQ ID NO: 18,24以及30中所示出的經(jīng)過(guò)獨(dú)立選擇的輕鏈CDR3氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體。
[0016]在某些實(shí)施方案中，輕鏈⑶R1XDR2或⑶R3氨基酸序列中的至少兩個(gè)示出于表1或 SEQ ID NO: 16-18,22-24 以及 28-30 中。
[0017]進(jìn)一步預(yù)期本文所述的抗體包含氨基酸序列與輕鏈可變區(qū)的所有三個(gè)LCDR具有至少70%同一性的多肽序列，IXDRl、IXDR2以及IXDR3的氨基酸序列示出于SEQIDNO: 16-18,22-24 以及 28-30 中。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所涵蓋的抗體包含與表1或SEQ ID N0:4、8以及12中所示出的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所述抗體包含與表1或SEQ ID N0:4、8以及12中所示出的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含與表1或SEQ ID NO:4,8以及12中所示出的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含表1或SEQ ID N0:4、8以及12中所示出的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
[0019]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的抗體包含(i)與輕鏈可變區(qū)的所有三個(gè)LCDR具有至少70%同一性的氨基酸序列，IXDR1、IXDR2以及IXDR3的氨基酸序列示出于SEQ IDNO: 16-18、22-24以及28-30中；以及(ii)與重鏈可變區(qū)的所有三個(gè)HCDR具有至少70%同一性的氨基酸序列，HCDRl、HCDR2以及HCDR3的氨基酸序列示出于SEQ ID NO: 13-15、19-21以及25-27中。
[0020]在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了一種結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGFβ ) 1、TGF^ 2以及TGFii 3的抗體，所述抗體包含輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，其中(a)所述輕鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID NO: 16,22以及28或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQID NO: 17,23以及29或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R2，和/或從SEQ IDNO: 18,24以及30或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R3 ;和/或其中(b)所述重鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID NO: 13、19以及25或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO: 14,20以及26或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R2，和/或從SEQ ID NO: 15,21以及27或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R3。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述輕鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID NO: 16或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO: 17或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQ ID NO: 18或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3 ;和/或所述重鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID NO: 13或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ IDNO: 14或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQ ID NO: 15或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3。
[0021]在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所述輕鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID N0:22或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO:23或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQ ID NO: 24或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3 ;和/或所述重鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID NO: 19或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO: 20或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQ IDNO:21或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3。
[0022]在某些實(shí)施方案中，所述輕鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID N0:28或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO:29或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQ ID NO:30或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3 ;和/或所述重鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID N0:25或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO:26或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQ IDNO:27或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3。
[0023]預(yù)期上述抗體序列中的任一個(gè)與本文所公開(kāi)的重鏈或輕鏈可變區(qū)或HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3中的任一個(gè)的同一性百分比可以是至少70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的同一性。
[0024]在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的抗體進(jìn)一步包含重鏈恒定區(qū)，其中所述重鏈恒定區(qū)是經(jīng)過(guò)修飾或未經(jīng)過(guò)修飾的IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、其片段或其組合。
[0025]在某些實(shí)施方案中，提供了一種抗體，在所述抗體中，一個(gè)或多個(gè)輕鏈框架氨基酸已被另一個(gè)人類(lèi)抗體氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的氨基酸置換。
[0026]在一個(gè)方面，本公開(kāi)的抗體是從由XPA.42.089、XPA.42.068以及XPA.42.681組成的群組中選出。XPA.42.089的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別示出于SEQ ID N0:6和8中。XPA.42.068的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別示出于SEQ ID NO: 2和4中，并且XPA.42.681的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別示出于SEQ ID NO: 10和12中。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的抗體進(jìn)一步包含與所述輕鏈可變區(qū)連接的人類(lèi)輕鏈恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述輕鏈恒定區(qū)是經(jīng)過(guò)修飾或未經(jīng)過(guò)修飾的λ輕鏈恒定區(qū)、κ輕鏈恒定區(qū)、其片段或其組合。
[0028]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供了一種以10-6Μ或更小的親和力Kd對(duì)TGF β 1、TGFii 2以及TGFii 3具有特異性的抗體。在示例性實(shí)施方案中，本文所述的抗TGFβ抗體以10_6Μ、10—110_8Μ、IO-9M或更小的親和力結(jié)合TGF β的至少一種亞型，或任選地結(jié)合兩種TGFβ亞型或所有TGFβ 1、TGF0 2或TGF0 3，對(duì)所述亞型中的一種或多種具有10-6Μ、1()-7Μ、10_8Μ、10_9Μ、ΙΟ,Μ、10_ηΜ或10_12Μ或更小的親和力。在其他實(shí)施方案中，本文所述的抗體與TGF β I和TGF β 2結(jié)合的親和力是與TGF β 3結(jié)合的親和力的至少2至50倍、10至100倍、2倍、5倍、10倍、25倍、50倍或100倍，或比與TGFP 3結(jié)合的親和力高20%至50%、50%至100%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如優(yōu)先與 TGFβ I 和 TGFP 2 結(jié)合)?；蛘撸疚乃龅目贵w與TGFii亞型TGFii 1、TGFii 2以及TGFii 3中的每一種結(jié)合的親和力是彼此的3倍、5倍或10倍以內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，所述抗體與TGF β I和TGF β 2結(jié)合的親和力大于與TGFii 3結(jié)合的親和力。在某些實(shí)施方案中，親和力是通過(guò)表面等離子體共振或KINEXA測(cè)定法來(lái)測(cè)量的。
[0029]在一些實(shí)施方案中，所述抗體中和TGF β I和TGF β 2活性的程度大于中和TGF β 3活性的程度。在一些實(shí)施方案中，抗體中和TGFii I和TGFii 2的效力是中和TGFii 3的效力的至少2至50倍、10至100倍、2倍、5倍、10倍、25倍、50倍或100倍，或比中和TGFP 3的效力大 20% 至 50%、50% 至 100%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。本文所涵蓋的示例性中和測(cè)定法包括但不限于白細(xì)胞介素-11釋放測(cè)定法和ΗΤ-2細(xì)胞增殖測(cè)定法。另外，可以進(jìn)行TGFii活性測(cè)定法以確定本文所公開(kāi)的抗體是否優(yōu)先抑制一種TGF3亞型，包括PSMAD磷酸化測(cè)定法或rhLAP結(jié)合測(cè)定法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相較于對(duì)TGF β 3的IC50，所述抗體對(duì)TGF β I和TGF β 2的IC50更低(即結(jié)合更佳、效力更大)。[0030]在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼如本文所述的重鏈和/或輕鏈的核苷酸序列。[0031]在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含與表達(dá)控制序列可操作地連接的本文所涵蓋的核酸分子。還涵蓋了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含本公開(kāi)的表達(dá)載體或核酸分子。在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核酸分子，其中重鏈核酸和輕鏈核酸由不同的核酸或在相同的核酸上表達(dá)。
[0032]在一個(gè)相關(guān)方面，本公開(kāi)提供了一種使用如本文所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，所述方法包括在適合的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞以及回收所述抗體。還提供了一種由本文所公開(kāi)的方法產(chǎn)生的抗體。
[0033]本公開(kāi)進(jìn)一步涵蓋了一種無(wú)菌藥物組合物，所述藥物組合物包含本文所公開(kāi)的抗體以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0034]在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了一種用于治療與TGFP表達(dá)相關(guān)的疾病、病狀或病癥的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的本文所涵蓋的抗體或藥物組合物的步驟。在某些實(shí)施方案中，所述疾病、病狀或病癥是從由以下各項(xiàng)組成的群組中選出:癌癥、眼睛(例如眼部、視力、眼科或眼科學(xué))疾病、病狀或病癥、與纖維化相關(guān)的疾病、病狀或病癥，例如纖維增生性疾病、病狀或病癥，或伴有相關(guān)纖維化的疾病、病狀或病癥。
[0035]纖維增生性疾病、病狀或病癥或者伴有相關(guān)纖維化的疾病包括累及體內(nèi)任何器官或組織的疾病，所述任何器官或組織包括但不限于皮膚、肺、腎臟、心臟、腦以及眼睛。纖維增生性疾病、病狀或病癥或者伴有相關(guān)纖維化的疾病包括但不限于肺纖維化、特發(fā)性肺纖維化、細(xì)支氣管周?chē)w維化、間質(zhì)性肺病、慢性阻塞性肺病(C0PD)、小氣管疾病(例如阻塞性細(xì)支氣管炎)、肺氣腫、成人或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性肺損傷(ALI)、因感染劑或毒性劑所致的肺纖維化、腎纖維化、由所有病因所致的腎小球腎炎(GN)、腎小球膜增生性GN、免疫性GN、新月體性GN、腎小球硬化癥、腎小管間質(zhì)損傷、腎間質(zhì)性纖維化、腎纖維化以及腎間質(zhì)性纖維化的所有成因、由藥物暴露(包括對(duì)移植接受者進(jìn)行的環(huán)孢菌素(cyclosporin)治療)的并發(fā)癥引起的腎纖維化、HIV相關(guān)腎病、移植腎病、糖尿病性腎臟疾病、糖尿病性腎病、腎原性全身性纖維化、糖尿病、特發(fā)性腹膜后纖維化、硬皮病、肝纖維化、與過(guò)度瘢痕形成和進(jìn)行性硬化相關(guān)的肝臟疾病、因所有病因所致的肝硬化、膽道系統(tǒng)病癥、可歸因于感染的肝功能失調(diào)、纖維囊性疾病、心血管疾病、充血性心力衰竭、擴(kuò)張性心肌病、心肌炎、血管狹窄、心臟纖維化、梗塞后心臟纖維化、后壁心肌梗塞、左心室肥大、靜脈閉塞性疾病、再狹窄、血管成形術(shù)后再狹窄、動(dòng)靜脈移植失敗、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、高血壓性心臟病、心臟肥大、肥厚型心肌病、心力衰竭、主動(dòng)脈疾病、進(jìn)行性全身性硬化；多發(fā)性肌炎；全身性紅斑狼瘡；皮肌炎、筋膜炎、雷諾氏綜合征(Raynaud’s syndrome)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、由任何病因所致的玻璃體視網(wǎng)膜病、與眼部手術(shù)、對(duì)青光眼的治療、視網(wǎng)膜復(fù)置術(shù)、白內(nèi)障摘除術(shù)或任何種類(lèi)的引流程序相關(guān)的纖維化、角膜和結(jié)膜中的瘢痕形成、角膜內(nèi)皮纖維化、堿燒傷(例如角膜堿燒傷)、白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體囊纖維化、斜視手術(shù)中圍繞眼外肌的組織中過(guò)度瘢痕形成、前囊下白內(nèi)障和后囊膜渾濁、眼睛前段纖維化疾病、角膜基質(zhì)纖維化、與角膜渾濁相關(guān)的纖維化、小梁網(wǎng)纖維化、與青光眼相關(guān)的纖維化、眼睛后段纖維化疾病、纖維血管性瘢痕形成、眼睛視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜血管結(jié)構(gòu)纖維化、視網(wǎng)膜纖維化、視網(wǎng)膜前纖維化、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)增生、視網(wǎng)膜下纖維化、與年齡相關(guān)性黃斑變性相關(guān)的纖維化、與視網(wǎng)膜和青光眼手術(shù)后相關(guān)的纖維化、與糖尿病性視網(wǎng)膜病中的組織收縮相關(guān)的牽拉性視網(wǎng)膜脫離、佩羅尼氏病(Peyronie’s disease)、全身性硬化、脊髓損傷后、骨質(zhì)疏松癥、卡-恩二氏病(Camurat1-Engelmann disease)、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、瘢痕形成、馬凡氏綜合征(Marfan syndrome)、卵巢早衰、阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s Disease)、帕金森氏病(Parkinson’s Disease)、因手術(shù)切口或機(jī)械性創(chuàng)傷所致的纖維化、與眼部手術(shù)相關(guān)的纖維化，以及由創(chuàng)傷或手術(shù)傷口引起的在傷口愈合期間皮膚中出現(xiàn)的過(guò)度或肥厚性瘢痕或瘢痕瘤形成。
[0036]示例性眼睛疾病(例如眼部、視力、眼科或眼科學(xué)疾病)、病狀或病癥包括但不限于纖維增生性病癥、眼睛纖維化、眼科纖維組織形成、視網(wǎng)膜功能失調(diào)、與視網(wǎng)膜功能失調(diào)相關(guān)的纖維化、濕性或干性黃斑變性、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、由任何病因所致的玻璃體視網(wǎng)膜病、與眼部手術(shù)(如對(duì)青光眼的治療、視網(wǎng)膜復(fù)置術(shù)、白內(nèi)障摘除術(shù)或任何種類(lèi)的引流程序)相關(guān)的纖維化、角膜和結(jié)膜中的瘢痕形成、角膜內(nèi)皮纖維化、堿燒傷(例如角膜堿燒傷)、白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體囊纖維化、斜視手術(shù)中圍繞眼外肌的組織中過(guò)度瘢痕形成、前囊下白內(nèi)障和后囊膜渾濁、眼睛前段纖維化疾病、角膜基質(zhì)纖維化(例如與角膜渾濁相關(guān))、小梁網(wǎng)纖維化(例如與青光眼相關(guān))、眼睛后段纖維化疾病、纖維血管性瘢痕形成(例如眼睛視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜血管結(jié)構(gòu)中)、視網(wǎng)膜纖維化、視網(wǎng)膜前纖維化、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)增生、視網(wǎng)膜下纖維化(例如與年齡相關(guān)性黃斑變性相關(guān))、與視網(wǎng)膜和青光眼手術(shù)后相關(guān)的纖維化、與糖尿病性視網(wǎng)膜病中的組織收縮相關(guān)的牽拉性視網(wǎng)膜脫離。
[0037]示例性的眼睛纖維增生性疾病、病狀或病癥、眼睛纖維化、眼部纖維化或眼科纖維組織形成包括但不限于增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、由任何病因所致的玻璃體視網(wǎng)膜病、與視網(wǎng)膜功能失調(diào)相關(guān)的纖維化、與濕性或干性黃斑變性相關(guān)的纖維化、與眼部手術(shù)(如對(duì)青光眼的治療、視網(wǎng)膜復(fù)置術(shù)、白內(nèi)障摘除術(shù)或任何種類(lèi)的引流程序)相關(guān)的纖維化、角膜和結(jié)膜中的瘢痕形成、角膜內(nèi)皮纖維化、與堿燒傷相關(guān)的纖維化、白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體囊纖維化、斜視手術(shù)中圍繞眼外肌的組織中過(guò)度瘢痕形成、前囊下白內(nèi)障和后囊膜渾濁、眼睛前段纖維化疾病、角膜基質(zhì) 纖維血管性瘢痕形成(例如眼睛視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜血管結(jié)構(gòu)中)、視網(wǎng)膜纖維化、視網(wǎng)膜前纖維化、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)增生、視網(wǎng)膜下纖維化(例如與年齡相關(guān)性黃斑變性相關(guān))、與視網(wǎng)膜和青光眼手術(shù)后相關(guān)的纖維化、與糖尿病性視網(wǎng)膜病中的組織收縮相關(guān)的牽拉性視網(wǎng)膜脫離。 [0038]在不同的實(shí)施方案中，眼睛纖維增生性疾病、病狀或病癥是從由以下各項(xiàng)組成的群組中選出:增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、與眼部手術(shù)相關(guān)的纖維化、白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體纖維化、角膜基質(zhì)纖維化以及堿燒傷。
[0039]在一個(gè)相關(guān)方面，本公開(kāi)提供了一種用于治療癌癥的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的本文所涵蓋的抗體或藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥是從由以下各項(xiàng)組成的群組中選出:肺癌、前列腺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、食道癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、胃癌、纖維變性癌癥、神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及黑色素瘤。
[0040]在一些實(shí)施方案中，所述抗體或組合物使腫瘤中的自然殺傷(NK)細(xì)胞的數(shù)目增加。在不同的實(shí)施方案中，所述抗體或組合物能夠提高NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。舉例來(lái)說(shuō)，在不同的實(shí)施方案中，本文所述的抗體或組合物能夠增加NK細(xì)胞的穿孔素和顆粒酶的產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是XPA.42.089或XPA.42.681。
[0041]在不同的實(shí)施方案中，本文所述的抗體或組合物使腫瘤中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)目減少和/或抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能。舉例來(lái)說(shuō)，在不同的實(shí)施方案中，本文所述的抗體或組合物抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞下調(diào)免疫應(yīng)答或遷移至免疫應(yīng)答部位的能力。
[0042]在不同的實(shí)施方案中，所述抗體或組合物使腫瘤中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的數(shù)目增加和/或增強(qiáng)CTL活性，例如加強(qiáng)、提高或促進(jìn)CTL活性。舉例來(lái)說(shuō)，在不同的實(shí)施方案中，本文所述的抗體或組合物使CTL的穿孔素和顆粒酶的產(chǎn)生增加并且提高CTL的細(xì)胞溶解活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是XPA.42.068、XPA.42.089或XPA.42.681。
[0043]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體或組合物使腫瘤中單核細(xì)胞衍生的干細(xì)胞(MDSC)的數(shù)目減少和/或抑制MDSC的功能。舉例來(lái)說(shuō)，在不同的實(shí)施方案中，本文所述的抗體或組合物抑制MDSC抑制免疫應(yīng)答的能力，抑制MDSC的免疫抑制活性和/或抑制MDSC以促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)充和/或功能的能力。在不同的實(shí)施方案中，所述抗體是從由XPA.42.089、XPA.42.068以及XPA.42.681組成的群組中選出。
[0044]在不同的實(shí)施方案中，所述抗體使腫瘤中樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的數(shù)目減少和/或抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的致耐受性功能(例如致耐受性作用)。舉例來(lái)說(shuō)，在不同的實(shí)施方案中，本文所述的抗體或組合物降低CD8+樹(shù)突狀細(xì)胞的致耐受性作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是XPA.42.089 或 XPA.42.681。
[0045]在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了一種用于治療纖維化的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的本文所涵蓋的抗體或藥物組合物。
[0046]在不同的實(shí)施方案中，將所述抗體與第二藥劑一起施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二藥劑是從由以下各項(xiàng)組成的群組中選出:細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白、抗纖維化劑、手術(shù)療法、化學(xué)療法、細(xì)胞毒性劑或放射療法。示例性的第二藥劑更詳細(xì)地公開(kāi)于發(fā)明詳述中。
[0047]在不同的實(shí)施方案中，定期施用療法，例如每小時(shí)、每天、每周、每2周、每3周、每月或以更長(zhǎng)的時(shí)間間隔施用一次。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，在示例性治療中，可以施用以下劑量的本文所公開(kāi)的抗體:約I暈克/天、5暈克/天、10暈克/天、20暈克/天、50暈克/天、75暈克/天、100暈克/天、150暈克/天、200暈克/天、250暈克/天、500暈克/天或1000毫克/天。這些濃度可以作為單次劑型或作為多次劑量施用。
[0048]還涵蓋了一種包含本公開(kāi)的結(jié)合TGF0的任何上述抗體或組合物的組合物或其用于制備治療本文所述的與TGF β表達(dá)相關(guān)的任何病癥的藥劑的用途。還涵蓋了包含任何上述抗體或組合物并且任選地附有適合的使用說(shuō)明書(shū)的注射器，例如一次性或預(yù)填充的注射器；無(wú)菌密封容器，例如小瓶、瓶子、器皿；和/或試劑盒或包裝。
[0049]應(yīng)了解的是，本文所述的每個(gè)特征或?qū)嵤┓桨富蚪M合是本發(fā)明的任何方面的一個(gè)非限制性說(shuō)明性實(shí)例，并且因而，意圖可與本文所述的任何其他特征或?qū)嵤┓桨富蚪M合相組合。舉例來(lái)說(shuō)，在用如“一個(gè)實(shí)施方案”、“一些實(shí)施方案”、“某些實(shí)施方案”、“另外的實(shí)施方案”、“具體的示例性實(shí)施方案”和/或“另一個(gè)實(shí)施方案”的措辭描述特征的情況下，這些類(lèi)型的實(shí)施方案中的每一個(gè)均是一種特征的一個(gè)非限制性實(shí)例，旨在與本文所述的任何其他特征或特征的組合相組合而無(wú)需列出每一種可能的組合。這些特征或特征組合適用于本發(fā)明的任何方面。在公開(kāi)了屬于范圍內(nèi)的值的實(shí)例時(shí)，這些實(shí)例中的任一個(gè)被涵蓋作為范圍可能的終點(diǎn)，涵蓋了這些終點(diǎn)之間的任何和所有數(shù)值，并且設(shè)想了上限終點(diǎn)和下限終點(diǎn)的任何和所有組合。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0050]圖1是示出了 TGF β抗體與TGF β I競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合rhLAP的圖表。[0051]圖2示出了 TGF3抗體對(duì)細(xì)胞中的pSMAD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中和作用。(A)TGF^ I ； (B)TGF β 2 ; (C)TGF^ 3。
[0052]圖3是示出了 TGFP抗體對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的抑制作用的圖表。
[0053]圖4是示出了 TGF β抗體在異種移植小鼠模型中的腫瘤抑制作用的圖表。
[0054]圖5是示出了 TGFβ抗體在異種移植小鼠模型中的腫瘤抑制作用的圖表。
[0055]圖6是示出了 TGFP抗體在同基因小鼠模型中的腫瘤抑制作用的圖表。
[0056]圖7是示出了 TGFP抗體在同基因小鼠模型中的腫瘤抑制作用的圖表。
[0057]圖8是示出了 TGFP抗體在同基因小鼠模型中的腫瘤抑制作用的圖表。
[0058]圖9是示出了 TGFP抗體在同基因小鼠模型中的腫瘤抑制作用的圖表。
[0059]圖10是示出了 TGFP抗體在同基因小鼠腫瘤模型中對(duì)腫瘤中的自然殺傷細(xì)胞的體內(nèi)作用的圖表。
[0060]圖11是示出了 TGFP抗體在同基因小鼠模型中對(duì)腫瘤中的骨髓衍生抑制性細(xì)胞的體內(nèi)作用的圖表。
[0061]圖12是示出了 TGFP抗體在同基因小鼠腫瘤模型中對(duì)腫瘤中的樹(shù)突狀細(xì)胞的體內(nèi)作用的圖表。
[0062]圖13是示出了 TGFP抗體在同基因小鼠腫瘤模型中對(duì)腫瘤中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的體內(nèi)作用的圖表。
[0063]圖14是示出了 TGFP抗體在同基因小鼠腫瘤模型中對(duì)腫瘤中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的體內(nèi)作用的圖表。
[0064]圖15是示出了 TGF β抗體對(duì)NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性的體外作用的圖表。
[0065]圖16是示出了 TGF β抗體對(duì)T細(xì)胞增殖的作用的圖表。
[0066]圖17是示出了通過(guò)顆粒酶B (GzmB)(圖17Α)和穿孔素(圖17Β)的表達(dá)所評(píng)價(jià)的TGF β抗體對(duì)CTL活化的作用的圖表。
[0067]圖18是示出了 TGF β抗體在接受TGF β抗體施用的經(jīng)過(guò)CsA處理的動(dòng)物或?qū)φ談?dòng)物中對(duì)血清血尿素氮(BUN)水平的作用的圖表。
[0068]圖19是示出了 TGF β抗體對(duì)接受TGF β抗體施用的經(jīng)過(guò)CsA處理的動(dòng)物或?qū)φ談?dòng)物的尿中白蛋白積聚的作用的圖表，所述白蛋白積聚是病腎中的腎小球功能失調(diào)的特征。
[0069]圖20是示出了 TGF β抗體對(duì)接受TGF β抗體施用的經(jīng)過(guò)CsA處理的動(dòng)物或?qū)φ談?dòng)物的尿中尿IV型膠原蛋白水平的作用的圖表，所述尿IV型膠原蛋白的水平反映了腎中ECM沉積和纖維化的程度。
[0070]圖21是示出了如通過(guò)對(duì)腎臟組織進(jìn)行定量RT-PCR所評(píng)估的TGF β抗體對(duì)牽涉到纖維化的基因表達(dá)的作用的圖表。在接受TGFii抗體施用的經(jīng)過(guò)CsA處理的動(dòng)物或?qū)φ談?dòng)物中評(píng)估對(duì)TGF-β I表達(dá)(圖21Α)和III型膠原蛋白(圖21Β)的作用。
[0071]圖22是示出了在施用TGFP I后TGFP抗體對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞中PSMAD2增加的作用的圖表。
【具體實(shí)施方式】
[0072]本公開(kāi)提供了治療與TGF0表達(dá)相關(guān)的病狀或病癥(例如癌癥和纖維化)的治療劑。本公開(kāi)提供了與TGFii相互作用并且抑制它的一種或多種功能作用(例如像經(jīng)由結(jié)合TGF^的配偶體進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))的分子或藥劑。本文所公開(kāi)的組合物有利地能夠調(diào)節(jié)腫瘤中的免疫細(xì)胞活性，從而在一個(gè)方面，提供了一種通過(guò)影響直接或間接影響腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞群體來(lái)治療癌癥的方法。
[0073]為了能夠更完全地了解本公開(kāi)，對(duì)若干定義進(jìn)行闡明。
[0074]如本文所用的“靶標(biāo)”或“靶標(biāo)抗原”指的是任何或所有TGF-β分子，包括TGF3 1、TGFβ 2以及TGFβ 3在內(nèi)。
[0075]如本文所用的“TGF β ”指的是TGF β的任意一種或多種亞型，包括TGF β UTGF β 2以及TGF3 3或其變體。同樣，除非另外指明，否則術(shù)語(yǔ)“TGF3受體”是指結(jié)合至少一種TGF β亞型的任何受體。
[0076]如本文所用的抗靶標(biāo)抗體的“所需生物活性”是與TGF0結(jié)合并且抑制它的一種或多種功能作用的能力。
[0077]如本文所用的“與靶標(biāo)表達(dá)相關(guān)的病狀”或“病癥”是靶標(biāo)活性有害的病狀或病癥，并且包括如下的疾病和其他病癥，在所述疾病和其他病癥中，高水平的靶標(biāo)已經(jīng)顯示或被懷疑是導(dǎo)致病癥的病理生理學(xué)的原因或促使病癥惡化的因素；以及如下的疾病和其他病癥，在所述疾病和其他病癥中，高水平的靶標(biāo)表達(dá)與不希望有的臨床體征或癥狀有關(guān)。這些病癥的證據(jù)可能是例如患有該病癥的受試者所分泌的和/或細(xì)胞表面上的靶標(biāo)水平增加和/或受影響的細(xì)胞或組織中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加。可以例如使用如本文所述的靶標(biāo)特異性抗體來(lái)檢測(cè)靶標(biāo)水平的增加。
[0078]可以用結(jié)合TGF β的抗體物質(zhì)(例如本公開(kāi)的抗體)治療的示例性的與TGF β表達(dá)相關(guān)的疾病、病狀或病癥包括癌癥，如肺癌、前列腺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、食道癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、胃癌、纖維變性癌癥、神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及黑色素瘤、眼睛(例如眼部、視力、眼科或眼科學(xué))疾病、病狀或病癥、與纖維化相關(guān)的疾病、病狀或病癥，例如纖維增生性疾病、病狀或病癥,或伴有相關(guān)纖維化的疾病、病狀或病癥。
[0079]纖維增生性疾病、病狀或病癥或者伴有相關(guān)纖維化的疾病、病狀或病癥包括累及體內(nèi)任何器官或組織的疾病，所述任何器官或組織包括但不限于皮膚、肺、腎臟、心臟、腦以及眼睛。纖維增生性疾病、病狀或病癥或者伴有相關(guān)纖維化的疾病包括但不限于肺纖維化、特發(fā)性肺纖維化、細(xì)支氣管周?chē)w維化、間質(zhì)性肺病、慢性阻塞性肺病(COPD)、小氣管疾病(例如阻塞性細(xì)支氣管炎)、肺氣腫、成人或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性肺損傷(ALI)、因感染劑或毒性劑所致的肺纖維化、腎纖維化、由所有病因所致的腎小球腎炎(GN)，例如腎小球膜增生性GN、免疫性GN以及新月體性GN ；腎小球硬化癥、腎小管間質(zhì)損傷、腎間質(zhì)性纖維化、腎纖維化以及腎間質(zhì)性纖維化的所有成因、由藥物暴露(包括對(duì)移植接受者進(jìn)行的環(huán)孢菌素治療，例如環(huán)孢菌素治療)的并發(fā)癥引起的腎纖維化、HIV相關(guān)腎病、移植腎病、糖尿病性腎臟疾病(例如糖尿病性腎病)、腎原性全身性纖維化、糖尿病、特發(fā)性腹膜后纖維化、硬皮病、肝纖維化、與過(guò)度瘢痕形成和進(jìn)行性硬化相關(guān)的肝臟疾病，包括因所有病因所致的肝硬化；膽道系統(tǒng)的病癥、可歸因于感染的肝功能失調(diào)、纖維囊性疾病、心血管疾病，如充血性心力衰竭；擴(kuò)張性心肌病、心肌炎、血管狹窄、心臟纖維化(例如梗塞后心臟纖維化)、后壁心肌梗塞、左心室肥大、靜脈閉塞性疾病、再狹窄(例如血管成形術(shù)后再狹窄)、動(dòng)靜脈移植失敗、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、高血壓性心臟病、心臟肥大、肥厚型心肌病、心力衰竭、主動(dòng)脈疾病、進(jìn)行性全身性硬化、多發(fā)性肌炎、全身性紅斑狼瘡、皮肌炎、筋膜炎、雷諾氏綜合征、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、由任何病因所致的玻璃體視網(wǎng)膜病或與眼部手術(shù)(如對(duì)青光眼的治療、視網(wǎng)膜復(fù)置術(shù)、白內(nèi)障摘除術(shù)或任何種類(lèi)的引流程序)相關(guān)的纖維化、角膜和結(jié)膜中的瘢痕形成、角膜內(nèi)皮纖維化、堿燒傷(例如角膜堿燒傷)、白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體囊纖維化、斜視手術(shù)中圍繞眼外肌的組織中過(guò)度瘢痕形成、前囊下白內(nèi)障和后囊膜渾濁、眼睛前段纖維化疾病、角膜基 質(zhì)纖維化(例如與角膜渾濁相關(guān))、小梁網(wǎng)纖維化(例如與青光眼相關(guān))、眼睛后段纖維化疾病、纖維血管性瘢痕形成(例如眼睛視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜血管結(jié)構(gòu)中)、視網(wǎng)膜纖維化、視網(wǎng)膜前纖維化、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)增生、視網(wǎng)膜下纖維化(例如與年齡相關(guān)性黃斑變性相關(guān))、與視網(wǎng)膜和青光眼手術(shù)后相關(guān)的纖維化、與糖尿病性視網(wǎng)膜病中的組織收縮相關(guān)的牽拉性視網(wǎng)膜脫離、佩羅尼氏病、全身性硬化、脊髓損傷后、骨質(zhì)疏松癥、卡-恩二氏病、克羅恩氏病、瘢痕形成、馬凡氏綜合征、卵巢早衰、阿爾茨海默氏病和帕金森氏病、因手術(shù)切口或機(jī)械性創(chuàng)傷所致的纖維化、與眼部手術(shù)相關(guān)的纖維化；以及由創(chuàng)傷或手術(shù)傷口引起的在傷口愈合期間皮膚中出現(xiàn)的過(guò)度或肥厚性瘢痕或瘢痕瘤形成。
[0080]示例性眼睛疾病(例如眼部、視力、眼科或眼科學(xué)疾病)、病狀或病癥包括但不限于纖維增生性病癥、眼睛纖維化、眼科纖維組織形成、視網(wǎng)膜功能失調(diào)、與視網(wǎng)膜功能失調(diào)相關(guān)的纖維化、濕性或干性黃斑變性、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、由任何病因所致的玻璃體視網(wǎng)膜病、與眼部手術(shù)(如對(duì)青光眼的治療、視網(wǎng)膜復(fù)置術(shù)、白內(nèi)障摘除術(shù)或任何種類(lèi)的引流程序)相關(guān)的纖維化、角膜和結(jié)膜中的瘢痕形成、角膜內(nèi)皮纖維化、堿燒傷(例如角膜堿燒傷)、白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體囊纖維化、斜視手術(shù)中圍繞眼外肌的組織中過(guò)度瘢痕形成、前囊下白內(nèi)障和后囊膜渾濁、眼睛前段纖維化疾病、角膜基質(zhì)纖維化(例如與角膜渾濁相關(guān))、小梁網(wǎng)纖維化(例如與青光眼相關(guān))、眼睛后段纖維化疾病、纖維血管性瘢痕形成(例如眼睛視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜血管結(jié)構(gòu)中)、視網(wǎng)膜纖維化、視網(wǎng)膜前纖維化、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)增生、視網(wǎng)膜下纖維化(例如與年齡相關(guān)性黃斑變性相關(guān))、與視網(wǎng)膜和青光眼手術(shù)后相關(guān)的纖維化、與糖尿病性視網(wǎng)膜病中的組織收縮相關(guān)的牽拉性視網(wǎng)膜脫離。
[0081]示例性的眼睛纖維增生性疾病、病狀或病癥、眼睛纖維化、眼部纖維化或眼科纖維組織形成包括但不限于增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、由任何病因所致的玻璃體視網(wǎng)膜病、與視網(wǎng)膜功能失調(diào)相關(guān)的纖維化、與濕性或干性黃斑變性相關(guān)的纖維化、與眼部手術(shù)(如對(duì)青光眼的治療、視網(wǎng)膜復(fù)置術(shù)、白內(nèi)障摘除術(shù)或任何種類(lèi)的引流程序)相關(guān)的纖維化、角膜和結(jié)膜中的瘢痕形成、角膜內(nèi)皮纖維化、與堿燒傷相關(guān)的纖維化、白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體囊纖維化、斜視手術(shù)中圍繞眼外肌的組織中過(guò)度瘢痕形成、前囊下白內(nèi)障和后囊膜渾濁、眼睛前段纖維化疾病、角膜基質(zhì)纖維化(例如與角膜渾濁相關(guān))、小梁網(wǎng)纖維化(例如與青光眼相關(guān))、眼睛后段纖維化疾病、纖維血管性瘢痕形成(例如眼睛視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜血管結(jié)構(gòu)中)、視網(wǎng)膜纖維化、視網(wǎng)膜前纖維化、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)增生、視網(wǎng)膜下纖維化(例如與年齡相關(guān)性黃斑變性相關(guān))、與視網(wǎng)膜和青光眼手術(shù)后相關(guān)的纖維化、與糖尿病性視網(wǎng)膜病中的組織收縮相關(guān)的牽拉性視網(wǎng)膜脫離。
[0082]在不同的實(shí)施方案中，眼睛纖維增生性疾病、病狀或病癥是從由以下各項(xiàng)組成的群組中選出:增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、與眼部手術(shù)相關(guān)的纖維化、白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體纖維化、角膜基質(zhì)纖維化以及堿燒傷。
[0083]“免疫球蛋白”或“天然抗體”是四聚糖蛋白。在天然存在的免疫球蛋白中，每個(gè)四聚體由兩對(duì)相同的多肽鏈構(gòu)成，每對(duì)具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基端部分包括主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的具有約100至110個(gè)或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。每條鏈的羧基端部分界定了主要負(fù)責(zé)效應(yīng)功能的恒定區(qū)。人類(lèi)輕鏈被分類(lèi)為K和λ輕鏈。重鏈被分類(lèi)為μ、Δ、y、α以及ε ,并且將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA以及IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)與恒定區(qū)由具有約12個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“J”區(qū)接合，其中重鏈還包括具有約10個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“D”區(qū)。大體上參見(jiàn) Fundamental Immunology 的第 7 章(Paul, W.編著,第 2 版，Raven Press, N.Y.(1989))(出于所有目的以引用的方式整體并入本文)。每對(duì)輕鏈/重鏈的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)，因此完整的免疫球蛋白具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
[0084]每條重鏈在一端上具有可變域(VH)，后面是多個(gè)恒定域。每條輕鏈在一端上具有可變域(VL)并且在它的另一端上具有恒定域；輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域?qū)?zhǔn)，并且輕鏈可變域與重鏈的可變域?qū)?zhǔn)。特定的氨基酸殘基被認(rèn)為形成了輕鏈可變域與重鏈可變域之間的界面(Chothia 等，J.Mol.Biol.196:901-917，1987)。
[0085]免疫球蛋白可變域展現(xiàn)出相同的由三個(gè)高變區(qū)或CDR所接合的相對(duì)保守的框架區(qū)(FR)的通用結(jié)構(gòu)。從N端到C端，輕鏈和重鏈均包含結(jié)構(gòu)域FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4。氨基酸于每個(gè)結(jié)構(gòu)域中的歸屬是根據(jù)以下文獻(xiàn)中的定義:Kabat Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1987 和 1991))；或 Chothia 和 Lesk (J.Mol.Biol.196:901-917，1987) ；Chothia 等(Nature342:878-883, 1989)。
[0086] 抗體的高變區(qū)是指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的CDR氨基酸殘基。高變區(qū)包含CDR中的氨基酸殘基[例如輕鏈可變域中的殘基24-34 (L1),50-56 (L2)和89-97(L3)以及重鏈可變域中的殘基31-35 (HO,50-65 (H2)和95-102 (H3)，如由Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版,Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)所述]和 / 或高變環(huán)中的那些殘基(例如輕鏈可變域中的殘基26-32 (L1),50-52 (L2)和91-96 (L3)以及重鏈可變域中的殘基 26-32 (HO,53-55 (H2)和 96-101 (H3)，如由 Chothia 等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)所述]。CDR 還已經(jīng)根據(jù) ImMunoGenTics (IMGT)編號(hào)來(lái)加以鑒定和編號(hào)(Lefranc, M.-P.，The Immunologist, 7，132-136 (1999) ；Lefranc, Μ.-P.等，Dev.Comp.1mmunol.，27，55-77 (2003)，其將輕鏈和重鏈可變域中的⑶R位置描述如下:⑶R1，大致殘基27至38 KDR2，大致殘基56至65 ;以及⑶R3，大致殘基105至116 (生殖系)或殘基105至117 (經(jīng)過(guò)重排))。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期在長(zhǎng)度與本文所公開(kāi)的抗體重鏈或輕鏈大致相似的抗體重鏈或輕鏈中，⑶R在輕鏈可變域中位于大致殘基26-31 (LI),49-51(L2)以及88-98 (L3)處并且在重鏈可變域中位于大致殘基26-33 (HO,50-58 (H2)以及97-111 (H3)處。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在對(duì)具體抗體的序列進(jìn)行鑒定時(shí)，CDR殘基的實(shí)際位置可能不同于上述所預(yù)計(jì)的殘基。
[0087]框架或FR殘基是除高變區(qū)殘基以外的那些可變域殘基。
[0088]如本文所用的“重鏈可變區(qū)”是指抗體分子中包含所述抗體重鏈可變域的至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)的區(qū)域。重鏈可變區(qū)可以含有所述抗體重鏈的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)⑶R。
[0089]如本文所用的“輕鏈可變區(qū)”是指抗體分子中包含所述抗體輕鏈可變域的至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的區(qū)域。輕鏈可變區(qū)可以含有所述抗體輕鏈的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)CDR，所述抗體輕鏈取決于所述抗體可以是κ或λ輕鏈。
[0090]術(shù)語(yǔ)“抗體”在最廣泛的意義上使用并且包括完全組裝的抗體、四聚抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、可以結(jié)合抗原的抗體片段(例如Fab’、F’(ab)2、Fv、單鏈抗體、雙鏈抗體)，以及包含以上各項(xiàng)的重組肽，只要它們展現(xiàn)出所需的生物活性即可?！懊庖咔虻鞍住被颉八木劭贵w”是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四聚糖蛋白，所述重鏈和輕鏈各自包含可變區(qū)和恒定區(qū)?？梢酝ㄟ^(guò)重組DNA技術(shù)或通過(guò)對(duì)完整抗體進(jìn)行酶促或化學(xué)切割而產(chǎn)生抗原結(jié)合部分?？贵w片段或抗原結(jié)合部分尤其包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、結(jié)構(gòu)域抗`體(dAb)、互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)片段、⑶R移植抗體、單鏈抗體(scFv)、單鏈抗體片段、嵌合抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體(minibody)、線性抗體；螯合重組抗體、三體(tribody)或雙體(bibody)、胞內(nèi)抗體、納米抗體、小模塊免疫藥物(SMIP)、抗原結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白、駱駝源化抗體、含VHH抗體或其變體或衍生物，以及含有至少一部分免疫球蛋白的多肽，所述至少一部分免疫球蛋白足以賦予所述多肽以特異性抗原結(jié)合性，如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)CDR序列，只要所述抗體保持所需的生物活性即可。
[0091]“單克隆抗體”是指從一群大致上均質(zhì)的抗體中獲得的抗體，即除了可能少量存在的可能的天然存在的突變以外，構(gòu)成該群體的單獨(dú)的抗體是相同的。
[0092]如本文所用的“抗體變體”是指在參考抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)中含有至少一處氨基酸取代、缺失或插入的抗體多肽序列。變體可能與未經(jīng)過(guò)修飾的抗體大致上具有同源性或大致上具有同一性。
[0093]如本文所用的“嵌合抗體”指的是含有源自于兩個(gè)不同抗體的序列的抗體(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，567)，所述兩個(gè)不同的抗體典型地來(lái)源于不同的物種。最典型地，嵌合抗體包含人類(lèi)和嚙齒動(dòng)物抗體片段，一般是人類(lèi)恒定區(qū)和小鼠可變區(qū)。
[0094]“中和抗體”是能夠消除或顯著降低它所結(jié)合的靶標(biāo)抗原的生物功能的抗體分子。因此，“中和”抗靶標(biāo)抗體能夠消除或顯著降低如酶活性、配體結(jié)合或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物功能。
[0095]“分離”的抗體是已經(jīng)過(guò)鑒定并且與它的天然環(huán)境中的組分分離并回收的抗體。它的天然環(huán)境中的污染性組分是會(huì)干擾抗體的診斷性或治療性使用的物質(zhì)，并且可能包括酶、激素以及其他蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶解物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體經(jīng)過(guò)純化以達(dá)到如下的程度:(1)如通過(guò)勞里法(Lowry method)所測(cè)定，抗體多于95重量％，并且最優(yōu)選地多于99重量％;(2)足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得N端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度；或(3)通過(guò)在還原或非還原條件下使用考馬斯藍(lán)(Coomassie blue)或優(yōu)選地使用銀染色劑進(jìn)行SDS-PAGE測(cè)定具有均一性。分離的抗體包括原位處于重組細(xì)胞內(nèi)的抗體，這是因?yàn)榭贵w的天然環(huán)境中的至少一種組分將不會(huì)存在。然而，通常，將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備分離的抗體。
[0096]如本文所用的“特異性結(jié)合”靶標(biāo)抗原、“具有靶標(biāo)特異性”、“對(duì)靶標(biāo)具有特異性”或?qū)Π袠?biāo)抗原“具有免疫反應(yīng)性”的抗體指的是與靶標(biāo)抗原結(jié)合的親和力大于與類(lèi)似抗原結(jié)合的親和力的抗體或抗體物質(zhì)。在本公開(kāi)的一個(gè)方面，靶標(biāo)結(jié)合多肽或其片段、變體或衍生物與人類(lèi)靶標(biāo)結(jié)合的親和力將大于它與其他(即非人類(lèi))物種的靶標(biāo)的結(jié)合親和力，但識(shí)別并且結(jié)合所述靶標(biāo)的直系同源物的結(jié)合多肽在所提供的范圍以內(nèi)。
[0097]舉例來(lái)說(shuō)，多肽為對(duì)它的同源抗原“具有特異性”的抗體或其片段指示所述抗體的可變區(qū)以可檢測(cè)到的優(yōu)先度識(shí)別并且結(jié)合所關(guān)注的多肽(即雖然在家族成員之間可能存在局部序列同一性、同源性 或相似性，但是能夠借助于結(jié)合親和力方面的可測(cè)量的差異將所關(guān)注的多肽與同一家族的其他已知多肽相區(qū)別)。應(yīng)了解，特異性抗體還可以經(jīng)由與抗體可變區(qū)以外并且特別是分子恒定區(qū)中的序列相互作用來(lái)與其他蛋白質(zhì)(例如金黃色葡萄球菌(S.aureus)蛋白質(zhì)A或ELISA技術(shù)中的其他抗體)相互作用。用于本公開(kāi)方法中的測(cè)定抗體的結(jié)合特異性的篩選測(cè)定法是本領(lǐng)域熟知的并且按常規(guī)執(zhí)行的。關(guān)于這些測(cè)定法的綜合性論述，參見(jiàn) Harlow 等(編著)，Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring HarborLaboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988),第6章。用于所述方法中的抗體可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)產(chǎn)生。
[0098]術(shù)語(yǔ)“表位”指的是任何分子中能夠由選擇性結(jié)合劑在一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合區(qū)中識(shí)別并且結(jié)合的部分。表位通常由分子中具有化學(xué)活性的表面基團(tuán)(如氨基酸或碳水化合物側(cè)鏈)組成，并且具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。如本文所用的表位可能是連續(xù)的或不連續(xù)的。此外，表位可能是模擬物(模擬表位)，因?yàn)樗鼈儼c用于產(chǎn)生抗體的表位相同的三維結(jié)構(gòu)，但不包含被用于刺激抗體免疫應(yīng)答的靶標(biāo)中存在的氨基酸殘基或僅包含所述氨基酸殘基中的一些。如本文所用的模擬表位并非被認(rèn)為是與由選擇性結(jié)合劑結(jié)合的表位不同的抗原；選擇性結(jié)合劑能夠識(shí)別表位和模擬表位的相同三維結(jié)構(gòu)。
[0099]術(shù)語(yǔ)“衍生物”在結(jié)合本公開(kāi)的抗體物質(zhì)和多肽使用時(shí)指的是通過(guò)如下的技術(shù)化學(xué)修飾的多肽:泛素化、與治療劑或診斷劑綴合、標(biāo)記(例如用放射性核素或不同的酶標(biāo)記)、共價(jià)聚合物連接(如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化))以及通過(guò)對(duì)通常不存在于人類(lèi)蛋白質(zhì)中的氨基酸(如鳥(niǎo)氨酸)進(jìn)行化學(xué)合成來(lái)進(jìn)行插入或取代。衍生物保持本公開(kāi)的未衍生化分子的結(jié)合特性。
[0100]“可檢測(cè)部分”或“標(biāo)記”指的是可通過(guò)光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或化學(xué)手段檢測(cè)的組合物。舉例來(lái)說(shuō)，有用的標(biāo)記包括32P、35S、熒光染料、電子致密試劑、酶(例如，如ELISA中所常用)、生物素-抗生物素蛋白鏈菌素、毛地黃毒苷、抗血清或單克隆抗體可獲得的半抗原和蛋白質(zhì)，或序列與靶標(biāo)互補(bǔ)的核酸分子?？蓹z測(cè)部分經(jīng)常產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)，如放射、發(fā)色或熒光信號(hào)，該信號(hào)可以被用于對(duì)樣本中所結(jié)合的可檢測(cè)部分的量進(jìn)行定量。
[0101]術(shù)語(yǔ)“治療有效量”在本文用于指示本公開(kāi)的靶標(biāo)特異性組合物有效改善或減輕與靶標(biāo)蛋白表達(dá)相關(guān)疾病的癥狀或體征的量。
[0102]如本文關(guān)于方法所用的術(shù)語(yǔ)“治療(treat)”、“治療(treating)”以及“治療(treatment)”指的是暫時(shí)或永久地、部分或完全地消除、減少、抑制或改善與TGFP表達(dá)相關(guān)的事件、疾病或病狀的臨床癥狀、表現(xiàn)或進(jìn)展。這種治療無(wú)需是絕對(duì)有用的。
[0103]本公開(kāi)提供了一種可以包含表1中所示出的那些示例性序列的靶標(biāo)特異性抗體、其片段、變體以及衍生物；包括上文所述的靶標(biāo)特異性抗體的藥物制劑；制備所述藥物制劑的方法；以及用所述藥物制劑和化合物治療患者的方法。
[0104]根據(jù)免疫球蛋白重鏈恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以歸屬于不同的類(lèi)別，即IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，所述類(lèi)別可以進(jìn)一步被分成亞類(lèi)或同種型，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl以及IgA2。不同類(lèi)別的免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。不同的同種型具有不同的效應(yīng)功能；例如，IgGl和IgG3同種型具有ADCC活性。本文所公開(kāi)的抗體如果包含恒定域，那么它可以屬于這些亞類(lèi)或同種型中的任一種。
[0105]本公開(kāi)的抗體對(duì)一種或多種TGFβ抗原所展現(xiàn)出的結(jié)合親和力的Kd可以小于或等于約10_5Μ、小于或等于約10_6Μ，或小于或等于約10_7Μ，或小于或等于約10_8Μ，或小于或等于約ΚηΜΟ,Μ'ΙΟΑΜ或10_12Μ或更小。這些親和力可以容易地使用常規(guī)技術(shù)測(cè)定，如通過(guò)平衡透析；通過(guò)使用表面等離子體共振(SPR)技術(shù)(例如BIACore2000儀器，使用由制造商所概述的一般程序)；通過(guò)使用1251標(biāo)記的靶標(biāo)抗原進(jìn)行放射性免疫測(cè)定；或通過(guò)以下實(shí)施例中所闡明或熟練技術(shù)人員所知的另一種方法來(lái)測(cè)定。親和力數(shù)據(jù)可以例如通過(guò)Scatchard 等(Ann N.Y.Acad.Sc1., 51:660, 1949)的方法來(lái)分析。
[0106]KinExA動(dòng)力學(xué)排除測(cè)定法也可用于測(cè)量抗體對(duì)它的抗原的親和力。KinExA技術(shù)測(cè)量了溶液相中的結(jié)合事件，而非溶液相與固相之間的結(jié)合事件。另外，雖然多種用于測(cè)量結(jié)合事件的方法需要至少一種反應(yīng)物經(jīng)由固定化或標(biāo)記加以修飾，但是KinExA法不需要對(duì)所研究的分子進(jìn)行修飾。據(jù)信與當(dāng)前可供使用的其他方法相比，KinExA法允許對(duì)更廣范圍的結(jié)合常數(shù)進(jìn)行測(cè)量。關(guān)于用于抗體表征的KinExA裝置和操作的另外的描述可獲自制造商(Sapidyne Instruments公司，Boise, ID)并且可以見(jiàn)于公布的文獻(xiàn)中，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6, 664, 114 和 Darling 等,“Kinetic Exclusion AssayTechnology: Characterization of Molecular Interactions.^Assay and DrugDevelopment Technologies, 2004, 2:647-657。
[0107]轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β
[0108]TGFβ是一種二硫鍵連接的二聚體，以具有約400個(gè)氨基酸(aa)的前原蛋白形式合成，在分泌之前該前原蛋白經(jīng)過(guò)切割而產(chǎn)生成熟的TGFii。N端切割片段被稱(chēng)為“潛在相關(guān)肽(latency-associated peptide, LAP)”可以與二聚體保持非共價(jià)結(jié)合,從而使TGFβ失活。體內(nèi)分離的TGFP主要以非活性的“潛在”形式，即與LAP締合的形式存在。潛在的TGF β復(fù)合體可以通過(guò)多種方式活化，例如通過(guò)與被稱(chēng)為非陽(yáng)離子依賴(lài)性甘露糖-6-磷酸/胰島素樣生長(zhǎng)因子II受體的細(xì)胞表面受體結(jié)合來(lái)活化。經(jīng)由LAP內(nèi)的糖基化位點(diǎn)上所連接的甘露糖-6-磷酸殘基進(jìn)行結(jié)合。在與受體結(jié)合后，TGFii以它的成熟形式釋放。成熟的活性TGFii然后可以自由地與它的受體結(jié)合并且發(fā)揮它的生物功能。II型TGFii受體中的主要TGFP結(jié)合域已經(jīng)被定位于一個(gè)具有19個(gè)氨基酸的序列(Demetriou等，J.Biol.Chem.，271:12755，1996)。還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利 7，867，496。
[0109]目前，存在五種已知的TGFP亞型(了6叩1至了6叩5亦叩1-3存在于哺乳動(dòng)物中，TGF0 4存在于雞中；而了6?0 5存在于蛙中)，所有這些亞型彼此是同源的(60%-80%同一性)，形成約25kDa的同二聚體，并且對(duì)常見(jiàn)的TGFP受體(TGF0-R1、TGF^-RII,TGFP-RIIB以及TGFP-RIII)起作用。TGFP以及TGFP受體的結(jié)構(gòu)和功能方面是本領(lǐng)域熟知的(參見(jiàn)例如 Cytokine Reference, Oppenheim 等編著，Academic Press, SanDiego, Calif.，2001)。TGFβ在物種間是相當(dāng)保守的。舉例來(lái)說(shuō)，大鼠與人類(lèi)的成熟TGFβ I的氨基酸序列幾乎相同。還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利7，867，496。 [0110]TGF β I在生物組織的傷口愈合過(guò)程中起重要作用(New Engl.J.Med.,第331卷，第1286頁(yè)，1994;以及J.Cell.Biol.，第119卷，第1017頁(yè)，1992)。在受傷組織的部位處，存在如炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生和血管形成，以及細(xì)胞生長(zhǎng)以繼而使組織再生的生物反應(yīng)以修復(fù)受損的組織。還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利7，579，186。
[0111]TGFP 2缺陷型小鼠表現(xiàn)出顯著的發(fā)育缺陷，包括心臟、肺、顱面、四肢、脊椎、眼睛、耳朵以及泌尿生殖器缺陷(Dunker等，Eur J Biol267:6982-8，2001 )。TGFβ 3缺陷型小鼠到出生后第24小時(shí)表現(xiàn)出幾乎100%的致死率。這些小鼠顯示出顯著的上腭缺損和遲緩的肺部發(fā)育(Dunker等(同上))。TGF β 2還已牽涉到青光眼的產(chǎn)生(Luthen-Dr i sco 11, Experimental Eye Res81:1-4, 2005)、與克羅恩氏病相關(guān)的纖維化(Van Assche 等，Inflamm Bowel Dis.10:55-60，2004)、傷口愈合以及糖尿病性腎病(Pohlers 等，Biochim Biophys Actal792:746-56，2009)。
[0112]已觀測(cè)到，許多人類(lèi)腫瘤(deMartin等，EMBOJ., 6:3673(1987) ;Kuppner等，Int.J.Cancer, 42:562(1988))和許多腫瘤細(xì)胞系(Derynck 等，Cancer Res.，47:707(1987)；Roberts等，Br.J.Cancer, 57:594 (1988))產(chǎn)生TGF β，并且表明了那些腫瘤可以逃避正常的免疫監(jiān)視的可能性機(jī)制。
[0113]TGF^亞型在癌癥中的表達(dá)是復(fù)雜的并且可變的，其中TGF0亞型的不同組合在具體癌癥中具有不同的作用。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利7，927，593。舉例來(lái)說(shuō)，TGFβ I和TGFβ 3在卵巢癌以及它的進(jìn)展中所起的作用可能大于TGFii 2 ;而TGFii I和TGFii 2在分級(jí)較高的軟骨肉瘤腫瘤中的表達(dá)高于TGFP 3。在人類(lèi)乳腺癌中，TGFP I和TGFP 3高表達(dá)，其中TGFii 3表達(dá)看似與總體存活率有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和陽(yáng)性TGFii 3表達(dá)的患者具有較差的預(yù)后結(jié)果。然而，在結(jié)腸癌中，TGFii I和TGFii 2的表達(dá)高于TGFii 3，并且所存在的循環(huán)水平大于在無(wú)癌癥個(gè)體中的循環(huán)水平。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，TGFii 2對(duì)于細(xì)胞遷移是重要的。
[0114]TGF^表達(dá)還已牽涉到如腎硬化、肺纖維化以及肝硬化的不同組織的纖維組織形成的發(fā)病；以及如慢性肝炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管再狹窄以及皮膚瘢痕瘤的不同病況的發(fā)病。所涵蓋的包括與疾病或病癥(例如纖維增生性疾病或病癥)或?qū)膊』虿“Y的治療相關(guān)的纖維組織形成在內(nèi)的纖維組織形成包括但不限于肺纖維化、特發(fā)性肺纖維化、細(xì)支氣管周?chē)w維化、間質(zhì)性肺病、慢性阻塞性肺病(C0PD)、小氣管疾病(例如阻塞性細(xì)支氣管炎)、肺氣腫、成人或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性肺損傷(ALI);因感染劑或毒性劑所致的肺纖維化、腎纖維化、由所有病因所致的腎小球腎炎(GN)，例如腎小球膜增生性GN、免疫性GN以及新月體性GN ;腎小球硬化癥、腎小管間質(zhì)損傷、腎間質(zhì)性纖維化、腎纖維化以及腎間質(zhì)性纖維化的所有成因、由藥物暴露(包括對(duì)移植接受者進(jìn)行的環(huán)孢菌素治療，例如環(huán)孢菌素治療)的并發(fā)癥引起的腎纖維化、HIV相關(guān)腎??；移植腎病、糖尿病性腎臟疾病(例如糖尿病性腎病)、腎原性全身性纖維化、糖尿病、特發(fā)性腹膜后纖維化、硬皮病、肝纖維化、與過(guò)度瘢痕形成和進(jìn)行性硬化相關(guān)的肝臟疾病，包括因所有病因所致的肝硬化；膽道系統(tǒng)的病癥、可歸因于感染的肝功能失調(diào)、纖維囊性疾病、心血管疾病,如充血性心力衰竭；擴(kuò)張性心肌病、心肌炎、血管狹窄、心臟纖維化(例如梗塞后心臟纖維化)、后壁心肌梗塞、左心室肥大、靜脈閉塞性疾病、再狹窄(例如血管成形術(shù)后再狹窄)、動(dòng)靜脈移植失敗、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、高血壓性心臟病、心臟肥大、肥厚型心肌病、心力衰竭、主動(dòng)脈疾病、進(jìn)行性全身性硬化；多發(fā)性肌炎、全身性紅斑狼瘡、皮肌炎、筋膜炎、雷諾氏綜合征、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、由任何病因所致的玻璃體視網(wǎng)膜病、與眼部手術(shù)(如對(duì)青光眼的治療)相關(guān)的纖維化、與視網(wǎng)膜功能失調(diào)、視網(wǎng)膜復(fù)置術(shù)、白內(nèi)障摘除術(shù)或任何種類(lèi)的引流程序相關(guān)的纖維化、角膜和結(jié)膜中的瘢痕形成、角膜內(nèi)皮纖維化、與堿燒傷相關(guān)的纖維化、白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體囊纖維化、斜視手術(shù)中圍繞眼外肌的組織中過(guò)度瘢痕形成、前囊下白內(nèi)障和后囊膜渾濁、眼睛前段纖維化疾病、角膜基質(zhì)纖維化(例如與角膜渾濁相關(guān))、小梁網(wǎng)纖維化(例如與青 光眼相關(guān))、眼睛后段纖維化疾病、纖維血管性瘢痕形成(例如眼睛視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜血管結(jié)構(gòu)中)、視網(wǎng)膜纖維化、視網(wǎng)膜前纖維化、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)增生、視網(wǎng)膜下纖維化(例如與年齡相關(guān)性黃斑變性相關(guān))、與視網(wǎng)膜和青光眼手術(shù)后相關(guān)的纖維化、與糖尿病性視網(wǎng)膜病中的組織收縮相關(guān)的牽拉性視網(wǎng)膜脫離、佩羅尼氏病、全身性硬化、脊髓損傷后、骨質(zhì)疏松癥、卡-恩二氏病、克羅恩氏病、瘢痕形成、馬凡氏綜合征、卵巢早衰、阿爾茨海默氏病和帕金森氏病、因手術(shù)切口或機(jī)械性創(chuàng)傷所致的纖維化、與眼部手術(shù)相關(guān)的纖維化；以及由創(chuàng)傷或手術(shù)傷口引起的在傷口愈合期間皮膚中出現(xiàn)的過(guò)度或肥厚性瘢痕或瘢痕瘤形成。
[0115]在肺纖維化和腎硬化中，TGFP的濃度高并且會(huì)導(dǎo)致如纖維化的病態(tài)進(jìn)展(Yamamoto 等，Kidney Int.45:916-27，1994 ；以及 Westergren-Thorsson 等，J.Clin.Invest.92:632-7, 1993)。已經(jīng)假定，在肺纖維化和腎硬化中，持續(xù)性的組織損傷會(huì)持續(xù)地進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)TGF β，抑制對(duì)ECM的TGF β表達(dá)的負(fù)向調(diào)節(jié)信號(hào)，或協(xié)同地引起這兩個(gè)事件。在診斷和治療纖維化疾病中使用TGFii抑制劑來(lái)抑制TGFii的活性和細(xì)胞外基質(zhì)積聚公開(kāi)于W01991/04748、W01993/10808以及W02000/40227中。中和抗TGF3抗體已被用于治療實(shí)驗(yàn)性糖尿病性腎臟疾病(Han和Ziyadeh, Peritoneal dialysisinternational, 19增刊2: S234-237 (1999))。還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利7，527，791，所述美國(guó)專(zhuān)利進(jìn)一步描述了 TGFii抑制劑在不同適應(yīng)癥中的用途，所述美國(guó)專(zhuān)利特此以引用的方式并入。
[0116]示例性眼睛疾病(例如眼部、視力、眼科或眼科學(xué)疾病)、病狀或病癥包括但不限于纖維增生性病癥、眼睛纖維化、眼科纖維組織形成、視網(wǎng)膜功能失調(diào)、與視網(wǎng)膜功能失調(diào)相關(guān)的纖維化、濕性或干性黃斑變性、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、由任何病因所致的玻璃體視網(wǎng)膜病、與眼部手術(shù)(如對(duì)青光眼的治療、視網(wǎng)膜復(fù)置術(shù)、白內(nèi)障摘除術(shù)或任何種類(lèi)的引流程序)相關(guān)的纖維化、角膜和結(jié)膜中的瘢痕形成、角膜內(nèi)皮纖維化、堿燒傷(例如角膜堿燒傷)、白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體囊纖維化、斜視手術(shù)中圍繞眼外肌的組織中過(guò)度瘢痕形成、前囊下白內(nèi)障和后囊膜渾濁、眼睛前段纖維化疾病、角膜基質(zhì)纖維化(例如與角膜渾濁相關(guān))、小梁網(wǎng)纖維化(例如與青光眼相關(guān))、眼睛后段纖維化疾病、纖維血管性瘢痕形成(例如眼睛視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜血管結(jié)構(gòu)中)、視網(wǎng)膜纖維化、視網(wǎng)膜前纖維化、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)增生、視網(wǎng)膜下纖維化(例如與年齡相關(guān)性黃斑變性相關(guān))、與視網(wǎng)膜和青光眼手術(shù)后相關(guān)的纖維化、與糖尿病性視網(wǎng)膜病中的組織收縮相關(guān)的牽拉性視網(wǎng)膜脫離。
[0117]示例性的眼睛纖維增生性疾病、病狀或病癥、眼睛纖維化、眼部纖維化或眼科纖維組織形成包括但不限于增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、由任何病因所致的玻璃體視網(wǎng)膜病、與視網(wǎng)膜功能失調(diào)相關(guān)的纖維化、與濕性或干性黃斑變性相關(guān)的纖維化、與眼部手術(shù)(如對(duì)青光眼的治療、視網(wǎng)膜復(fù)置術(shù)、白內(nèi)障摘除術(shù)或任何種類(lèi)的引流程序)相關(guān)的纖維化、角膜和結(jié)膜中的瘢痕形成、角膜內(nèi)皮纖維化、與堿燒傷相關(guān)的纖維化、白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體囊纖維化、斜視手術(shù)中圍繞眼外肌的組織中過(guò)度瘢痕形成、前囊下白內(nèi)障和后囊膜渾濁、眼睛前段纖維化疾病、角膜基質(zhì)纖維化(例如與角膜渾濁相關(guān))、小梁網(wǎng)纖維化(例如與青光眼相關(guān))、眼睛后段纖維化疾病、纖維血管性瘢痕形成(例如眼睛視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜血管結(jié)構(gòu)中)、視網(wǎng)膜纖維化、視網(wǎng)膜前纖維化、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)增生、視網(wǎng)膜下纖維化(例如與年齡相關(guān)性黃斑變性相關(guān))、與視網(wǎng)膜和青光眼手術(shù)后相關(guān)的纖維化、與糖尿病性視網(wǎng)膜病中的組織收縮相關(guān)的牽拉性視網(wǎng)膜脫離。
[0118]在不同的實(shí)施方案中，眼睛纖維增生性疾病、病狀或病癥是從由以下各項(xiàng)組成的群組中選出:增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、與眼部手術(shù)相關(guān)的纖維化、白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體纖維化、角膜基質(zhì)纖維化以及堿燒傷。[0119]抗體多肽
[0120]本公開(kāi)涵蓋了編碼靶標(biāo)特異性抗體的氨基酸分子。在示例性實(shí)施方案中，本公開(kāi)的靶標(biāo)特異性抗體可以包含人類(lèi)κ輕鏈或人類(lèi)λ輕鏈或由其衍生的氨基酸序列，或者人類(lèi)重鏈或由其衍生的序列，或者在一起呈單鏈、二聚、四聚或其他形式的重鏈和輕鏈。在一些實(shí)施方案中，靶標(biāo)特異性免疫球蛋白的重鏈和輕鏈?zhǔn)遣煌陌被岱肿?。在其他?shí)施方案中，同一個(gè)氨基酸分子含有靶標(biāo)特異性抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。
[0121]在一些實(shí)施方案中，人類(lèi)抗靶標(biāo)抗體的氨基酸序列包含表1或SEQ ID Ν0:4、8以及12中所示出的抗體XPA.42.068,XPA.42.089以及XPA.42.681的成熟(即缺少信號(hào)序列)輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)CDR或其變體，包括CDR移植抗體、經(jīng)過(guò)修飾的抗體、人源化抗體、嵌合抗體或人類(lèi)工程化抗體或本文所述的任何其他變體在內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，VL包含從上述抗體中的任一種的輕鏈的CDRl的起點(diǎn)到CDR3的終點(diǎn)的氨基酸序列。
[0122]在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)特異性抗體包含各自獨(dú)立地從具有如下的輕鏈可變區(qū)的抗體的 CDR1、CDR2 以及 CDR3 區(qū)中選出的輕鏈 CDR1、CDR2 或 CDR3 (LCDR1、LCDR2、LCDR3)，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID Ν0:4、8以及12中所示出的VL區(qū)的氨基酸序列、編碼SEQ IDΝ0:4、8以及12中所示出的VH區(qū)的核酸，或由SEQ ID NO:3、7以及11中所示出的編碼VL區(qū)的核酸分子編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)Chothia編號(hào)，輕鏈CDRl是從大致殘基24至34，⑶R2是從大致殘基50至56，并且⑶R3從大致殘基89延伸至97。在一個(gè)替代性實(shí)施方案中，預(yù)期根據(jù)ImMunoGenTics (MGT)編號(hào)，重鏈CDR位于大致殘基27至38處(CDR1);大致殘基56至65處(CDR2);以及大致殘基105至116(生殖系)或殘基105至117處(CDR3)。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期在長(zhǎng)度與本文所公開(kāi)的那些抗體輕鏈大致相似的抗體輕鏈的輕鏈可變域中，輕鏈CDR位于大致殘基26-31 (LI),49-51 (L2)以及88-97 (L3)處。靶標(biāo)特異性抗體的多肽可以包含如下抗體的⑶R1XDR2以及⑶R3區(qū)，所述抗體包含從由XPA.42.068、XPA.42.089以及XPA.42.681組成的群組中選出的VL區(qū)的氨基酸序列。
[0123]在一些實(shí)施方案中，人類(lèi)靶標(biāo)特異性抗體包含表1或SEQ ID N0:2、6以及10中所示出的抗體XPA.42.068,XPA.42.089以及XPA.42.681的成熟(即缺少信號(hào)序列)重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)⑶R或其變體。在一些實(shí)施方案中，VH包含從上述抗體的重鏈中的任一者的CDRl的起點(diǎn)到CDR3的終點(diǎn)的氨基酸序列。
[0124]在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)特異性抗體包含各自獨(dú)立地從具有如下重鏈可變區(qū)的抗體的 CDR1、CDR2 以及 CDR3 區(qū)中選出的重鏈 CDR1、CDR2 或 CDR3 (HCDR1、HCDR2、HCDR3)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:2、6以及10中所示出的VH區(qū)的氨基酸序列、編碼SEQ IDNO: 2、6以及10中所示出的VH區(qū)的核酸，或由SEQ ID NO: 1、5以及9中所示出的編碼VH區(qū)的核酸分子編碼。進(jìn)一步預(yù)期靶標(biāo)特異性抗體包含各自獨(dú)立地從具有如下重鏈可變區(qū)的抗體的⑶R1、⑶R2以及⑶R3區(qū)中選出的重鏈⑶R1、⑶R2或⑶R3，所述重鏈可變區(qū)包含SEQID N0:2、6以及10中所示出的VH區(qū)的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)Chothia編號(hào)，重鏈⑶R位于以下位置ADRl是從大致殘基26至35，⑶R2是從大致殘基50至58并且⑶R3從大致殘基95延伸至102 (或95至111或95至118)。在一個(gè)替代性實(shí)施方案中，預(yù)期根據(jù)ImMunoGenTics (IMGT)編號(hào)，重鏈CDR位于以下位置:CDR1，大致殘基27至38(⑶Rl);大致殘基56至65 (⑶R2);以及⑶R3，大致殘基105至116 (生殖系)或殘基105至117⑶R3)。在一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期在長(zhǎng)度與本文所公開(kāi)的那些抗體重鏈大致相似的抗體重鏈的重鏈可變域中，重鏈CDR位于大致殘基26-33 (HO,50-58 (H2)以及97-111 (H3)處。靶標(biāo)特異性抗體的多肽可以包含如下抗體的⑶R1XDR2以及⑶R3區(qū)，所述抗體包含從由XPA.42.068、XPA.42.089以及XPA.42.681組成的群組中選出的VH區(qū)的氨基酸序列。
[0125]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含任選地如表1中所示進(jìn)行配對(duì)的如上文所公開(kāi)的成熟輕鏈可變區(qū)和如上文所公開(kāi)的成熟重鏈可變區(qū)。
[0126]在示例性實(shí)施方案中，本公開(kāi)涵蓋:
[0127]如下的單克隆抗體，所述單克隆抗體保留分別具有以下序列中的任一個(gè)的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3中的任何一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè):SEQ IDN0:13、19&&25;SEQ ID NO: 14、20 以及26 ;SEQ ID NO: 15、21 以及27 ;以及SEQ ID NO: 16、22以及28;SEQ ID NO: 17,23以及29;以及SEQ ID NO: 18、24以及30，在這一個(gè)或多個(gè)CDR中的任一個(gè)中任選地包括一處或兩處突變(例如保守性或非保守性取代)，并且任選地如表I中所示進(jìn)行配對(duì)；
[0128]如下的單克隆抗體，所述單克隆抗體保留分別具有以下序列中的任一個(gè)的所有HCDR1、HCDR2、HCDR3，或重鏈可變區(qū):SEQ ID NO: 13、19 以及 25 ；SEQ ID NO: 14,20 以及 26 ；以及SEQ ID NO: 15,21以及27，在這一個(gè)或多個(gè)⑶R中的任一個(gè)中任選地包括一處或兩處突變，所述單克隆抗體 任選地進(jìn)一步包含任何適合的重鏈恒定區(qū)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2或IgE,其人類(lèi)序列，或其雜交體；
[0129]如下的單克隆抗體，所述單克隆抗體保留分別具有以下序列中的任一個(gè)的所有LCDRl、LCDR2、LCDR3，或輕鏈可變區(qū):SEQ ID NO: 16,22 以及 28 ；SEQ ID NO: 17,23 以及 29 ；以及SEQ ID NO: 18,24以及30，在這一個(gè)或多個(gè)⑶R中的任一個(gè)中任選地包括一處或兩處突變，所述單克隆抗體任選地進(jìn)一步包含任何適合的輕鏈恒定區(qū)，例如κ或λ輕鏈恒定區(qū)，其人類(lèi)序列，或其雜交體。
[0130]在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含如表1中所示進(jìn)行配對(duì)的所有三個(gè)輕鏈⑶R、所有三個(gè)重鏈⑶R，或輕鏈和重鏈的所有六個(gè)⑶R。在一些示例性實(shí)施方案中，來(lái)自一種抗體的兩個(gè)輕鏈CDR可以與來(lái)自不同抗體的第三個(gè)輕鏈CDR組合?；蛘?，來(lái)自一種抗體的LCDRl可以與來(lái)自不同抗體的IXDR2和來(lái)自又另一種抗體的IXDR3組合，特別是在這些⑶R具有高度同源性的情況下。類(lèi)似地，來(lái)自一種抗體的兩個(gè)重鏈⑶R可以與來(lái)自不同抗體的第三個(gè)重鏈⑶R組合；或來(lái)自一種抗體的HCDRl可以與來(lái)自不同抗體的HCDR2和來(lái)自又另一種抗體的HCDR3組合，特別是在這些⑶R具有高度同源性的情況下。
[0131]在一些實(shí)施方案中，提供了一種抗體，所述抗體包含如下的多肽，所述多肽具有與SEQ ID Ν0:2、6以及10中所示出的重鏈可變區(qū)具有至少約65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的同一性的氨基酸序列；和/或與SEQ ID Ν0:4、8以及12中所示出的輕鏈可變區(qū)具有至少約 65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的同一性的氨基酸序列，所述抗體進(jìn)一步包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、IXDR1、IXDR2或IXDR3中的至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或全部。在一些實(shí)施方案中，與所述輕鏈可變區(qū)具有同一性百分比的氨基酸序列可以包含所述輕鏈CDR中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)。在其他實(shí)施方案中，與所述重鏈可變區(qū)具有同一性百分比的氨基酸序列可以包含所述重鏈⑶R中的 一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)。
[0132]在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種抗體，所述抗體包含如下的多肽，所述多肽具有與表1中的抗體序列的重鏈可變區(qū)中的所有三個(gè)HCDR具有至少約65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的同一性的氨基酸序列，所述CDR示出于SEQ ID Ν0:13、19以及25 ;SEQ ID N0:14、20以及26 ;以及 SEQ ID NO: 15,21 以及 27 中。
[0133]在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，提供了一種抗體，所述抗體包含如下的多肽，所述多肽具有與表1中的抗體序列的輕鏈可變區(qū)中的所有三個(gè)IXDR具有至少約65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的同一性的氨基酸序列，所述CDR示出于SEQ ID NO: 16,22以及28 ;SEQ ID NO: 17,23以及29 ;以及SEQ ID NO: 18,24以及30中。
[0134]在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種抗體，所述抗體包含如下的多肽，所述多肽具有與表1中的抗體序列的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的所有六個(gè)CDR具有至少約65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的同一性的氨基酸序列，所述CDR示出于SEQ ID NO: 13、19以及25 ;SEQ IDN0:14、20 以及 26 ;以及 SEQ ID NO: 15、21、27 ;SEQ ID NO: 16、22 以及 28 ;SEQ ID NO: 17,23以及29 ;以及SEQ ID NO: 18,24以及30中。
[0135]預(yù)期本公開(kāi)的抗體在抗體的CDR區(qū)中可能具有一處或兩處或更多處氨基酸取代，例如非保守性或保守性取代。
[0136]在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，框架的殘基發(fā)生改變。可能發(fā)生改變的重鏈框架區(qū)位于被命名為H-FR1、H-FR2、H-FR3以及H-FR4的圍繞重鏈CDR殘基的區(qū)域內(nèi)，并且可能發(fā)生改變的輕鏈框架區(qū)的殘基位于被命名為L(zhǎng)-FRl、L-FR2、L-FR3以及L-FR4的圍繞輕鏈CDR殘基的區(qū)域內(nèi)。框架區(qū)內(nèi)的氨基酸可以例如被人類(lèi)框架或人類(lèi)共有框架中所鑒定的任何適合氨
基酸置換。
[0137]在示例性實(shí)施方案中，本文所述的抗TGFP抗體特異性結(jié)合TGFP的從由TGF3 1、TGF β 2以及TGF β 3組成的群組中選出的至少一種亞型。在其他實(shí)施方案中，抗TGF β抗體特異性結(jié)合:(a) TGF β 1、TGF β 2以及TGF β 3(“泛反應(yīng)性抗體”或“泛結(jié)合抗體”)；(b) TGF β I和TGF β 2 ； (c) TGF β I和TGF β 3 ;以及(d) TGF β 2和TGF β 3。在示例性實(shí)施方案中，本文所述的抗TGFβ抗體以10-6Μ、10-7Μ、101、101、10-、、KT11M或KT12M或更小的親和力結(jié)合TGFii的至少一種亞型(越低意味著結(jié)合親和力越高)，或任選地結(jié)合兩種TGFii亞型或所有TGFP 1、TGFP 2或TGFβ 3，對(duì)所述亞型中的一種或多種具有10-6Μ、10-7Μ、10-8Μ、10-9Μ、ΙΟ,Μ'ΙΟ—ηΜ或10_12Μ或更小的親和力。在其他實(shí)施方案中，本文所述的抗體與TGFii I和TGFii 2結(jié)合的親和力是與TGFii 3結(jié)合的親和力的至少2至50倍、10至100倍、2倍、5倍、10倍、25倍、50倍或100倍，或比與TGFP 3結(jié)合的親和力高20%至50%、50%至100%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (例如優(yōu)先與 TGF β I 和 TGF β 2 結(jié)合)。或者，本文所述的抗體與TGFii亞型TGFii 1、TGFii 2以及TGFβ 3中的每一種結(jié)合的親和力是彼此的3倍、5倍或10倍以內(nèi)。
[0138]在一些實(shí)施方案中，抗體中和TGF3 I和TGFii 2的效力是中和TGF β 3的效力的至少2至50倍、10至100倍、2倍、5倍、10倍、25倍、50倍或100倍，或比中和TGFP 3的效力大 20% 至 50%、50% 至 100%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。
[0139]XPA.42.089的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別示出于SEQ ID Ν0:6和8中。XPA.42.068的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別示出于SEQ ID NO: 2和4中，并且XPA.42.681的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別示出于SEQ ID NO: 10和12中。
[0140]抗體核酸
`[0141]本公開(kāi)還涵蓋了編碼靶標(biāo)特異性抗體的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，不同的核酸分子編碼靶標(biāo)特異性抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。在其他實(shí)施方案中，同一個(gè)核酸分子編碼靶標(biāo)特異性抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸編碼本公開(kāi)的靶標(biāo)特異性抗體以及由本文所述的核酸編碼的任何多肽。
[0142]在一個(gè)方面，本公開(kāi)的核酸分子包含編碼SEQ ID Ν0:4、8以及12中所示出的抗體XPA.42.068,XPA.42.089以及XPA.42.681的VL氨基酸序列或其部分的核苷酸序列。在一個(gè)相關(guān)方面，VL氨基酸序列是共有序列。在一些實(shí)施方案中，所述核酸編碼所述抗體的輕鏈⑶R的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述部分是包含⑶Rl-⑶R3的連續(xù)部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述部分包含輕鏈⑶R1XDR2或⑶R3區(qū)中的至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)，任選地具有不同的人類(lèi)或人類(lèi)共有框架，并且在總共3個(gè)CDR中任選地具有I處或最多2處或最多3處突變。
[0143]在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供了抗原結(jié)合化合物，所述抗原結(jié)合化合物包括功能片段，具有SEQ ID ΝΟ:2、6和10以及4、8和12中的任一個(gè)中所示出的可變區(qū)氨基酸序列。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，上述抗原結(jié)合化合物是從由以下各項(xiàng)組成的群組中選出:包含本公開(kāi)的一個(gè)或多個(gè)CDR序列并且展現(xiàn)出所需生物活性的完全組裝的四聚抗體、單克隆抗體、人源化抗體；人類(lèi)抗體；嵌合抗體；多特異性抗體、抗體片段、Fab、F(ab’ )2 ；Fv ；scFv或單鏈抗體片段；雙鏈抗體；三鏈抗體、四鏈抗體、微型抗體、線性抗體；螯合重組抗體、三體或雙體、胞內(nèi)抗體、納米抗體、小模塊免疫藥物(SMIP )、結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白、駱駝源化抗體、含VHH抗體，或這些抗體中的任一種的變體或衍生物，或兩種或更多種抗體的混合物。如通過(guò)表面等離子體共振所測(cè)量，本公開(kāi)的抗原結(jié)合化合物優(yōu)選地對(duì)TGFii 1、TGF^ 2以及TGF β 3中的一種或多種保持10-6Μ、10-7Μ、10-8Μ、10-9Μ、ΙΟ,Μ、10-ηΜ或更小的結(jié)合親和力。
[0144]在一個(gè)方面，本公開(kāi)的抗體包含如表1中所配對(duì)的分別如氨基酸序列SEQ IDΝ0:2、6和10以及SEQ ID Ν0:4、8和12中所示出的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)。進(jìn)一步預(yù)期所述抗體可以包含上述氨基酸序列中所示出的抗體的全部或一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含如表1中所配對(duì)的SEQ ID Ν0:2、6以及10的重鏈的⑶R1XDR2或⑶R3中的至少一個(gè)，或SEQ ID Ν0:4、8以及12的輕鏈的⑶R1、⑶R2或⑶R3中的至少一個(gè)。
[0145]在一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈包含被鑒定為重鏈CDR3序列的氨基酸序列。這種“重鏈CDR3序列” (HCDR3)包括被鑒定為表1和SEQ ID NO: 15,21以及27中所示出的重鏈CDR3序列的氨基酸序列?；蛘撸琀CDR3序列包含與表1中所鑒定的任何HCDR3氨基酸序列相比含有一處或多處氨基酸變化(例如取代、插入或缺失)的氨基酸序列。優(yōu)選的取代包括被表1中另一個(gè)HCDR3內(nèi)相應(yīng)位置上的氨基酸取代?；蛘?，HCDR3序列可以包含本文所述的HCDR3的共有氨基酸序列。
[0146]包含上述HCDR3序列的重鏈可以進(jìn)一步包含“重鏈⑶Rl序列”(HCDR1 )，所述重鏈⑶Rl序列包括以下各項(xiàng)中的任一個(gè):被鑒定為SEQ ID Ν0:13、19和25以及表1中的HCDRl的氨基酸序列；與SEQ ID NO: 13、19和25以及表1中所鑒定的任何HCDRl相比含有一處或多處氨基酸變化的氨基酸序列，所述氨基酸變化優(yōu)選地是被表1中另一個(gè)HCDRl內(nèi)相應(yīng)位置上的氨基酸取代；或本文所述的HCDRl的共有序列。
[0147]或者，包含上述HCDR3序列的重鏈可以進(jìn)一步包含“重鏈⑶R2序列”(HCDR2)，所述重鏈⑶R2序列包括以下各項(xiàng)中的任一個(gè):被鑒定為SEQ ID NO: 14,20和26以及表1中的HCDR2的氨基酸序列；與SEQ ID NO: 14,20和26以及表1中所鑒定的任何HCDR2相比含有一處或多處氨基酸變化的氨基酸序列，所述氨基酸變化優(yōu)選地是被表1中另一個(gè)HCDR2內(nèi)相應(yīng)位置上的氨基酸取代；或本文所述的HCDR2的共有序列。
[0148]包含上述重鏈⑶R3序列的重鏈還可以包含(a)上述重鏈⑶Rl序列和(b)上述本發(fā)明重鏈⑶R2序列。
[0149]本公開(kāi)的一個(gè)方面提供了一種結(jié)合靶標(biāo)抗原的抗體，所述抗體包含含有下文所述的重鏈⑶R序列中的任何一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)的重鏈。
[0150]上述重鏈⑶R序列中的任一個(gè)還可以包括被添加至⑶R的任一端上的氨基酸。本發(fā)明抗體和抗原結(jié)合化合物的變體和衍生物的制備(包括親和力成熟或含有氨基酸類(lèi)似物的變體或衍生物的 制備)進(jìn)一步詳細(xì)地描述于本文中。示例性變體包括含有氨基酸序列內(nèi)相應(yīng)氨基酸的保守性或非保守性取代或者氨基酸被不同人類(lèi)抗體序列的相應(yīng)氨基酸置換的那些變體。
[0151 ] 包含上述重鏈中的任一個(gè)的抗體可以進(jìn)一步包含輕鏈，優(yōu)選地是結(jié)合靶標(biāo)抗原的輕鏈，并且最優(yōu)選地是包含下文所述的輕鏈CDR序列的輕鏈。[0152]本公開(kāi)的另一個(gè)方面提供了一種結(jié)合靶標(biāo)抗原的抗體，所述抗體包含含有下文所述的輕鏈CDR序列中的任何一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)的輕鏈。
[0153]優(yōu)選地，輕鏈包含被鑒定為輕鏈⑶R3序列的氨基酸序列。這種“輕鏈⑶R3序列”(IXDR3)包括被鑒定為表1中以及SEQ ID NO: 18、24和30內(nèi)的輕鏈⑶R3序列的氨基酸序列。或者，輕鏈CDR3序列包含與表1中所鑒定的任何輕鏈CDR3氨基酸序列相比含有一處或多處氨基酸變化(例如取代、插入或缺失)的氨基酸序列。優(yōu)選的取代包括被表1中另一個(gè)輕鏈CDR3內(nèi)相應(yīng)位置上的氨基酸取代。
[0154]包含上述輕鏈⑶R3序列的輕鏈可以進(jìn)一步包含“輕鏈⑶Rl序列”，所述輕鏈⑶Rl序列包括以下各項(xiàng)中的任一個(gè):被鑒定為SEQ ID NO: 16,22和28或表1中的輕鏈⑶Rl的氨基酸序列?’與SEQ ID NO: 16,22和28或表1中所鑒定的任何輕鏈⑶Rl相比含有一處或多處氨基酸變化的氨基酸序列，所述氨基酸變化優(yōu)選地是被表1中另一個(gè)輕鏈CDRl內(nèi)相應(yīng)位置上的氨基酸取代。 [0155]或者，包含上述輕鏈⑶R3序列的輕鏈可以進(jìn)一步包含“輕鏈⑶R2序列”，所述輕鏈⑶R2序列包括以下各項(xiàng)中的任一個(gè):被鑒定為SEQ ID NO: 17,23和29或表1中的輕鏈CDR2的氨基酸序列；與表1中所鑒定的任何輕鏈CDR2相比含有一處或多處氨基酸變化的氨基酸序列，所述氨基酸變化優(yōu)選地是被SEQ ID NO: 17、23和29或表1中另一個(gè)輕鏈⑶R2內(nèi)相應(yīng)位置上的氨基酸取代。
[0156]在一個(gè)相關(guān)方面，本公開(kāi)涵蓋了一種純化的多肽，所述多肽包含SEQ IDNO: 13-15、19-21 以及 25-27 中的至少一個(gè) HCDR 或 SEQ ID NO: 16-18,22-24 以及 28-30 中的至少一個(gè)LCDR，其中重鏈可變區(qū)的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)包含來(lái)自人類(lèi)抗體的框架區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)氨基酸取代使重鏈可變區(qū)的框架區(qū)和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)發(fā)生化學(xué)改變而與不同的人類(lèi)抗體序列具有更大的同源性。舉例來(lái)說(shuō)，在每個(gè)重鏈框架區(qū)(H-FR1-4)內(nèi)，預(yù)期重鏈可變區(qū)的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)或至少六個(gè)天然框架區(qū)殘基已通過(guò)氨基酸取代而發(fā)生改變，并且其中在每個(gè)輕鏈框架區(qū)(L-FR1-4)內(nèi)，輕鏈可變區(qū)的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)或至少六個(gè)天然框架殘基已通過(guò)氨基酸取代而發(fā)生改變。
[0157]包含上述輕鏈⑶R3序列的輕鏈還可以包含(a)上述輕鏈⑶Rl序列和(b)上述輕鏈⑶R2序列。
[0158]包含上述輕鏈可變區(qū)中的任一個(gè)的抗體可以進(jìn)一步包含任選地如表1中所述進(jìn)行配對(duì)的重鏈可變區(qū)，優(yōu)選地是結(jié)合靶標(biāo)抗原的重鏈可變區(qū)，并且最優(yōu)選地是包含上述重鏈⑶R序列的重鏈可變區(qū)。
[0159]在又另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含從由SEQ ID NO: 2、6以及10組成的群組中選出的重鏈可變區(qū)和從由SEQ ID N0:4、8以及12組成的群組中選出的輕鏈可變區(qū)。
[0160]在一個(gè)相關(guān)方面，核酸分子包含編碼輕鏈氨基酸序列SEQ ID N0:4、8以及12中的一個(gè)或其部分的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子包含輕鏈核苷酸序列SEQ IDN0:3、7以及11中的任一個(gè)或其部分。本公開(kāi)的核酸分子進(jìn)一步包括所有的核酸序列，包括SEQ ID NO: 1、3、5、7、9以及11中的序列；以及核酸序列基于遺傳密碼的多樣性包含簡(jiǎn)并密碼子并且編碼如下氨基酸序列，所述氨基酸序列是本文所述抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)或本文所述的任何HCDR或IXDR的氨基酸序列并且如SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12以及13-30中所示出；以及在高嚴(yán)格性條件(如本文所述的那些條件)下與編碼如下氨基酸序列的核酸序列雜交的核酸，所述氨基酸序列是本文所述抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)或本文所述的任何HCDR或LCDR的氨基酸序列并且如SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12以及13-30中所示出。
[0161]在一些實(shí)施方案中，核酸分子編碼與SEQ ID N0:4、8以及12中所示出的VL氨基酸序列具有至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%同一性的VL氨基酸序列。本公開(kāi)的核酸分子包括在高嚴(yán)格性條件(如本文所述的那些條件)下與編碼SEQ ID N0:4、8以及12的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列或者具有SEQ ID N0:3、7以及11的輕鏈可變區(qū)核酸序列的核酸序列雜交的核酸。
[0162]進(jìn)一步預(yù)期，本公開(kāi)的核酸分子包含編碼抗體XPA.42.068、XPA.42.089以及XPA.42.681中的任一種的VH氨基酸序列或其部分的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述核酸編碼所述抗體的重鏈CDR的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述部分是包含重鏈⑶Rl-⑶R3的連續(xù)部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述部分包含重鏈⑶R1XDR2或⑶R3區(qū)中的至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)，任選地具有不同的人類(lèi)或人類(lèi)共有框架，并且在總共3個(gè)CDR中任選地具有I處或最多2處或最多3處突變。
[0163]在一個(gè)相關(guān)方面，核酸分子包含編碼SEQ ID N0:2、6以及10的重鏈中的一者的重鏈氨基酸序列或其部分的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO: 1>5以及9的重鏈核苷酸序列或其部分。
[0164]在一些實(shí)施方案中，核酸分子編碼與SEQ ID NO: 2、6以及10中所示出的VH氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH氨基酸序列。在一個(gè)相關(guān)方面，VH氨基酸序列是共有序列。本公開(kāi)的核酸分子進(jìn)一步包括在高嚴(yán)格性條件(如本文所述的那些條件)下與編碼SEQ ID N0:2、6以及10的重鏈可變區(qū)氨基酸序列或者具有SEQ ID NO: 1、5以及9的重鏈可變區(qū)核酸序列中的任一個(gè)的核酸序列雜交的核酸。
[0165]進(jìn)一步預(yù)期，本公開(kāi)的核酸可以編碼從XPA.42.068,XPA.42.089以及XPA.42.681中選出的抗體的全長(zhǎng)輕鏈或重鏈`，其中全長(zhǎng)輕鏈或全長(zhǎng)重鏈分別包含輕鏈恒定區(qū)或重鏈恒定區(qū)，輕鏈恒定區(qū)任選地包括未經(jīng)過(guò)修飾的或經(jīng)過(guò)修飾的κ或λ區(qū)，并且重鏈恒定區(qū)包括任何類(lèi)別的未經(jīng)過(guò)修飾的或經(jīng)過(guò)修飾的恒定區(qū)，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD或IgE。
[0166]在一個(gè)方面，全長(zhǎng)輕鏈抗體包含SEQ ID N0:4、8以及12中所示出的序列。進(jìn)一步預(yù)期編碼全長(zhǎng)輕鏈的核苷酸編碼序列SEQ ID N0:4、8以及12，并且包含SEQ ID N0:3、7以及11中所示出的核苷酸序列。
[0167]在一個(gè)方面，全長(zhǎng)重鏈抗體包含SEQ ID N0:2、6以及10中的任一個(gè)中的序列。進(jìn)一步預(yù)期編碼全長(zhǎng)重鏈的核苷酸編碼重鏈序列SEQ ID NO: 2、6以及10，并且包含SEQ IDN0:l、5以及9中的任一個(gè)中所示出的核苷酸序列。
[0168]在另外的實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供了一種結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGFP )1、TGF3 2以及TGF β 3的抗體，所述抗體包含輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，其中(a)所述輕鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID NO: 16、22以及28或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO: 17,23以及29或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R2，和/或從SEQ ID NO: 18,24以及30或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R3 ;和/或其中(b)所述重鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID NO: 13、19以及25或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO: 14、20以及26或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R2，和/或從SEQ ID NO: 15,21以及27或與其具有至少80%同一性的序列中選出的CDR3。
[0169]在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所述輕鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID NO: 16或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO: 17或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQ ID NO: 18或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3 ;和/或所述重鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID NO: 13或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO: 14或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQ IDNO: 15或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3。
[0170]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述輕鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID NO:22或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO:23或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQ ID NO:24或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3 ;和/或所述重鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID NO: 19或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO:20或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQ IDNO:21或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3。
[0171]在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述輕鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID N0:28或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO:29或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQ ID NO: 30或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3 ;和/或所述重鏈可變區(qū)至少包含從S EQ ID N0:25或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO: 26或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQ IDNO:27或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3。
[0172]在示例性實(shí)施方案中，本公開(kāi)的抗體包含人類(lèi)K輕鏈或人類(lèi)λ輕鏈或由其衍生的氨基酸序列，或者人類(lèi)重鏈或由其衍生的序列，或者在一起呈單鏈、二聚、四聚或其他形式的重鏈和輕鏈。
[0173]單克隆抗體
[0174]單克隆抗體指的是從一群大致上均質(zhì)的抗體中獲得的抗體。單克隆抗體一般具有高度特異性，并且可能針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)，相對(duì)而言，常規(guī)(多克隆)抗體制備物典型地包括針對(duì)相同或不同決定簇(表位)的不同抗體。單克隆抗體除了它們的特異性之外也是有利的，因?yàn)樗鼈兛梢酝ㄟ^(guò)均質(zhì)培養(yǎng)物合成，不會(huì)被具有不同特異性和特征的其他免疫球蛋白污染。
[0175]單克隆抗體可以通過(guò)最初由Kohler等(Nature, 256:495-7，1975)描述的雜交瘤方法制備(Harlow 和 Lane;Antibodies:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1988) ；Goding, MonoclonalAntibodies !Principles and Practice,第 59-103 頁(yè)(Academic Press, 1986)),或可以通過(guò)重組DNA方法制備(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，567)。還可以使用例如以下文獻(xiàn)中所述的技術(shù)從卩遼菌體抗體文庫(kù)中分離單克隆抗體:Clackson等(Nature352:624-628，1991)以及Marks等(J.Mol.Biol.222:581-597, 1991)。用于產(chǎn)生單克隆抗體的另外的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。[0176]適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)常規(guī)的免疫球蛋白純化程序?qū)慰寺】贵w(如通過(guò)上述方法產(chǎn)生的那些單克隆抗體)從培養(yǎng)基、腹水或血清中分離，所述常規(guī)免疫球蛋白純化程序例如像蛋白質(zhì)A-瓊脂糖凝膠、疏水性相互作用色譜法(HIC)、離子交換色譜法、羥磷灰石色譜法、凝膠電泳、透析和/或親和色譜法。
[0177]進(jìn)一步預(yù)期，本公開(kāi)的抗體可以本領(lǐng)域熟知并且在本文所述的抗體的較小抗原結(jié)合片段的形式使用。
[0178]抗體片段
[0179]抗體片段包含完整全長(zhǎng)抗體的一部分，優(yōu)選地包含完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)2以及Fv片段；雙鏈抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv);多特異性抗體片段，如雙特異性、三特異性等抗體(例如雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體)；微型抗體；螯合重組抗體；三體或雙體；胞內(nèi)抗體；納米抗體；小模塊免疫藥物(SMIP)、結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白；駱駝源化抗體；含VHH抗體；以及由抗體片段形成的其他多肽。參見(jiàn)例如 Holliger 和 Hudson (Nat.Biotech.23:1126-36 (2005))。
[0180]用木瓜蛋白酶對(duì)抗體進(jìn)行消化會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，所述抗原結(jié)合片段被稱(chēng)作“Fab”片段，是由VL、VH、CL以及CH結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段，各自具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)；以及剩余的“Fe”片段，其名稱(chēng)反映了它能夠容易地發(fā)生結(jié)晶。用胃蛋白酶進(jìn)行處理會(huì)產(chǎn)生F(ab’)2片段，所述F(ab’)2片段是包含由鉸鏈區(qū)中的二硫橋鍵連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段，具有包含抗體VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)“單鏈Fv”或“scFv” 抗體片段，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單條多肽鏈中。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步在VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域之間包含使得Fv能夠形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生單鏈抗體(scFv)的多肽接頭，其中VL區(qū)與VH區(qū)配對(duì)以經(jīng)由使得它們能夠成為單條蛋白質(zhì)鏈的合成接頭形成單價(jià)分子(Bird 等,Science242:423-426，1988 ；以及 Huston 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:5879-5883，1988)。關(guān)于 scFv 的綜述，參見(jiàn) Pluckthun, The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 編著,Springer-Verlag, NewYork,第269-315頁(yè)(1994)。Fd片段由VH結(jié)構(gòu)域和CHl結(jié)構(gòu)域組成。
[0181]另外的抗體片段包括由VH結(jié)構(gòu)域組成的結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)片段(Ward等，Nature341:544-546，1989 )。雙鏈抗體是二價(jià)抗體，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域表達(dá)于單條多肽鏈上，但是使用過(guò)短而不允許同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)行配對(duì)的接頭，從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)例如EP404, 097 ；W093/11161 ；Holliger 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448，1993 ；以及 Poljak等，Structure〗: 1121-1123，1994)。雙鏈抗體可以具有雙特異性或單特異性。
[0182]缺少輕鏈的功能性重鏈抗體天然地存在于鉸口 S(Greenberg等，Nature374:168-73， 1995)、地經(jīng) S(wobbegong shark) (Nuttall 等，MolImmunol.38:313-26，2001)以及胳馬它科(Camelidae)動(dòng)物(Hamers-Casterman等，Nature363:446-8, 1993 ；Nguyen 等，J.Mol.Biol.275:413，1998)(如駱駝、單峰駱駝、羊駝以及美洲駝)中?？乖Y(jié)合位點(diǎn)在這些動(dòng)物中被縮減至單個(gè)結(jié)構(gòu)域，即VHH結(jié)構(gòu)域。這些抗體僅使用重鏈可變區(qū)形成抗原結(jié)合區(qū)，即這些功能性抗體是僅具有結(jié)構(gòu)H2L2的重鏈的同二聚體(被稱(chēng)為“重鏈抗體”或“HCAb”)。據(jù)報(bào)道，駱駝科動(dòng)物VHH與含有鉸鏈、CH2以及CH3結(jié)構(gòu)域而缺少CHl結(jié)構(gòu)域的IgG2和IgG3恒定區(qū)重組(Hamers-Casterman等(同上))。舉例來(lái)說(shuō)，美洲駝IgGl是一種常規(guī)的(H2L2)抗體同種型，其中VH與含有鉸鏈、CH1、CH2以及CH3結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)重組，而美洲駝IgG2和IgG3是缺少CHl結(jié)構(gòu)域并且不含輕鏈的僅具有重鏈的同種型。已發(fā)現(xiàn)駱駝科動(dòng)物的VHH結(jié)構(gòu)域以高親和力結(jié)合抗原(Desmyter 等，J.Biol.Chem.276:26285-90, 2001)并且在溶液中具有高穩(wěn)定性(Ewert等，Biochemistry41:3628-36, 2002)。經(jīng)典的僅具有VH的片段很難以可溶性形式產(chǎn)生，但可以在使框架殘基發(fā)生改變而更類(lèi)似于VHH時(shí)獲得溶解性和特異性結(jié)合方面的改良。(參見(jiàn)例如Reichman等，J Immunol Methodsl999, 231:25-38。)用于產(chǎn)生具有駱駝科動(dòng)物重鏈的抗體的方法描述于例如美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)20050136049和20050037421中。
[0183]抗體重鏈可變域是僅具有15kDa分子質(zhì)量的最小的完全功能性抗原結(jié)合片段，這一實(shí)體被稱(chēng)為納米抗體(Cortez-Retamozo 等，Cancer Research64:2853-57，2004)。納米抗體文庫(kù)可以如 Conrath 等(Antimicrob Agents Chemother45:2807-12, 2001)中所述由接受免疫接種的單峰駱§它產(chǎn)生或使用如Revets等，Expert Opin.Biol.Ther.5(1):111-24(2005)中所述的重組方法產(chǎn)生。
[0184]雙特異性Fab-scFv (“雙體”)和三特異性Fab-(scFv) (2)(“三體”)的制備描述于Schoonjans 等(J Immunol.165:7050-57，2000)以及 Willems 等(J Chromatogr B AnalytTechnol Biomed Life Sc1.786:161-76，2003)中。對(duì)于雙體或三體，使 scFv 分子與 VL-CL(L)和VH-CHl (Fd)鏈中的一者或兩者融合，例如為了產(chǎn)生三體，使兩個(gè)scFv與Fab的C端融合，而在雙體中，使一個(gè)scFv與Fab的C端融合。
[0185]由scFv通過(guò)肽接頭(無(wú)鉸鏈)或通過(guò)IgG鉸鏈與CH3融合所組成的“微型抗體”已描述于 Olafsen 等,Protein Eng Des Sel.17 (4): 315-23，2004 中。
[0186]胞內(nèi)抗體是顯示出細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并且可以操控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)功能的單鏈抗體(Biocca 等，EMB0 J.9:101-108, 1990 ；CoIby 等，Proc Natl Acad Sci U SA.101:17616-21,2004)。胞內(nèi)抗體包含了保持抗體構(gòu)建體處于細(xì)胞內(nèi)區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞信號(hào)序列，可以如以下文獻(xiàn)中所述而產(chǎn)生:Mhashilkar等(EMBO J14:1542-51，1995)以及Wheeler等(FASEB J.17:1733-5.2003)。穿膜抗體(transbody)是可穿透細(xì)胞的抗體,其中蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD)與單鏈可變區(qū)片段(scFv)抗體融合(Heng 等，Med Hypotheses.64:1105-8，2005)。
[0187]進(jìn)一步涵蓋了如下的抗體，所述抗體是對(duì)靶標(biāo)蛋白具有特異性的SMIP或結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白。這些構(gòu)建體是單鏈多肽，這些單鏈多肽包含與實(shí)現(xiàn)抗體效應(yīng)功能所需的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域融合的抗原結(jié)合域。參見(jiàn)例如W003/041600、美國(guó)專(zhuān)利公布20030133939以及美國(guó)專(zhuān)利公布20030118592。
[0188]可以將一個(gè)或多個(gè)CDR以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵方式并入分子中以使它成為免疫粘附素。免疫粘附素可以并有一個(gè)或多個(gè)CDR作為較大多肽鏈的一部分，可以使一個(gè)或多個(gè)CDR共價(jià)連接至另一條多肽鏈，或可以非共價(jià)鍵方式并有一個(gè)或多個(gè)CDR。CDR使得免疫粘附素能夠特異性結(jié)合所關(guān)注的特定抗原。
[0189]因此，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生包含抗體重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的一個(gè)、兩個(gè)和/或三個(gè)CDR(例如單獨(dú)的單個(gè)CDR，或串聯(lián)的2個(gè)、3個(gè)或其他多個(gè)CDR重復(fù)區(qū)；或2個(gè)或3個(gè)單獨(dú)CDR或串聯(lián)重復(fù)區(qū)的組合；任選地在CDR或重復(fù)區(qū)之間存在間隔氨基酸序列)的多種組合物。
[0190]多特異性抗體[0191]在一些實(shí)施方案中，可能希望產(chǎn)生對(duì)相同或不同分子的至少兩個(gè)不同的表位具有結(jié)合特異性的多特異性(例如雙特異性)抗靶標(biāo)抗體。示例性雙特異性抗體可以結(jié)合靶標(biāo)分子的兩個(gè)不同的表位?；蛘?，可以將靶標(biāo)特異性抗體臂與結(jié)合細(xì)胞表面分子以便使細(xì)胞防御機(jī)制集中于靶標(biāo)的抗體臂組合，所述細(xì)胞表面分子如T細(xì)胞受體分子(例如CD2或CD3)或 IgG 的 Fe 受體(Fcy R)，如 Fe Y RI (CD64)、FcyRII (CD32)以及 Fe Y RIII (CD16)。雙特異性抗體還可以用于使細(xì)胞毒性劑定位于表達(dá)或吸收靶標(biāo)的細(xì)胞。這些抗體具有靶標(biāo)結(jié)合臂以及結(jié)合細(xì)胞毒性劑(例如皂草素、抗干擾素-60、長(zhǎng)春花生物堿、蓖麻毒素A鏈、甲氨蝶呤(methotrexate)或放射性同位素半抗原)的抗體臂。可以將雙特異性抗體制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F (ab’)2雙特異性抗體)。
[0192]根據(jù)用于制備雙特異性抗體的另一種途徑，可以對(duì)一對(duì)抗體分子之間的界面進(jìn)行工程化以使從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的異二聚體的百分比達(dá)到最大。優(yōu)選的界面包含抗體恒定域的CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在這種方法中，將第一抗體分子的界面中的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈用較大的側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)置換。通過(guò)用較小的氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)置換大氨基酸側(cè)鏈而在第二抗體分子的界面上形成與一個(gè)或多個(gè)大側(cè)鏈具有相同或相似大小的補(bǔ)償性“空腔結(jié)構(gòu)”。這提供了提高異二聚體相對(duì)于其他不需要的最終產(chǎn)物(如同二聚體)的產(chǎn)率的機(jī)制。參見(jiàn)W096/27011。
[0193]雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源綴合”抗體。舉例來(lái)說(shuō)，可以使異源綴合物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶合，使另一抗體與生物素偶合?？梢允褂萌魏芜m當(dāng)?shù)慕宦?lián)方法制備異源綴合抗體。適合的交聯(lián)劑以及許多交聯(lián)技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，676，980中。
[0194]用于由抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)也已描述于文獻(xiàn)中。舉例來(lái)說(shuō)，可以利用化學(xué)鍵制備雙特異性抗體 。Brennan等(Science229:81-83，1985)描述了使完整抗體發(fā)生蛋白水解切割以產(chǎn)生F(ab’)2片段的程序。在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉存在下使這些片段還原以使鄰近的二硫醇穩(wěn)定并且防止分子間二硫鍵形成。然后使所產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通過(guò)使用巰基乙胺還原以使Fab’ -TNB衍生物之一重新轉(zhuǎn)化成Fab’ -硫醇并且與等摩爾量的另一 Fab’ -TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產(chǎn)生的雙特異性抗體可以被用作用于對(duì)酶進(jìn)行選擇性固定化的試劑。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使直接從大腸埃希氏菌(E.coli)中回收的Fab’-SH片段在體外化學(xué)偶合以形成雙特異性抗體。(Shalaby 等，J.Exp.Med.175:217-225(1992))。
[0195]Shalaby等，J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了完全人源化的雙特異性抗體F(ab’)2分子的制備。每個(gè)Fab’片段單獨(dú)地由大腸埃希氏菌分泌并且在體外進(jìn)行直接化學(xué)偶合以形成雙特異性抗體。由此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過(guò)表達(dá)HER2受體的細(xì)胞和正常人類(lèi)T細(xì)胞，并且能夠觸發(fā)人類(lèi)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞針對(duì)人類(lèi)乳腺腫瘤靶標(biāo)的溶解活性。
[0196]也已經(jīng)描述了用于直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備和分離雙特異性抗體片段的不同技術(shù)。舉例來(lái)說(shuō)，已利用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生了雙特異性抗體。(Kostelny等，J.1mmunol.148:1547-1553, 1992)。通過(guò)基因融合使來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab’部分連接。使抗體同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。也可以利用這種方法產(chǎn)生抗體同二聚體。由Hollinger等(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-48, 1993)描述的“雙鏈抗體”技術(shù)已提供了制備雙特異性抗體片段的替代性機(jī)制。
[0197]所述片段包含通過(guò)接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)連接的重鏈可變區(qū)(VH)，所述接頭過(guò)短而不允許同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生配對(duì)。因此，迫使一個(gè)片段的VH和VL結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)片段的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。也已經(jīng)報(bào)道了通過(guò)使用單鏈Fv (scFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見(jiàn)Gruber等，J.1mmunol.152:5368(1994)。
[0198]或者，雙特異性抗體可以是如Zapata等，Protein Eng.8:1057-62 (1995)中所述而制備的“線性抗體”。線性抗體包含形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)的一對(duì)串聯(lián)的Fd區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1)。線性抗體可以具有雙特異性或單特異性。
[0199]在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體可以是螯合重組抗體(CRAb)。螯合重組抗體識(shí)別靶標(biāo)抗原中相鄰并且不重疊的表位，并且具有足夠的柔性以能夠同時(shí)結(jié)合兩個(gè)表位(Neri 等，J Mol Biol.246:367-73，1995)。
[0200]還涵蓋了效價(jià)大于2的抗體。舉例來(lái)說(shuō)，可以制備三特異性抗體。(Tutt等，J.1mmunol.147:60，1991)。
[0201]嵌合抗體和人源化抗體
[0202]由于嵌合或人源化抗體在人類(lèi)中的免疫原性小于親本非人類(lèi)(例如小鼠)單克隆抗體，所以它們可以被用于治療人類(lèi)而具有小得多的過(guò)敏反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。
[0203]可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)程序(參見(jiàn)Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81, 6841-6855 (1984)；以及 Boulianne 等，Nature312, 643-646，(1984))產(chǎn)生嵌合單克隆抗體，其中使非人類(lèi)(例如小鼠)單克隆抗體的Ig可變域與人類(lèi)Ig恒定域融合。
[0204]可以通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)人源化抗體，所述方法包括例如:(I)將非人類(lèi)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)移植到人類(lèi)框架和恒定區(qū)上(這一過(guò)程在本領(lǐng)域中被稱(chēng)為經(jīng)由“⑶R移植”進(jìn)行人源化)，(2)移植整個(gè)非人類(lèi)可變域，但通過(guò)置換表面殘基將它們用類(lèi)似于人類(lèi)的表面“遮蓋”(這一過(guò)程在本領(lǐng)域中被稱(chēng)為“鑲飾”)，或者可選地，⑶在被測(cè)定為不可能會(huì)不利地影響抗原結(jié)合或蛋白質(zhì)折疊，但有可能會(huì)降低在人類(lèi)環(huán)境中的免疫原性的位置上用人類(lèi)氨基酸取代(例如HUMAN ENGINEERING?)。在本公開(kāi)中，人源化抗體將包括“人源化”抗體、“鑲飾”抗體以及“HUMAN ENGINEERED?”抗體。這些方法公開(kāi)于例如 Jones 等，Nature321:522525(1986) ；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sc1., U.S.A., 81: 6851-6855 (1984) ；Morrison 和 Oi, Adv.Tmmunol., 44:65-92(1988) ；Verhoeyer 等,Science239:1534-1536(1988) ；Padlan, Molec.1mmun.28:489-498(1991) ；Padlan,Molec.1mmunol.31:169-217 (1994) ；Studnicka等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5, 766, 886 ；Studnicka 等,Protein Engineering?: 805-814, 1994 ；Co等，J.1mmunol.152, 2968-2976(1994) ；Riechmann 等，Nature332Z323-27Q988)；以及Kettleborough等，Protein Eng.4:773-783 (1991)中，這些參考文獻(xiàn)各自以引用的方式并入本文。 [0205]⑶R移植包括將來(lái)自小鼠重鏈和輕鏈Ig可變域的六個(gè)⑶R中的一個(gè)或多個(gè)引入到人類(lèi)Ig可變域的適當(dāng)?shù)乃膫€(gè)框架區(qū)中。這種技術(shù)(Riechmann等，Nature332:323-27 (1988))利用了保守框架區(qū)(FR1-FR4)作為支撐CDR環(huán)(與抗原的主要接觸點(diǎn))的骨架。然而，CDR移植的缺點(diǎn)在于它可能會(huì)產(chǎn)生結(jié)合親和力大致上低于原始小鼠抗體的人源化抗體，這是因?yàn)榭蚣軈^(qū)的氨基酸可以促成抗原結(jié)合并且因?yàn)镃DR環(huán)的氨基酸可能影響兩個(gè)Ig可變域的締合。為了維持人源化單克隆抗體的親和力，可以通過(guò)以下手段來(lái)改良CDR移植技術(shù):選擇與原始小鼠抗體的框架區(qū)最相似的人類(lèi)框架區(qū)，以及在對(duì)抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬的輔助下對(duì)框架或CDR內(nèi)的單個(gè)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)誘變(例如Co等，J.1mmunol.152，2968-2976(1994))。
[0206]來(lái)自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的人類(lèi)抗體 [0207]針對(duì)靶標(biāo)蛋白的人類(lèi)抗體還可以使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白并且經(jīng)過(guò)工程化而含有人類(lèi)免疫球蛋白基因座。舉例來(lái)說(shuō)，W098/24893公開(kāi)了具有人類(lèi)Ig基因座的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述動(dòng)物因內(nèi)源性重鏈和輕鏈基因座失活而不會(huì)產(chǎn)生功能性內(nèi)源性免疫球蛋白。W091/00906也公開(kāi)了能夠?qū)γ庖咴l(fā)動(dòng)免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因非靈長(zhǎng)類(lèi)哺乳動(dòng)物宿主，其中所述抗體具有靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物恒定區(qū)和/或可變區(qū)，并且其中編碼內(nèi)源性免疫球蛋白的基因座被取代或失活。1096/30498和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，091，001公開(kāi)了使用Cre/Lox系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白基因座進(jìn)行修飾，如置換全部或一部分恒定區(qū)或可變區(qū)以形成經(jīng)過(guò)修飾的抗體分子。W094/02602公開(kāi)了內(nèi)源性Ig基因座已經(jīng)失活并且具有功能性人類(lèi)Ig基因座的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物宿主。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，939，598公開(kāi)了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，其中所述小鼠缺乏內(nèi)源性重鏈，并且表達(dá)包含一個(gè)或多個(gè)異種恒定區(qū)的外源性免疫球蛋白基因座。還參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，114，598,6,657, 103以及6，833，268。
[0208]使用上述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可以針對(duì)所選擇的抗原分子產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并且可以從所述動(dòng)物體內(nèi)取出抗體產(chǎn)生細(xì)胞并用于產(chǎn)生分泌人類(lèi)單克隆抗體的雜交瘤。免疫接種方案、佐劑等是本領(lǐng)域已知的，并且被用于如W096/33735中所述對(duì)例如轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫接種。這一公布公開(kāi)了針對(duì)包括11-6、11^-8、了即&、人類(lèi)0)4、1^選擇素4?39以及破傷風(fēng)毒素在內(nèi)的多種抗原分子的單克隆抗體。可以測(cè)試所述單克隆抗體抑制或中和相應(yīng)蛋白質(zhì)的生物活性或生理效應(yīng)的能力。W096/33735公開(kāi)了針對(duì)IL-8的單克隆抗體，這些單克隆抗體源自于接受IL-8免疫接種的轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫細(xì)胞，阻斷IL-8所誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞的功能。對(duì)被用于對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行免疫接種的抗原具有特異性的人類(lèi)單克隆抗體還公開(kāi)于W096/34096和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0030194404 ;以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0030031667中。
[0209]另外的可用于制備單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，770，429和Fishwild 等(Nat.Biotechnol.14:845-851 (1996))中所述的Medarex ? I ii M A b- M OU S [￡0?",其含有編碼人類(lèi)抗體重鏈和輕鏈的未重排人類(lèi)抗體基因中的基因序列。對(duì)I IuMAb-MOl ISM:進(jìn)行免疫接種能夠產(chǎn)生針對(duì)靶標(biāo)蛋白的完全人類(lèi)單克隆抗體。
[0210]此外，Ishida等(Cloning Stem Cells.4:91-102 (2002))描述了 TransChromo 小鼠(TCM0USE?)，所述小鼠包含人類(lèi)DNA的具有兆堿基級(jí)大小的區(qū)段并且并有整個(gè)人類(lèi)免疫球蛋白(hlg)基因座。TCM0USE?具有完全不同的hlg譜，包括所有IgG亞類(lèi)(IgGl_IgG4)在內(nèi)。用不同的人類(lèi)抗原對(duì)TCM0USE?進(jìn)行免疫接種會(huì)產(chǎn)生包含人類(lèi)抗體的抗體反應(yīng)。
[0211]還參見(jiàn)Jakobovits 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:2551 (1993) ;Jakobovits等，Nature, 362:255_258 (I993) ; Bruggermann 等，Year in Tmmunol., 7:33 (1993);以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，591，669、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，589，369、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，545，807 ;以及美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)20020199213。美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)20030092125描述了使動(dòng)物的免疫應(yīng)答偏向于所需表位的方法。還可以通過(guò)體外活化B細(xì)胞產(chǎn)生人類(lèi)抗體(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，567，610和5，229，275)。
[0212]來(lái)自展示技術(shù)的人類(lèi)抗體
[0213]用于產(chǎn)生重組人類(lèi)抗體基因譜的技術(shù)不斷發(fā)展以及使編碼的抗體片段展示于絲狀噬菌體表面上提供了一種直接制備人類(lèi)抗體的手段。由噬菌體技術(shù)產(chǎn)生的抗體在細(xì)菌中以抗原結(jié)合片段(通常是Fv或Fab片段)的形式產(chǎn)生并且因此缺乏效應(yīng)功能?？梢酝ㄟ^(guò)以下兩種策略中的一種引入效應(yīng)功能:可以將片段工程化成例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的完全抗體，或工程化成具有能夠觸發(fā)效應(yīng)功能的第二結(jié)合位點(diǎn)的雙特異性抗體片段。
[0214]本公開(kāi)涵蓋了一種用于產(chǎn)生靶標(biāo)特異性抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，所述方法包括以下步驟:在噬菌體上合成人類(lèi)抗體文庫(kù)，使用靶標(biāo)蛋白或其部分對(duì)所述文庫(kù)進(jìn)行篩選，分離結(jié)合祀標(biāo)的曬菌體，以及從曬菌體中獲得抗體。舉例而言，一種用于制備用于曬菌體展示技術(shù)中的抗體文庫(kù)的方法包括以下步驟:使用靶標(biāo)抗原或其抗原部分對(duì)包含人類(lèi)免疫球蛋白基因座的非人類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種以引起免疫應(yīng)答，從接受免疫接種的動(dòng)物體內(nèi)提取抗體產(chǎn)生細(xì)胞；從所提取的細(xì)胞中分離RNA，對(duì)所述RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA，使用引物擴(kuò)增cDNA，以及將所述cDNA插入到噬菌體展示載體中以使得抗體在噬菌體上表達(dá)。可以用這種方式獲得本公開(kāi)的重組靶標(biāo)特異性抗體。
[0215]在另一個(gè)實(shí)例中，可以從未接受免疫接種的動(dòng)物體內(nèi)提取抗體產(chǎn)生細(xì)胞，從所提取的細(xì)胞中分離RNA并且進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生cDNA，使用引物擴(kuò)增所述cDNA，并且插入到噬菌體展示載體中以使得抗體在噬菌體上表達(dá)。噬菌體展示法經(jīng)由使抗體譜展示于絲狀噬菌體表面上，并且繼而通過(guò)噬菌體與所選擇的抗原的結(jié)合對(duì)它們進(jìn)行選擇來(lái)模擬免疫選擇。一種這樣的技術(shù)描述于W099/10494中，W099/10494描述了利用這種途徑分離針對(duì)MPL和msk受體的具有高親和力并且具有功能性激動(dòng)性的抗體。可以通過(guò)對(duì)重組組合抗體文庫(kù)，優(yōu)選地scFv噬菌體展示文庫(kù)進(jìn)行篩選來(lái)分離本公開(kāi)的抗體，所述抗體文庫(kù)是使用由源自于人類(lèi)淋巴細(xì)胞的mRNA制備的人類(lèi)VL和VHcDNA制備的。用于制備和篩選這些文庫(kù)的方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，969，108。用于產(chǎn)生噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒是可商購(gòu)獲得的(例如Pharmacia重組卩遼菌體抗體系統(tǒng)，目錄號(hào)27_9400_01 ；以及StratageneSurfZAP.TM.噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)240612)。還存在其他可以用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(kù)的方法和試劑(參見(jiàn)例如Ladner等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，223，409 ；Kang等的PCT公布號(hào) W092/18619 ；Dower 等的 PCT 公布號(hào) W091/17271 ；ffinter 等的 PCT 公布號(hào) W092/20791 ；Markland等的PCT公布號(hào)W092/15679 ;Breitling等的PCT公布號(hào)W093/01288 ；McCafferty等的 PCT 公布號(hào) W092/01047 ；Garrard 等的 PCT 公布號(hào) W092/09690 ；Fuchs 等，(1991)Bio/Technology9:1370-1372 ；Hay 等，(1992)Hum.Antibod.Hybridomas3:81-85 ;Huse等，(1989) Science246:1275-1281 ;McCafferty 等，Nature (1990) 348:552-554 Griffiths等，(1993)EMBO J12:725-734 ；Hawkins 等，(1992)J.Mol.Biol.226:889-896 ；Clackson等，(1991)Nature352:624-628 ；Gram 等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:3576-3580 ；Garrad 等，(1991) Bio/Technology9:1373-1377 ；Hoogenboom 等，(1991)Nuc AcidResl9:4133-4137 ;以及 Barbas 等，(1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:7978-7982)。
[0216]在一個(gè)實(shí)施方案中，為了分離針對(duì)靶標(biāo)抗原具有特異性并且具有所需特征的人類(lèi)抗體，對(duì)人類(lèi)VH和VL文庫(kù)進(jìn)行篩選以選擇具有所需特異性的抗體片段。用于這種方法中的抗體文庫(kù)優(yōu)選地是如本文以及本領(lǐng)域中所述加以制備和篩選的scFv文庫(kù)(McCafferty等的 PCT 公布號(hào) W092/01047 ；McCafferty 等(Nature348: 552-554 (1990));以及 Griffiths 等(EMBO J12:725-734(1993)))。優(yōu)選地使用靶標(biāo)蛋白作為抗原對(duì)scFv抗體文庫(kù)進(jìn)行篩選。
[0217]或者，將抗體的Fd片段(VH-CHl)和輕鏈(VL-CL)單獨(dú)地通過(guò)PCR克隆并且隨機(jī)重組成組合噬菌體展示文庫(kù)，然后可以針對(duì)與特定抗原的結(jié)合對(duì)所述文庫(kù)進(jìn)行選擇。使Fab片段表達(dá)于噬菌體表面上，即以物理方式連接至編碼它們的基因。因此，通過(guò)抗原結(jié)合對(duì)Fab進(jìn)行選擇同時(shí)選擇了 Fab編碼序列，隨后可以對(duì)所述Fab編碼序列進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)由若干輪抗原結(jié)合和重新擴(kuò)增(這個(gè)程序被稱(chēng)作淘選)，使對(duì)抗原具有特異性的Fab富集并且最終分離。
[0218]在1994年，描述了一種用于使抗體人源化的途徑(被稱(chēng)作“導(dǎo)向選擇”)。導(dǎo)向選擇利用了噬菌體展示技術(shù)能夠使小鼠單克隆抗體人源化的能力(參見(jiàn)Jespers，L.S.等，Bio/Technologyl2, 899-903(1994))。為此，可以使小鼠單克隆抗體的Fd片段與人類(lèi)輕鏈文庫(kù)組合展示，并且然后可以使用抗原對(duì)所得到的雜合Fab文庫(kù)進(jìn)行選擇。小鼠Fd片段從而提供了引導(dǎo)選擇的模板。隨后，將所選擇的人類(lèi)輕鏈與人類(lèi)Fd片段文庫(kù)組合。對(duì)所得到的文庫(kù)進(jìn)行選擇會(huì)產(chǎn)生完全人類(lèi)Fab。
[0219]已經(jīng)描述了多種用于從噬菌體展示文庫(kù)中獲得人類(lèi)抗體的程序(參見(jiàn)例如 Hoogenboom 等，J.Mo I.B io I.，227: 38 I (1991) ；Marks 等，J.Mol.Biol, 222:581-597(1991);美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，565，332 和 5，573，905 ；Clackson, T.和 Wells, J.A., TIBTECH12, 173-184(1994))。具體來(lái)說(shuō)，對(duì)源自于噬菌體展示文庫(kù)的抗體進(jìn)行體外選擇和演變已成為一種有效的手段(參見(jiàn)Burton, D.R.和Barbas III, C.F., Adv.1mmunol.57, 191-280(1994) ；ffinter, G.等,Annu.Rev.Tmmunol.12, 433-455(1994)；美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)20020004215和W092/01047 ;美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)20030190317 ;以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，054，287 和 5，877，293)。
[0220]Watkins, “Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by CaptureLift,，，Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display:Methods andProtocolsl78:187-193(2002)`以及2003年3月6日公布的美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)20030044772描述了通過(guò)捕捉提升物(capture lift)對(duì)曬菌體表達(dá)的抗體文庫(kù)或其他結(jié)合分子進(jìn)行篩選的方法，這種方法包括將候選結(jié)合分子固定于固體支撐物上。
[0221]通過(guò)使表達(dá)為噬菌體蛋白質(zhì)融合物(例如，使用M13基因III)的一條鏈與表達(dá)為可溶性片段的互補(bǔ)鏈相締合使Fv片段展示于噬菌體表面上。預(yù)期所述噬菌體可以是絲狀噬菌體，如I類(lèi)噬菌體:fd、M13、fl、Ifl、lke、ZJ/Z、Ff中的一種和II類(lèi)噬菌體:Xf>Pfl以及Pf3中的一種。噬菌體可以是M13或fd或其衍生物。
[0222]在選擇了初始人類(lèi)VL和VH區(qū)段后，進(jìn)行“混合與匹配”實(shí)驗(yàn)，其中針對(duì)靶標(biāo)結(jié)合對(duì)不同對(duì)的初始所選擇的VL和VH區(qū)段進(jìn)行篩選，以便選擇優(yōu)選的VL/VH對(duì)組合。另外，為了進(jìn)一步提高抗體的質(zhì)量，可以在與在天然免疫應(yīng)答期間負(fù)責(zé)抗體親和力成熟的體內(nèi)體細(xì)胞突變過(guò)程相似的過(guò)程中，優(yōu)選地在VH和/或VL的⑶Rl、⑶R2或⑶R3區(qū)中的任一個(gè)內(nèi)，使一對(duì)或多對(duì)優(yōu)選的VL/VH的VL和VH區(qū)段發(fā)生隨機(jī)突變。這種體外親和力成熟可以通過(guò)使用分別與VH CDR1、CDR2以及CDR3或VL CDR1、CDR2以及CDR3互補(bǔ)的PCR引物對(duì)VL和VH區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述引物已經(jīng)在某些位置上“攙入” 了四個(gè)核苷酸堿基的隨機(jī)混合物以使得所得的PCR產(chǎn)物編碼VH和/或VL CDR3區(qū)中已引入了隨機(jī)突變的VL和VH區(qū)段。可以針對(duì)與靶標(biāo)抗原的結(jié)合對(duì)這些經(jīng)過(guò)隨機(jī)突變的VL和VH區(qū)段進(jìn)行重新篩選。
[0223]在從重組免疫球蛋白展示文庫(kù)中篩選和分離靶標(biāo)特異性抗體后，可以從展示包裝中(例如從噬菌體基因組中)回收編碼所選抗體的核酸，并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)將所述核酸亞克隆到其他表達(dá)載體中。必要時(shí)，可以如下文所述進(jìn)一步操控所述核酸以產(chǎn)生本公開(kāi)的其他抗體形式。為了表達(dá)通過(guò)篩選組合文庫(kù)而分離的重組人類(lèi)抗體，如本文所述，將編碼所述抗體的DNA克隆到重組表達(dá)載體中，并且引入到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中。
[0224]預(yù)期可以在細(xì)菌或宿主細(xì)胞的增變株中進(jìn)行噬菌體展示法。增變株是具有遺傳缺陷的宿主細(xì)胞，所述遺傳缺陷會(huì)引起在所述宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的DNA相對(duì)于它的親本DNA發(fā)生突變。示例性增變株是NR9046mutD5和NR9046mut Tl。
[0225]還預(yù)期可以使用輔助噬菌體進(jìn)行噬菌體展示法。這是一種用于感染含有缺陷性噬菌體基因組的細(xì)胞并且用于補(bǔ)足所述缺陷的噬菌體。缺陷性噬菌體基因組可以是去除了某些功能編碼基因序列的噬菌?；蚴删w。輔助噬菌體的實(shí)例是M13K07、M13K07基因III3號(hào)；以及展示或編碼與衣殼蛋白融合的結(jié)合分子的噬菌體。
[0226]還使用W092/01047中所公開(kāi)的分層二元組合法(hierarchical dualcombinatorial approach)經(jīng)由曬菌體展示篩選法來(lái)產(chǎn)生抗體,在所述分層二元組合法中使用含有H鏈或L鏈克隆的單獨(dú)的菌落感染編碼另一條鏈(L或H)的克隆的整個(gè)文庫(kù)，并且根據(jù)噬菌體展示技術(shù)(如其中所述的那些噬菌體展示技術(shù))對(duì)所得的雙鏈特異性結(jié)合成員進(jìn)行選擇。這種技術(shù)也公開(kāi)于Marks等(Bio/Technology, 10:779-783(1992))中。
[0227]用于在酵母、微 生物以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面上展示肽的方法還已經(jīng)被用于鑒定抗原特異性抗體。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，348，867 ;5，723，287 ;6，699，658 ；ffittrup, Curr0ρ.Biotech.12:395-99(2001) ;Lee 等，Trends in Biotech.21(I)45-52(2003) ；Surgeeva等，Adv.Drug Deliv.Rev.58:1622-54(2006)?？梢允箍贵w文庫(kù)與酵母蛋白(如凝集素)連接，從而有效地模擬免疫系統(tǒng)中的B細(xì)胞在細(xì)胞表面上對(duì)抗體的展示。
[0228]除了噬菌體展示法之外，還可以使用體外展示法和微生物細(xì)胞展示(包括核糖體展不和 mRNA 展不)來(lái)分離抗體(Amstutz 等,Curr.0p.Biotech.12:400-05 (2001))。使用核糖體展示對(duì)多肽進(jìn)行選擇描述于Hanes等(Proc.Natl Acad SciUSA, 94:4937-4942(1997))以及頒予 Kawasaki 的美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5,643，768 和 5,658，754 中。核糖體展示也可用于對(duì)抗體進(jìn)行快速大規(guī)模突變分析。選擇性誘變途徑也提供了一種制備活性得到提高的抗體的方法，可以使用核糖體展示技術(shù)對(duì)所述抗體進(jìn)行選擇。
[0229]氨基酸序列變體
[0230]預(yù)期產(chǎn)生包含抗體的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)和/或六個(gè)⑶R的經(jīng)過(guò)修飾的多肽組合物，其中CDR發(fā)生改變以使得對(duì)靶標(biāo)分子的特異性或親和力有所增強(qiáng)。典型地例如通過(guò)以下手段連續(xù)地對(duì)抗體⑶R內(nèi)的位點(diǎn)進(jìn)行修飾:首先用保守性選擇物進(jìn)行取代(例如，用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸)，然后用更不相似的選擇物進(jìn)行取代(例如，用疏水性氨基酸取代帶電荷的氨基酸)，然后可以在靶標(biāo)位點(diǎn)上產(chǎn)生缺失或插入。舉例來(lái)說(shuō)，使用圍繞⑶R的保守框架序列，產(chǎn)生與這些共有序列互補(bǔ)的PCR引物來(lái)擴(kuò)增位于引物區(qū)域之間的抗原特異性CDR序列。用于克隆和表達(dá)核苷酸和多肽序列的技術(shù)是本領(lǐng)域公認(rèn)的[參見(jiàn)例如 Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold SpringHarbor, New York(1989)]。將所擴(kuò)增的⑶R序列連接到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒中。包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)和/或六個(gè)克隆的CDR的質(zhì)粒任選地含有編碼與CDR連接的區(qū)域的另外的多肽。 [0231]針對(duì)對(duì)于原始抗原的結(jié)合親和力來(lái)篩選包含經(jīng)過(guò)修飾的CDR的抗體物質(zhì)。另外，進(jìn)一步測(cè)試抗體或多肽中和靶標(biāo)抗原活性的能力。舉例來(lái)說(shuō)，可以如實(shí)施例中所示對(duì)本公開(kāi)的抗體進(jìn)行分析以測(cè)定它們干擾靶標(biāo)抗原的生物活性的能力。
[0232]可以通過(guò)在下文中更詳細(xì)描述的保守性或非保守性氨基酸取代進(jìn)行修飾?！安迦搿被颉叭笔А眱?yōu)選地在約I至20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地I至10個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)?？梢酝ㄟ^(guò)使用重組DNA技術(shù)在抗體多肽分子中系統(tǒng)性地進(jìn)行氨基酸取代并且測(cè)定所得的重組變體的活性而引入變異?？梢杂谠趤?lái)自不同物種的核酸中有所不同的位點(diǎn)(可變區(qū)位置)或高度保守的區(qū)域(恒定區(qū))中的位點(diǎn)上進(jìn)行核酸改變。在下文中更詳細(xì)地描述了用于改變抗體序列和表達(dá)可用于本公開(kāi)中的抗體多肽組合物的方法。
[0233]氨基酸序列插入物包括長(zhǎng)度在I個(gè)殘基至含有100個(gè)或更多個(gè)殘基的多肽范圍內(nèi)的氨基端和/或羧基端融合物，以及具有單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入物。末端插入物的實(shí)例包括具有N端甲硫氨?；鶜埢目贵w或與表位標(biāo)簽或補(bǔ)救受體(salvagereceptor)表位融合的抗體(包括抗體片段)。抗體分子的其他插入型變體包括在例如N端或C端上與延長(zhǎng)所述抗體的血清半衰期的多肽的融合物。
[0234]術(shù)語(yǔ)“經(jīng)過(guò)表位標(biāo)記的”是指與表位標(biāo)簽融合的抗體。表位標(biāo)簽多肽具有足夠的殘基以提供表位從而可以產(chǎn)生針對(duì)所述表位的抗體，但又足夠短以使它不會(huì)干擾抗體的活性。表位標(biāo)簽優(yōu)選地是足夠獨(dú)特的以使得針對(duì)其的抗體大致上不會(huì)與其他表位交叉反應(yīng)。適合的標(biāo)簽多肽一般具有至少6個(gè)氨基酸殘基并且通常具有約8個(gè)-50個(gè)之間的氨基酸殘基(優(yōu)選地約9個(gè)-30個(gè)之間的殘基)。實(shí)例包括flu血凝素(HA)標(biāo)簽多肽和它的抗體12CA5 (Field 等，Mol.Cell.Biol.8:2159-2165 (1988) ) ；c-myc 標(biāo)簽和針對(duì)其的 8F9、3C7、6E10、G4、B7 以及 9E10 抗體(Evan 等，Mol.Cell.Biol.5:3610-16(1985));以及單純皰疹病毒糖蛋白 D (gD)標(biāo)簽和它的抗體(Paborsky 等，Protein Engineerings: 547-53 (1990) )0其他示例性標(biāo)簽是多聚組氨酸序列，一般具有約六個(gè)組氨酸殘基，允許使用鎳螯合來(lái)分離所標(biāo)記的化合物。本領(lǐng)域熟知并且常規(guī)使用的其他標(biāo)記和標(biāo)簽(如FLAG?標(biāo)簽(EastmanKodak, Rochester, NY))由本公開(kāi)所涵蓋。
[0235]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”是指IgG分子(例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的Fe區(qū)中負(fù)責(zé)延長(zhǎng)IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的表位。
[0236]另一種類(lèi)型的變體是氨基酸取代型變體。這些變體的抗體分子中的至少一個(gè)氨基酸殘基已被去除，并且在它的位置上插入有不同的殘基。涵蓋了高變區(qū)或CDR區(qū)或框架區(qū)中的任一個(gè)內(nèi)的取代型誘變。保守性取代包括氨基酸被屬于它的類(lèi)別的另一個(gè)成員所置換。非保守性取代包括屬于這些類(lèi)別之一的成員被屬于另一類(lèi)別的成員所置換。
[0237]基于所牽涉的殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)方面的相似性，進(jìn)行保守性氨基酸取代。舉例來(lái)說(shuō)，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸(Ala，A)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(116，1)、纈氨酸(￥&1，￥)、脯氨酸(？1"0，？)、苯丙氨酸(？1^，？)、色氨酸(Trp，W)以及甲硫氨酸(Met，Μ);極性中性氨基酸包括甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬酰胺(Asn，N)以及谷氨酰胺(Gln，Q);帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸(Arg，R)、賴(lài)氨酸(Lys，K)以及組氨酸(His，H);以及帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)。
[0238]不牽涉到維持抗體的正確構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基也可以一般被絲氨酸取代，以提高分子的氧化穩(wěn)定性并且防止異常交聯(lián)。相反地，可以向抗體中添加一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸鍵以提高它的穩(wěn)定性(特別是在抗體是如Fv片段的抗體片段的情況下)。
[0239]親和力成熟
[0240]親和力成熟一般包括制備和篩選在親本抗體的CDR內(nèi)具有取代的抗體變體，以及選擇相對(duì)于親本抗體一種或多種生物特性(如結(jié)合親和力)有所改良的變體。用于產(chǎn)生這些取代型變體的適宜方式是使用噬菌體展示進(jìn)行的親和力成熟。簡(jiǎn)而言之，可以使若干個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個(gè)位點(diǎn))突變以在每個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。由此產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式由絲狀噬菌體粒子展示為與被包裝在每個(gè)粒子內(nèi)的M13的基因III產(chǎn)物的融合物。然后針對(duì)噬菌體展示的變體的生物活性(例如結(jié)合親和力)對(duì)它們進(jìn)行篩選。參見(jiàn)例如 W092/01047、W093/112366、W095/15388 以及 W093/19172。
[0241]目前的抗體親和力成熟法屬于兩個(gè)誘變類(lèi)別:隨機(jī)性和非隨機(jī)性。易錯(cuò)PCR、增變細(xì)菌菌株(Low等，J.Mol.Biol.260, 359-68 (1996) ;Irving等，Immunotechnology2, 127-143 (1996))以及飽和誘變(Nishimiya 等，J.Biol.Chem.275:12813-20 (2000) ；Chowdhury, P.S.Methods Mol.Biol.178, 269-85(2002))是隨機(jī)性誘變法的典型實(shí)例(Rajpal 等，ProcNatl Acad Sci USA.102:8466-71 (2005))。非隨機(jī)性技術(shù)經(jīng)常使用丙氨酸掃描或定點(diǎn)誘變來(lái)產(chǎn)生特定變體的有限集合。下文進(jìn)一步詳細(xì)地描述了一些方法。
[0242]經(jīng)由淘選法進(jìn)行的親和力成熟-通常經(jīng)由在遞減量的抗原存在的情況下對(duì)候選抗體進(jìn)行若干輪淘選來(lái)對(duì)重 組抗體進(jìn)行親和力成熟。使抗原量每輪發(fā)生遞減能夠選擇對(duì)所述抗原具有最高親和力的抗體，從而從一大組起始物質(zhì)中得到具有高親和力的抗體。經(jīng)由淘選進(jìn)行的親和力成熟是本領(lǐng)域熟知的并且描述于例如Huls等(Cancer ImmunolImmunother.50:163-71 (2001))中。使用曬菌體展示技術(shù)進(jìn)行親和力成熟的方法描述于本文其他地方并且是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如Daugherty等，Proc Natl Acad Sci U SA.97:2029-34(2000))。
[0243]精確(look-through)誘變-精確誘變(LTM)(Rajpal 等，Proc Natl Acad Sci US A.102:8466-71(2005))提供了一種用于對(duì)抗體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行快速定位的方法。對(duì)于LTM，選擇代表了由20種天然氨基酸提供的主要側(cè)鏈化學(xué)性質(zhì)的九個(gè)氨基酸來(lái)剖析功能性側(cè)鏈在抗體的所有六個(gè)⑶R中的每一個(gè)位置上對(duì)結(jié)合的影響。LTM在⑶R內(nèi)產(chǎn)生了一系列位置上的單個(gè)突變，其中每個(gè)“野生型”殘基均被9個(gè)所選氨基酸中的一個(gè)系統(tǒng)性地取代。將突變的CDR組合以產(chǎn)生復(fù)雜性和大小遞增而不會(huì)阻止定量展示所有變體的組合單鏈可變片段(scFv)文庫(kù)。在陽(yáng)性選擇后，對(duì)具有改良的結(jié)合性的克隆進(jìn)行測(cè)序，并且對(duì)有利的突變進(jìn)行定位。
[0244]易錯(cuò)PCR-易錯(cuò)PCR包括在不同輪選擇之間使核酸隨機(jī)化。隨機(jī)化可能因所使用的聚合酶的固有錯(cuò)誤率而以低比率出現(xiàn)，但是可以通過(guò)在轉(zhuǎn)錄期間使用具有高固有錯(cuò)誤率的聚合酶(Hawkins 等，J Mol Biol.226:889-96 (1992))進(jìn)行易錯(cuò) PCR (Zaccolo 等，J.Mol.Biol.285:775-783(1999))來(lái)增強(qiáng)。在突變循環(huán)后，使用本領(lǐng)域的常規(guī)方法選擇對(duì)抗原的親和力得到改良的克隆。[0245]DNA改組-核酸改組是一種用于將較短或較小的多核苷酸組在體外或體內(nèi)同源重組以產(chǎn)生變體多核苷酸的方法。DNA改組已描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，605，449、美國(guó)專(zhuān)利6，489，145.W002/092780 以及 Stemmer, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 91:10747-51 (1994)中?？傮w上，DNA改組包括以下3個(gè)步驟:使用脫氧核糖核酸酶I使有待改組的基因片段化，使片段隨機(jī)雜交并且在DNA聚合酶存在的情況下通過(guò)PCR (有性PCR)重新組裝或填補(bǔ)片段化的基因，以及通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增重新組裝的產(chǎn)物。
[0246]DNA改組與易錯(cuò)PCR的不同之處在于它是反向鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在易錯(cuò)PCR中，聚合酶起始位點(diǎn)的數(shù)目和分子的數(shù)目呈指數(shù)增長(zhǎng)。相反，在隨機(jī)多核苷酸的核酸重新組裝或改組中，起始位點(diǎn)的數(shù)目和隨機(jī)多核苷酸的數(shù)目(而非大小)隨時(shí)間推移不斷減少。
[0247]在抗體的情況下，DNA改組允許例如所有⑶Rl與所有⑶R2和所有⑶R3自由地組合締合。預(yù)期可以在同一個(gè)反應(yīng)中對(duì)多個(gè)家族的序列進(jìn)行改組。此外，改組一般保留相對(duì)順序，以使得例如⑶Rl不會(huì)出現(xiàn)在⑶R2的位置上。稀有改組體(shufflant)將含有大量最佳(例如最高親和力)的CDR并且可以基于它們的優(yōu)良親和力對(duì)這些稀有改組體進(jìn)行選擇。 [0248]可以被用于DNA改組的模板多核苷酸可以是DNA或RNA。它可能具有不同的長(zhǎng)度，這取決于有待重組或重新組裝的基因或更短或更小的多核苷酸的大小。優(yōu)選地，模板多核苷酸具有50bp至50kb。模板多核苷酸通常應(yīng)當(dāng)是雙鏈。
[0249]預(yù)期可以在基因選擇的初始步驟期間，將具有與模板多核苷酸具有同一性的區(qū)域和與模板多核苷酸異源的區(qū)域的單鏈或雙鏈核酸多核苷酸添加至模板多核苷酸中。還預(yù)期可以在初始步驟期間將兩個(gè)不同但相關(guān)的多核苷酸模板混合。
[0250]丙氨酸掃描-可以進(jìn)行丙氨酸掃描誘變來(lái)鑒定對(duì)抗原結(jié)合具有重大貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基。Cunningham 和 Wells (Science244:1081-1085 (1989))。鑒定一個(gè)殘基或一組目標(biāo)殘基(例如帶電荷的殘基，如arg、asp、his、Iys以及glu)并且將其用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選地是丙氨酸或多聚丙氨酸)置換以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過(guò)在取代位點(diǎn)上或?qū)τ谌〈稽c(diǎn)引入另外或其他變體來(lái)推敲對(duì)所述取代顯示出功能敏感性的那些氨基酸位置。
[0251 ] 計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)-可選地或另外地，可能有利的是，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定抗體與抗原之間的接觸點(diǎn)，或使用計(jì)算機(jī)軟件建立這些接觸點(diǎn)的模型。這些接觸殘基和相鄰的殘基是用于根據(jù)本文所詳細(xì)闡述的技術(shù)進(jìn)行取代的候選殘基。在產(chǎn)生這些變體后，如本文所述對(duì)該組變體進(jìn)行篩選，并且可以選擇在一個(gè)或多個(gè)相關(guān)測(cè)定中具有優(yōu)良特性的抗體以進(jìn)一步研發(fā)。
[0252]可選地或另外地，可以使用本領(lǐng)域已知的多種其他親和力成熟技術(shù)，包括例如以下文獻(xiàn)中所述的技術(shù):公布的專(zhuān)利申請(qǐng)W02009/088933 ；W02009/088928 ；W02009/088924 ；以及 Clackson 等，Nature352:624-628，1991 ；Marks 等，BiotechnologylO: 779-783，1992 ；Virnekas 等，Nucleic Acids Res.22:5600-5607, 1994 ；Glaser 等，J.1mmunol.149:3903-3913, 1992 ；Jackson 等，J.1mmunol.154:3310-3319, 1995 ；Schier等，J.Mol.Biol.255:28-43，1996 ;以及 Yang 等，J.Mol.Biol.254:392-403，1995，這些參考文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。
[0253]改變的糖基化
[0254]還可以產(chǎn)生抗體變體，所述抗體變體相對(duì)于親本抗體具有經(jīng)過(guò)修飾的糖基化型態(tài)，例如所述抗體中存在的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分缺失和/或增添了所述抗體中不存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。
[0255]抗體的糖基化典型地是N-連接型或O-連接型。N-連接型是指碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈連接。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸)是用于使碳水化合物部分與天冬酰胺側(cè)鏈進(jìn)行酶促連接的識(shí)別序列。這些三肽序列中的任一個(gè)在多肽中的存在形成潛在的糖基化位點(diǎn)。因此，可以通過(guò)改變氨基酸序列以使它含有這些三肽序列中的一個(gè)或多個(gè)來(lái)將N-連接型糖基化位點(diǎn)添加至抗體中。O-連接型糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種連接至羥氨基酸，所述羥氨基酸最常見(jiàn)地是絲氨酸或蘇氨酸，但是也可以使用5-羥脯氨酸或5-羥賴(lài)氨酸?？梢酝ㄟ^(guò)將一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基插入或取代于原始抗體的序列中來(lái)將O-連接型糖基化位點(diǎn)添加至抗體中。
[0256]Fe聚糖影響IgG與Fe受體和Clq的結(jié)合，并且因此對(duì)于IgG的效應(yīng)功能是重要的?？梢援a(chǎn)生具有經(jīng)過(guò)修飾的Fe聚糖和改變了的效應(yīng)功能的抗體變體。舉例來(lái)說(shuō)，具有經(jīng)過(guò)修飾的末端糖(如唾液酸、核心巖藻糖、二等分N-乙酰葡糖胺以及甘露糖殘基)的抗體可能具有改變了的對(duì)Fe Y RIIIa受體的結(jié)合性和改變了的ADCC活性。在另一個(gè)實(shí)例中，具有經(jīng)過(guò)修飾的末端半乳糖殘基的抗體可能具有改變了的對(duì)Clq的結(jié)合性和改變了的CDC活性(Raju, Curr.0pin.1mmunol.20:471-78 (2008))。
[0257]還涵蓋了不存在巖藻糖基化或巖藻糖基化有所減少的抗體分子，所述抗體分子展現(xiàn)出改良的ADCC活性。實(shí)現(xiàn)這一目的的多種方式是本領(lǐng)域已知的。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)使抗體分子與Fe Y RIII受體結(jié)合來(lái)介導(dǎo)ADCC效應(yīng)活性，已顯示這取決于CH2結(jié)構(gòu)域的Asn_297上的N-連接型糖基化的碳水化合物結(jié)構(gòu)。相較于天然的巖藻糖基化的抗體，非巖藻糖基化的抗體以增加的親和力結(jié)合這種受體并且更高效地觸發(fā)Fe Y RIII介導(dǎo)的效應(yīng)功能。舉例來(lái)說(shuō)，α -1, 6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶已被敲除的CHO細(xì)胞中非巖藻糖基化抗體的重組產(chǎn)生使得抗體的 ADCC 活性增加至 100 倍(Yamane-Ohnuki 等,Biotechnol Bioeng.87:614-22 (2004))?？梢越?jīng)由例如通過(guò)siRNA或反義RNA處理以降低巖藻糖基化通路中這種酶或其他酶的活性；將細(xì)胞系工程化以敲除所述一種或多種酶；或與選擇性糖基化抑制劑一起培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)類(lèi)似的作用(Rothman等，Mol` Immunol.26:1113-23 (1989))。一些宿主細(xì)胞株(例如Lecl3或大鼠雜交瘤YB2/0細(xì)胞系)天然地產(chǎn)生巖藻糖基化水平較低的抗體。(Shields等，J Biol Chem.277:26733-40(2002) ;Shinkawa等，J Biol Chem.278:3466-73 (2003))。還已經(jīng)測(cè)定例如經(jīng)由在過(guò)表達(dá)GnTIII酶的細(xì)胞中重組產(chǎn)生抗體以使二等分碳水化合物的水平增加會(huì)提高ADCC活性(Umana等,Nat Biotechnol.17:176-80 (1999))。已預(yù)測(cè)兩個(gè)巖藻糖殘基中只要一個(gè)不存在就可以足以提高ADCC活性(Ferrara等，BiotechnolBioeng.93:851-61(2006))。
[0258]效應(yīng)功能發(fā)生改變的變體
[0259]涵蓋了抗體的其他修飾。在一個(gè)方面，可能希望在效應(yīng)功能方面對(duì)本公開(kāi)的抗體進(jìn)行修飾，例如以增強(qiáng)抗體治療癌癥的有效性。用于修飾效應(yīng)功能的一種方法教導(dǎo)可以將一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基引入Fe區(qū)中，從而允許在這個(gè)區(qū)域中形成鏈間二硫鍵。由此產(chǎn)生的同二聚抗體可能具有改良的內(nèi)化能力和/或增強(qiáng)的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)。參見(jiàn)Caron等(J.Exp Med.176:1191-1195(1992))以及 Shopes, B.(J.1mmunol.148:2918-2922(1992))。也可以使用如 Wolff 等(CancerResearch53:2560-2565 (1993))中所述的異雙功能交聯(lián)劑來(lái)制備抗腫瘤活性有所增強(qiáng)的同二聚抗體?；蛘?，可以將抗體工程化，所述抗體具有雙重Fe區(qū)，并且從而可以具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和 ADCC 能力。參見(jiàn) Stevenson 等(Ant1-Cancer Drug Design3:219-230 (1989))。另外，已顯示⑶R內(nèi)的序列可能使得抗體與MHC II類(lèi)結(jié)合并且觸發(fā)不希望有的輔助T細(xì)胞反應(yīng)。保守性取代可以允許抗體保持結(jié)合活性但喪失其觸發(fā)不希望有的T細(xì)胞反應(yīng)的能力。還參見(jiàn) Steplewski 等(Proc Natl Acad Sci U S A.85:4852-56 (1998)),所述文獻(xiàn)描述了鼠類(lèi)可變區(qū)與人類(lèi)Y 1、Y 2、Y 3以及Y 4恒定區(qū)接合的嵌合抗體。
[0260]在本公開(kāi)的某些實(shí)施方案中，可能希望使用抗體片段而非完整抗體來(lái)例如增加腫瘤穿透作用。在這種情況下，可能希望修飾抗體片段以便延長(zhǎng)它的血清半衰期，例如將如PEG或其他水溶性聚合物(包括多糖聚合物)的分子添加至抗體片段中以延長(zhǎng)半衰期。這也可以例如通過(guò)將補(bǔ)救受體結(jié)合表位并入到抗體片段中(例如通過(guò)使抗體片段中的適當(dāng)區(qū)域發(fā)生突變或通過(guò)將所述表位并入到肽標(biāo)簽中，然后例如通過(guò)DNA或肽合成使所述肽標(biāo)簽在任一端或在中間與抗體片段融合)來(lái)實(shí)現(xiàn)(參見(jiàn)例如W096/32478)。
[0261]補(bǔ)救受體結(jié)合表位優(yōu)選地構(gòu)成如下的區(qū)域，在所述區(qū)域中來(lái)自Fe結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或兩個(gè)環(huán)的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被轉(zhuǎn)移至抗體片段的類(lèi)似位置上。甚至更優(yōu)選地，來(lái)自Fe結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或兩個(gè)環(huán)的三個(gè)或更多個(gè)殘基被轉(zhuǎn)移。更優(yōu)選的是，表位獲自Fe區(qū)(例如IgG的Fe區(qū))的CH2結(jié)構(gòu)域，并且被轉(zhuǎn)移至抗體的CH1、CH3或VH區(qū)或多于一個(gè)所述區(qū)域中?；蛘?，表位獲自Fe區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域并且被轉(zhuǎn)移至抗體片段的CL區(qū)或VL區(qū)或這兩者中。還參見(jiàn)國(guó)際申請(qǐng)W097/34631和W096/32478，所述國(guó)際申請(qǐng)描述了 Fe變體以及它們與補(bǔ)救受體的相互作用。
[0262]因此，本公開(kāi)的抗體可以包含人類(lèi)Fe部分、人類(lèi)共有Fe部分或其保留與Fe補(bǔ)救受體相互作用的能力的變體，包括如下的變體在內(nèi)，在所述變體中，牽涉到二硫鍵鍵合的半胱氨酸已經(jīng)過(guò)修飾或被去除，和/或在N端上添加了 met，和/或N端的20個(gè)氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)被去除，和/或與補(bǔ)體相互作用的區(qū)域(如Clq結(jié)合位點(diǎn))被去除，和/或ADCC位點(diǎn)被去除[參見(jiàn)例如 Sarmay 等,Molec.1mmunol.29:633-9 (1992)]。
[0263]先前的研究將人類(lèi)和鼠類(lèi)IgG上針對(duì)FcR的結(jié)合位點(diǎn)主要定位于由IgG殘基233-239構(gòu)成的下鉸鏈區(qū)。其他研究提出了另外的廣泛區(qū)段，例如Gly316-Lys338 (針對(duì)人類(lèi)Fe受體I)、Lys274-Arg301和Tyr407_Arg416 (針對(duì)人類(lèi)Fe受體III)，或在下鉸鏈外部發(fā)現(xiàn)幾個(gè)特異性殘基，例如Asn297和Glu318 (對(duì)于與鼠類(lèi)Fe受體II相互作用的鼠類(lèi)IgG2b)。關(guān)于人類(lèi)IgGlFc片段與人類(lèi)Fe受體IIIA的3.2 A晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道將IgGl殘基Leu234-Ser239、Asp265-Glu269、Asn297-Thr299 以及Ala327_Ile332描繪為涉及與Fe受體IIIA的結(jié)合。已經(jīng)基于晶體結(jié)構(gòu)表明，除了下鉸鏈(Leu234-Gly237)之外，IgG CH2結(jié)構(gòu)域環(huán)FG (殘基326-330)和BC (殘基265-271)中的殘基也可能在與Fe受體IIA的結(jié)合中起作用。參見(jiàn)Shields等(J.Biol.Chem.，276:6591-604 (2001))，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。Fe受體結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的殘基的突變可能會(huì)引起效應(yīng)功能發(fā)生改變，如ADCC或CDC活性發(fā)生改變，或半衰期發(fā)生改變。如上文所述，潛在的突變包括一個(gè)或多個(gè)殘基的插入、缺失或取代，包括用丙氨酸取代、保守性取代、非保守性取代或用不同IgG亞類(lèi)中相同位置上的相應(yīng)氨基酸殘基置換(例如將IgGl殘基用該位置上的相應(yīng)IgG2殘基置換)。[0264]Shields等報(bào)道牽涉到與所有人類(lèi)Fe受體結(jié)合的IgGl殘基位于靠近鉸鏈的CH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)并且分為如下兩個(gè)類(lèi)別:1)可以直接與所有FcR相互作用的位置包括Leu234-Pro238、Ala327以及Pro329 (以及可能地Asp265);2)影響碳水化合物性質(zhì)或位置的位置包括Asp265和Asn297。影響與Fe受體II的結(jié)合的另外的IgGl殘基如下:(影響最大)Arg255、Thr256、Glu258、Ser267、Asp270、Glu272、Asp280、Arg292、Ser298 以及(影響較小)His268、Asn276、His285、Asn286、Lys290、Gln295、Arg301、Thr307、Leu309、Asn315、Lys322、Lys326、Pro331、Ser337、Ala339、Ala378 以及 Lys414。A327Q、A327S、P329A、D265A以及D270A減少結(jié)合。除了上文針對(duì)所有FcR所鑒定的殘基之外，使得與Fe受體IIIA的結(jié)合減少40%或更多的另外的IgGl殘基如下:Ser239、Ser267 (僅Gly)、His268、Glu293、Gln295、Tyr296、Arg301、Val303、Lys338 以及 Asp376。提高與 FcRIIIA 的結(jié)合的變體包括T256A、K290A、S298A、E333A、K334A 以及 A339T。Lys414 顯示會(huì)使得與 FcRIIA 和 FcRIIB 的結(jié)合減少40%，Arg416使得與FcRIIA和FcRIIIA的結(jié)合減少30%，Gln419使得與FcRIIA的結(jié)合減少30%并且使得與FcRIIB的結(jié)合減少40%，并且Lys360使得與FcRIIIA的結(jié)合提高 23%。還參見(jiàn) Presta 等(Biochem.Soc.Trans.30:487-490，2001)，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文，描述了在IgGl的Fe區(qū)中存在若干個(gè)如下的位置，所述位置僅提高與特定Fcy受體(R)的結(jié)合，或者同時(shí)提高與一種類(lèi)型的Fe YR的結(jié)合并減少與另一種類(lèi)型的結(jié)合。然后在體外抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)測(cè)定中測(cè)試所選擇的具有提高的與Fe Y RIIIa的結(jié)合的IgGl變體，并且當(dāng)使用外周血單核細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞時(shí)，所述變體顯示出ADCC的增強(qiáng)。
[0265]舉例來(lái)說(shuō)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，194，551 (以引用的方式整體并入本文)描述了效應(yīng)功能發(fā)生改變的變體，所述變體在人類(lèi)IgG Fe區(qū)中在氨基酸位置329、331或322 (使用Kabat編號(hào))上含有突變，所述變體中的一些展示出減少的Clq結(jié)合或降低的CDC活性。作為另一個(gè)實(shí)例，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，737，056 (以引用的方式整體并入本文)描述了效應(yīng)物或Fe Y受體結(jié)合有所改變的變體，所述變體在人類(lèi)IgG Fe區(qū)中在如下氨基酸位置上含有突變:氨基酸位置 238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438 或 439 (使用 Kabat 編號(hào))，所述變體中的一些展示出與ADCC或⑶C活性降低相關(guān)的受體結(jié)合譜。在這些突變中，氨基酸位置238、265、269、270,327或329上的突變被認(rèn)為會(huì)減少與FcRI的結(jié)合，氨基酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438 或 439 上的突變被認(rèn)為會(huì)減少與FcRII的結(jié)合，并且氨基酸位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437上的突變被認(rèn)為會(huì)減少與FcRIII的結(jié)合。
[0266]美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，624，821 (以引用的方式整體并入本文)報(bào)道了鼠類(lèi)抗體的Clq結(jié)合活性可以通過(guò)使重鏈的氨基酸殘基318、320或322突變來(lái)改變，并且置換殘基297(Asn)會(huì)去除溶解活性。
[0267]美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)20040132101 (以引用的方式整體并入本文)描述了在以下氨基酸位置上具有突變的變體:氨基酸位置240、244、245、247、262、263、266、299、313、325、328或332 (使用 Kabat 編號(hào))或位置 234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330 或 332(使用 Kabat 編號(hào))，其中位置 234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330或332上的突變可以降低ADCC活性或減少與Fe Y受
體的結(jié)合。
[0268]Chappel 等(Proc Natl Acad Sci U S A.88:9036-40 (1991))(以引用的方式整體并入本文)報(bào)道了 IgGl的嗜細(xì)胞活性是它的重鏈CH2結(jié)構(gòu)域的固有特性。IgGl的氨基酸殘基234-237中的任一個(gè)上的單個(gè)點(diǎn)突變會(huì)顯著降低或消除它的活性。需要將所有IgGl殘基234-237 (LLGG)均取代于IgG2和IgG4中來(lái)恢復(fù)完全結(jié)合活性。已觀測(cè)到含有整個(gè)ELLGGP序列(殘基233-238)的IgG2抗體比野生型IgGl更具活性。
[0269]Isaacs等(J Immunol.161:3862-9 (1998))(以引用的方式整體并入本文)報(bào)道了對(duì)于Fe Y R結(jié)合至關(guān)重要的基序內(nèi)的突變(谷氨酸233突變成脯氨酸、亮氨酸/苯丙氨酸234突變成纈氨酸，以及亮氨酸235突變成丙氨酸)會(huì)完全阻止靶細(xì)胞的消除。谷氨酸318突變成丙氨酸會(huì)消除小鼠IgG2b的效應(yīng)功能并且還會(huì)降低人類(lèi)IgG4的效力。
[0270]Armour等(Mol Immunol.40:585-93 (2003))(以引用的方式整體并入本文)鑒定出如下的IgGl變體，所述變體與活化性受體Fe Y RIIa反應(yīng)的效率為野生型IgGl的至多1/10，但其與抑制性受體Fe Y RIIb的結(jié)合僅減少至1/4。在氨基酸233-236的區(qū)域中和/或氨基酸位置327、330以及331上產(chǎn)生突變。還參見(jiàn)W099/58572，其以引用的方式整體并入本文。
[0271]Xu等(J Biol Chem.269:3469-74(1994))(以引用的方式整體并入本文)報(bào)道了使IgGlPix)331突變成Ser會(huì)顯著減少Clq結(jié)合并且?guī)缀跸芙饣钚?。相反，在IgG4中用Pro取代Ser331會(huì)賦予Ig G4Pro331變體以部分溶解活性(40%)。
[0272]Schuurman等(Mol Immunol.38:1-8 (2001))(以引用的方式整體并入本文)報(bào)道了使?fàn)可娴街劓滈g鍵形成的鉸鏈半胱氨酸之一 Cys226突變成絲氨酸會(huì)使得重鏈間鍵聯(lián)更穩(wěn)定。使IgG4鉸鏈序列Cys-Pro-Ser-Cys突變成IgGl鉸鏈序列Cys-Pro-Pro-Cys也顯著地使重鏈之間的共價(jià)相互作用穩(wěn)定。
[0273]Angal等(Mol Immunol.30:105-8 (1993))(以引用的方式整體并入本文)報(bào)道了使IgG4中氨基酸位置241上的絲氨酸突變成脯氨酸(存在于IgGl和IgG2中的那個(gè)位置上)會(huì)產(chǎn)生均質(zhì)性抗體，并且與原始嵌合IgG4相比，使血清半衰期延長(zhǎng)并且使組織分布改良。
[0274]共價(jià)修飾
[0275]抗體的共價(jià)修飾也包括在本公開(kāi)的范圍內(nèi)。適當(dāng)時(shí)，它們可以通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)酶促或化學(xué)切割抗體來(lái)制備。通過(guò)使抗體的靶向氨基酸殘基與有機(jī)衍生化劑(能夠與所選側(cè)鏈或者N端或C端殘基反應(yīng))反應(yīng)來(lái)將抗體的其他類(lèi)型的共價(jià)修飾引入分子中。
[0276]最常使半胱氨?；鶜埢cα -鹵代乙酸酯(和相應(yīng)的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)，從而產(chǎn)生羧甲基或羧酰胺基甲基衍生物。還通過(guò)與溴代三氟丙酮、α -溴代-β -(5-咪唑基)丙酸、氯乙?；姿狨ァ-烷基順丁烯二酰亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對(duì)_氯萊苯甲酸酯、2-氯萊基-4-硝基苯酌或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3- 二唑反應(yīng)來(lái)使半胱氨?；鶜埢苌?。
[0277]通過(guò)在PH5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應(yīng)來(lái)使組氨酰基殘基衍生化，這是因?yàn)檫@種試劑對(duì)組氨?；鶄?cè)鏈具有相對(duì)特異性。對(duì)溴苯甲酰甲基溴也是有用的；優(yōu)選地在PH6.0下于0.1M 二甲胂酸鈉中進(jìn)行反應(yīng)。
[0278]使賴(lài)氨?；鶜埢桶被藲埢c琥珀酸酐或其他羧酸酐反應(yīng)。使用這些試劑進(jìn)行衍生化具有反轉(zhuǎn)賴(lài)氨?；鶜埢碾姾傻淖饔?。用于衍生化含α-氨基的殘基的其他適合的試劑包括酰亞胺酯，如甲基吡啶亞胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2，4-戊二酮以及轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸的反應(yīng)。
[0279]通過(guò)與一種或若干種常規(guī)試劑(其中有苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮以及茚三酮)反應(yīng)來(lái)修飾精氨酰基殘基。精氨酸殘基的衍生化因胍官能團(tuán)的PKa較高而需要在堿性條件下進(jìn)行反應(yīng)。此外，可以使這些試劑與賴(lài)氨酸的基團(tuán)以及精氨酸ε-氨基反應(yīng)。
[0280]可以對(duì)酪氨?；鶜埢M(jìn)行特定修飾，其中特別關(guān)注的是，通過(guò)與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應(yīng)將光譜標(biāo)記引入酪氨?；鶜埢?。最通常，分別使用N-乙酰咪唑和四硝基甲烷形成O-乙?；野滨；镔|(zhì)和3-硝基衍生物。使用125I或131I碘化酪氨酰基殘基以制備用于放射性免疫測(cè)定中的標(biāo)記蛋白。
[0281]通過(guò)與碳化二亞胺(R-N.dbd.C.dbd.N-R’)反應(yīng)來(lái)選擇性修飾羧基側(cè)基(天冬氨酰基或谷氛酸基)，其中R和R’是不同的烷基，如1_環(huán)己基_3_(2-嗎琳基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮陽(yáng)離子-4，4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，通過(guò)與銨離子反應(yīng)將天冬氨?；鶜埢凸劝滨；鶜埢D(zhuǎn)化成天冬酰胺酰基殘基和谷氨酰胺?；鶜埢?。
[0282]時(shí)常分別使谷氨酰胺酰基殘基和天冬酰胺?；鶜埢撊ヵ０坊纬上鄳?yīng)的谷氨酰基殘基和天冬氨?；鶜埢Ｔ谥行曰驂A性條件下使這些殘基脫去酰胺基。這些殘基脫去酰胺基的形式屬于本公開(kāi)的范圍內(nèi)。
[0283]其他修飾包括脯氨酸和賴(lài)氨酸的羥基化、絲氨?；蛱K氨酰基殘基的羥基的磷酸化、賴(lài)氨酸、精氨酸以及組氨酸側(cè)鏈的ct -氨基的甲基化(T.E.Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, ff.H.Freeman&C0., San Francisco,第 79-86 頁(yè)(1983))、N端胺的乙?；约叭魏蜟端羧基的酰胺化。
[0284]另一種類(lèi)型的共價(jià)修飾包括使糖苷與抗體進(jìn)行化學(xué)或酶促偶合。這些程序是有利的，因?yàn)樗鼈儾恍枰谌缦碌乃拗骷?xì)胞中產(chǎn)生抗體，所述宿主細(xì)胞具有進(jìn)行N-連接型或O-連接型糖基化的糖基化能力。根據(jù)所使用的偶合方式，可以使一個(gè)或多個(gè)糖連接至(a)精氨酸和組氨酸；(b)游離羧基；(c)游離硫氫基，如半胱氨酸的硫氫基；(d)游離羥基，如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的羥基；(e)芳族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族殘基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法描述于W087/05330以及Aplin和Wriston (CRCCrit.Rev.Biochem.，第 259-306 頁(yè)(1981))中。
[0285]可以通過(guò)化學(xué)方式或酶促方式去除抗體上存在的任何碳水化合物部分。以化學(xué)方式去糖基化需要將抗體暴露于化合物三氟甲烷磺酸或等效的化合物。這種處理會(huì)使得大多數(shù)或所有糖(除連接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外)被切割，同時(shí)保持抗體完整。化學(xué)去糖基化由 Hakimuddin 等(Arch.Biochem.Biophys.259:52 (1987))以及 Edge 等(Anal.Biochem.118:131(1981))描述?？梢酝ㄟ^(guò)使用如 Thotakura 等(Meth.Enzymol.138:350(1987))所述的多種內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶來(lái)對(duì)抗體上的碳水化合物部分進(jìn)行酶促切割。[0286]抗體的另一種類(lèi)型的共價(jià)修飾包括使抗體連接至多種非蛋白質(zhì)聚合物中的一種，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇、聚氧乙基化山梨糖醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油、聚氧化烯烴或多糖聚合物(如葡聚糖)。這些方法是本領(lǐng)域已知的，參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，640，835 ;4，496，689 ;4，301，144 ;4，670，417 ;4，791，192,4, 179，337、4，766，106,4,179，337,4, 495，285,4, 609，546 或 EP315456。
[0287]衍生物
[0288]如上所述的衍生物是指通過(guò)如下的技術(shù)化學(xué)修飾的多肽:泛素化；標(biāo)記(例如使用放射性核素或不同的酶);共價(jià)聚合物連接，如聚乙二醇化(使用聚乙二醇衍生化)；以及通過(guò)化學(xué)合成氨基酸(如鳥(niǎo)氨酸)進(jìn)行插入或取代。本發(fā)明的抗體物質(zhì)的衍生物(如雙特異性抗體)也可用作治療劑并且可以通過(guò)本文的方法產(chǎn)生。
[0289]可以通過(guò)共價(jià)鍵方式或通過(guò)離子鍵、范德華力(van der Waals)或氫鍵將綴合的部分并入抗體物質(zhì)中或連接于抗體物質(zhì)，例如放射性核苷酸或由抗生物素蛋白鏈菌素識(shí)別的生物素化核苷酸的并入。
[0290]可以使聚乙二醇(PEG)與抗體物質(zhì)連接以提供更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。PEG基團(tuán)可以具有任何適宜的分子量并且可以是線性或分枝的。PEG的平均分子量?jī)?yōu)選地在約2千道爾頓(“kD”)至約IOOkDa范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在約5kDa至約50kDa范圍內(nèi)，最優(yōu)選地在約5kDa至約IOkDa范圍內(nèi)。一般通過(guò)PEG部分上的天然或工程化的反應(yīng)性基團(tuán)(例如醛基、氨基、硫醇基或酯基)對(duì)抗體物質(zhì)上的反應(yīng)性基因(例如醛基、氨基或酯基)進(jìn)行?；蜻€原性烷基化來(lái)使PEG基團(tuán)與本公開(kāi)的抗體物質(zhì)連接?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的技術(shù)將PEG部分添加至抗體物質(zhì)中。參見(jiàn)例如國(guó)際公布號(hào)W096/11953和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，179，337。
[0291]通常在水相中使抗體物質(zhì)與PEG進(jìn)行連接并且可以容易地通過(guò)反相分析型HPLC監(jiān)測(cè)。通過(guò)制備型HPLC純化聚乙二醇化的物質(zhì)，并且通過(guò)分析型HPLC、氨基酸分析以及激光解吸質(zhì)譜法進(jìn)行表征。
[0292]抗體綴合物
`[0293]抗體可以它的“裸露”或未綴合的形式施用，或可以與其他治療劑或診斷劑直接綴合，或可以與包含這些其他治療劑或診斷劑的載體聚合物間接綴合。在一些實(shí)施方案中，使抗體與以下各項(xiàng)綴合，細(xì)胞毒性劑如化學(xué)治療劑、藥物、生長(zhǎng)抑制劑、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性綴合物)。適合的化學(xué)治療劑包括:道諾霉素(daunomycin)、亞德里亞霉素(doxorubicin)、甲氨蝶呤以及長(zhǎng)春地辛(vindesine) (Rowland等，(1986)(同上))。適合的毒素包括:細(xì)菌毒素，如白喉毒素；植物毒素，如蓖麻毒素；小分子毒素，如格爾德霉素(geldanamycin) (Mandler等，J.Natl.Cancer Inst.92 (19): 1573-81 (2000) ；Mandler 等，Bioorg.Med.Chem.LetterslO: 1025-1028 (2000) ；Mandler 等，Bioconjugate Chem.13.786-91 (2002))、類(lèi)美登素(maytansinoid) (EP1391213 ；Liu 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:8618-23 (1996))、奧莉絲汀(auristatin) (Doronina 等，Nat.Biotech.21:778-84(2003))以及卡奇霉素(calicheamicin) (Lode 等，Cancer Res.58:2928 (1998) ； Hinman 等，CancerRes.53:3336-3342(1993))。
[0294]可以經(jīng)由使用放射性同位素、親和力標(biāo)記(如生物素、抗生物素蛋白等)、酶促標(biāo)記(如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等)、熒光或發(fā)光或生物發(fā)光標(biāo)記(如FITC或若丹明(rhodamine)等)、順磁性原子等對(duì)抗體進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記。用于實(shí)現(xiàn)這種標(biāo)記的程序是本領(lǐng)域熟知的;例如參見(jiàn) Sternberger, L.A.等，J.Histochem.Cytochem.18:315 (1970)；Bayer, Ε.A.等,Meth.Enzym.62:308(1979) ；Engval, E.等，Immunol.109:129(1972)；Goding, J.ff.J.Tmmunol.Meth.13:215(1976)。
[0295]抗體部分的綴合描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，306，393中。一般技術(shù)還描述于Shih等，Int.J.Cancer41:832-839 (1988) ;Shih 等，Int.J.Cancer46:1101-1106 (1990)；以及Shih等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，057，313中。這種一般方法包括使具有經(jīng)過(guò)氧化的碳水化合物部分的抗體組分與載體聚合物反應(yīng)，所述載體聚合物具有至少一個(gè)游離胺官能團(tuán)并且加載有多種藥物、毒素、螯合劑、硼附加物或其他治療劑。這一反應(yīng)產(chǎn)生初始的希夫堿(Schiff base)(亞胺)鍵聯(lián)，所述鍵聯(lián)可以通過(guò)還原成仲胺以形成最終綴合物來(lái)穩(wěn)定。 [0296]載體聚合物可以是例如氨基葡聚糖或具有至少50個(gè)氨基酸殘基的多肽。用于使藥物或其他藥劑與載體聚合物綴合的不同的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的?？梢允褂枚嚯妮d體而非氨基葡聚糖，但多肽載體應(yīng)當(dāng)在鏈中具有至少50個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選地100-5000個(gè)氨基酸殘基。至少一些氨基酸應(yīng)當(dāng)是賴(lài)氨酸殘基或谷氨酸或天冬氨酸殘基。賴(lài)氨酸殘基的側(cè)位胺以及谷氨酰胺和天冬氨酸的側(cè)位羧酸酯基宜用于連接藥物、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、螯合劑、硼附加物或其他治療劑。適合的多肽載體的實(shí)例包括多聚賴(lài)氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸、其共聚物，以及這些氨基酸與其他氨基酸(例如絲氨酸)的混合聚合物，以賦予所得的已加載的載體和綴合物以所希望的溶解度特性。可以與抗體綴合的藥劑的實(shí)例包括本文所述的細(xì)胞毒性劑或化學(xué)治療劑中的任一種。
[0297]或者，可以通過(guò)將抗體組分與治療劑直接綴合來(lái)制備綴合的抗體。一般程序與間接綴合法類(lèi)似，不同之處在于將治療劑直接連接于經(jīng)過(guò)氧化的抗體組分上。舉例來(lái)說(shuō)，可以使抗體的碳水化合物部分與聚乙二醇連接以延長(zhǎng)半衰期。
[0298]或者，可以通過(guò)形成二硫鍵或使用異雙功能交聯(lián)劑(如N- 丁二酰基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(srop))將治療劑連接在經(jīng)過(guò)還原的抗體組分的鉸鏈區(qū)中。Yu等，Int.J.Cancer56:244(1994)。用于這種綴合的一般技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。參見(jiàn)例如 Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking(CRC Pressl991)；Upeslacis 等,“Modification of Antibodies by Chemical Methods, ”MonoclonalAntibodies:Principles and Applications,Birch 等(編著)，第 187-230 頁(yè)(ffiley-Liss, Inc.1995) ；Price, “Production and Characterization of SyntheticPeptide-Derived Antibodies, ”Monoclonal Antibodies:Production, Engineeringand Clinical Application, Ritter 等(編著)，第 60-84 頁(yè)(Cambridge UniversityPressl995)。多種雙功能蛋白質(zhì)偶合劑是本領(lǐng)域已知的，如N- 丁二酰亞胺基_3_(2_吡啶基二硫代)丙酸酯(srop)、亞氨基硫雜環(huán)戊烷(IT)、酰亞胺酯的雙功能衍生物(如己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(如辛二酸二丁二酰亞胺酯)、醛(如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(如雙(對(duì)-疊氮苯甲?；?己二胺)、雙-重氮基衍生物(如雙-(對(duì)-重氮基苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(如2，6- 二異氰酸甲代亞苯酯)以及雙-活性氟化合物(如1，5- 二氟-2，4- 二硝基苯)。
[0299]抗體融合蛋白
[0300]制備抗體融合蛋白的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，306, 393。包含白細(xì)胞介素-2部分的抗體融合蛋白由以下文獻(xiàn)描述:Boleti等，Ann.0ncol.6:945 (1995)；Nicolet 等，Cancer Gene Ther.2:161 (1995) ；Becker 等，Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA93:7826(1996) ；Hank 等，Clin.Cancer Res.2:1951(1996)；以及 Hu 等，CancerRes.56:4998 (1996)。另外,Yang 等(Hum.Antibodies Hybridomas6:129 (1995))描述了包括F(ab’)2片段和腫瘤壞死因子α部分的融合蛋白。抗體融合蛋白的另外的實(shí)例由Pastan等，Nat.Reviews Cancer6:559-65 (2006)描述。
[0301]制備抗體-毒素融合蛋白的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，在所述抗體-毒素融合蛋白中，重組分子包含一種或多種抗體組分和毒素或化學(xué)治療劑。舉例來(lái)說(shuō)，抗體-假單胞菌(Pseudomonas)外毒素A融合蛋白已由以下文獻(xiàn)描述:Chaudhary 等，Nature339: 394 (1989) ；Brinkmann 等，Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA88:8616 (1991) ;Batra 等，Proc.Nat，I Acad.Sc1.USA89:5867 (1992) ;Friedman 等，J.1mmunol.150:3054(1993) ；ffels 等,Int.J.Can.60:137(1995) ；Fominaya 等,J.Biol.Chem.271:10560(1996) ；Kuan 等,Biochemistry35:2872(1996)；以及 Schmidt 等,Int.J.Can.65:538 (1996)。含有白喉毒素部分的抗體-毒素融合蛋白已由以下文獻(xiàn)描述:Kreitman 等,Leukemia7:553(1993) ；Nicholls 等,J.Biol.Chem.268:5302 (1993)；Thompson 等，J.Biol.Chem.270:28037(1995)；以及 Vallera 等，Blood88:2342 (1996)。Deonarain等，Tumor Targetingl: 177 (1995)已描述了具有核糖核酸酶部分的抗體-毒素融合蛋白，而Linardou等，Cell Biophys.24-25:243 (1994)產(chǎn)生了包含脫氧核糖核酸酶I組分的抗體-毒素融合蛋白。白樹(shù)毒素(gelonin)被用作Wang等，Abstracts of the209thACS National Meeting, Anaheim, Calif.，1995 年4月 2 日-6 日，第 I 部分，B10T005 的抗體-毒素融合蛋白中的毒素部分。作為另一個(gè)實(shí)例，Dohlsten等，Proc.Nat’I Acad.Sc1.USA91:8945 (1994)報(bào)道了包含葡萄球菌腸毒素-A的抗體-毒素融合蛋白。
[0302]適用于制備這些融合蛋白的毒素的實(shí)例是蓖麻毒素、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶1、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹(shù)毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素以及假單胞菌內(nèi)毒素。參見(jiàn)例如Pastan等，Cell47:641 (1986);以及Goldenberg, CA—A Cancer Journal for Clinicians44:43 (1994)。其他適合的毒素是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0303]還可以通過(guò)將抗體與前藥活化酶綴合以將本公開(kāi)的抗體用于ADEPT中，所述前藥活化酶可以將前藥(例如肽基化學(xué)治療劑，參見(jiàn)W081/01145)轉(zhuǎn)化成活性抗癌藥物。參見(jiàn)例如W088/07378和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，975，278。
[0304]可用于ADEPT中的免疫綴合物的酶組分包括任何酶，所述酶能夠以某種方式作用于前藥以將它轉(zhuǎn)化成它的更具活性的細(xì)胞毒性形式。
[0305]可用于本公開(kāi)中的酶包括但不限于:可用于將含磷酸酯前藥轉(zhuǎn)化成游離藥物的堿性磷酸酶；可用于將含硫酸酯前藥轉(zhuǎn)化成游離藥物的芳基硫酸酯酶；可用于將無(wú)毒5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化成抗癌藥物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；可用于將含肽前藥轉(zhuǎn)化成游離藥物的蛋白酶，如沙雷氏菌屬(serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草芽孢桿菌蛋白酶、羧肽酶以及組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L);可用于轉(zhuǎn)化含有D-氨基酸取代基的前藥的D-丙氨酰羧肽酶；可用于將糖基化前藥轉(zhuǎn)化成游離藥物的碳水化合物切割酶，如α-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；可用于將經(jīng)過(guò)β-內(nèi)酰胺衍生化的藥物轉(zhuǎn)化成游離藥物的β-內(nèi)酰胺酶；以及可用于將在胺氮上分別經(jīng)過(guò)苯氧基乙?；虮揭阴；苌乃幬镛D(zhuǎn)化成游離藥物的青霉素(penicillin)酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，具有酶活性的抗體在本領(lǐng)域也被稱(chēng)為抗體酶，可以用于將本公開(kāi)的前藥轉(zhuǎn)化成游離活性藥物(參見(jiàn)例如Massey, Nature328:457-458 (1987))。可以如本文所述制備抗體-抗體酶綴合物以向腫瘤細(xì)胞群體遞送抗體酶。
[0306]可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，如使用上述異雙功能交聯(lián)試劑使上述酶與抗體共價(jià)結(jié)合?；蛘撸梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)(參見(jiàn)例如Neuberger等，Nature312:604-608 (1984))建構(gòu)融合蛋白，所述融合蛋白至少包含本公開(kāi)抗體的抗原結(jié)合區(qū)，所述抗原結(jié)合區(qū)至少連接至本公開(kāi)的酶的具功能活性的部分。
[0307]重組產(chǎn)生抗體
[0308]可以使用常規(guī)程序(例如，通過(guò)使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)分離編碼本公開(kāi)抗體的DNA并且進(jìn)行測(cè)序。這通常需要對(duì)編碼抗體的DNA或優(yōu)選地mRNA (即cDNA)進(jìn)行克隆。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行克隆和測(cè)序，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如像聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(參見(jiàn)例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Guide,第 1-3 卷，Cold Spring Harbor Press ;Ausubel 等，(編著)，Protocolsin Molecular Biology, John Wiley&Sons (1994),以引用的方式并入本文)。
[0309]在使得能夠鑒定在特定條件下可以彼此雜交的多核苷酸的條件下進(jìn)行核苷酸探針?lè)磻?yīng)和其他核苷酸雜交反應(yīng)。一組示例性條件如下:在42°C下于50%甲酰胺，5XSSC，20mM Na.P04, pH6.8中進(jìn)行嚴(yán)格性雜交；以及在55 °C下于I X SSC中洗滌30分鐘。用于計(jì)算等效雜交條件和/或選擇其他條件以實(shí)現(xiàn)所希望的嚴(yán)格性水平的公式是熟知的。在本領(lǐng)域中應(yīng)了解，如 Ausubel 等(編著)，Protocols in Molecular Biology, Johnffiley&Sons(1994),第6.0.3至6.4.10頁(yè)所述，具有等效嚴(yán)格性的條件可以通過(guò)使溫度和緩沖液或鹽濃度發(fā)生變化來(lái)實(shí)現(xiàn)。雜交條件的變更可以憑經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定或基于探針的長(zhǎng)度和鳥(niǎo)嘌呤核苷/胞喃唳(GC)堿基配對(duì)的百分比來(lái)精確地計(jì)算?？梢匀鏢ambrook等(編著)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress: Cold Spring Harbor, New York (1989),第 9.47 至 9.51 頁(yè)中所述來(lái)計(jì)算雜交條件。
[0310]如本文所用的“分離的”核酸分子或“分離的”核酸序列是這樣的核酸分子，所述核酸分子(I)已經(jīng)過(guò)鑒定并且與在所述核酸的天然來(lái)源中通常與它締合的至少一種污染性核酸分子分離，或(2)經(jīng)過(guò)克隆、擴(kuò)增、標(biāo)記或以其他方式與背景核酸相區(qū)分，以使得所關(guān)注的核酸的序列可以被測(cè)定，則被認(rèn)為是分離的。分離的核酸分子與它在自然界中所存在的形式或環(huán)境不同。因此分離的核酸分子與在它存在于天然細(xì)胞中時(shí)的核酸分子是有區(qū)別的。然而，分離的核酸分子包括在通常表達(dá)抗體的細(xì)胞中所含的核酸分子，在所述細(xì)胞中，例如所述核酸分子所處的染色體位置不同于在天然細(xì)胞中所處的染色體位置。
[0311]一種用 于克隆和測(cè)序的RNA的來(lái)源是通過(guò)從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得B細(xì)胞并且使所述B細(xì)胞與永生細(xì)胞融合而產(chǎn)生的雜交瘤。使用雜交瘤的優(yōu)勢(shì)在于可以容易地對(duì)它們進(jìn)行篩選，并且選擇能夠產(chǎn)生所關(guān)注的人類(lèi)單克隆抗體的雜交瘤?；蛘?，可以從接受免疫接種的動(dòng)物的B細(xì)胞(或整個(gè)脾)中分離RNA。當(dāng)使用除雜交瘤以外的來(lái)源時(shí)，可能希望篩選編碼具有特異性結(jié)合特征的免疫球蛋白或免疫球蛋白多肽的序列。一種用于這種篩選的方法是使用噬菌體展示技術(shù)。噬菌體展示進(jìn)一步描述于本文中并且也是本領(lǐng)域熟知的。參見(jiàn)例如Dower等的 W091/17271 ；McCafferty 等的 W092/01047 ；以及 Caton 和 Koprowski (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 87:6450-54(1990))，這些文獻(xiàn)各自以引用的方式并入本文。在使用噬菌體展示技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案中，從接受免疫接種的轉(zhuǎn)基因小鼠分離cDNA (例如總脾cDNA)，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增編碼一部分免疫球蛋白多肽(例如CDR區(qū))的cDNA序列，并且將所擴(kuò)增的序列插入噬菌體載體中。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如淘選)鑒定編碼所關(guān)注的肽(例如具有所需結(jié)合特征的可變區(qū)肽)的cDNA。
[0312]典型地測(cè)定編碼免疫球蛋白多肽的整個(gè)可變區(qū)的序列，然而，有時(shí)僅對(duì)一部分可變區(qū)(例如CDR編碼部分)進(jìn)行測(cè)序就足夠了。典型地，被測(cè)序的部分的長(zhǎng)度是至少30個(gè)堿基，更經(jīng)常將對(duì)編碼至少約1/3或至少約1/2長(zhǎng)度的可變區(qū)的堿基進(jìn)行測(cè)序。[0313]使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見(jiàn)例如Sambrook 等(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryGuide,第 1-3 卷，Cold Spring Harbor Press ；以及 Sanger, F.等(1977) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA74:5463-5467，所述文獻(xiàn)以引用的方式并入本文)進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)將所克隆的核酸的序列與所公布的人類(lèi)免疫球蛋白基因和cDNA序列相比較，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地根據(jù)所測(cè)序的區(qū)域確定:(i)免疫球蛋白多肽(包括重鏈的同種型在內(nèi))的生殖系區(qū)段使用，以及(ii)重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列，包括因N端區(qū)域添加和體細(xì)胞突變過(guò)程而產(chǎn)生的序列。免疫球蛋白基因序列信息的一個(gè)來(lái)源是馬里蘭州貝塞斯達(dá)市(Bethesda，Md)的美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書(shū)館(NationalLibrary of Medicine)的國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)。
[0314]在分離后，可以將DNA放入表達(dá)載體中，然后將所述載體轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞中，所述宿主細(xì)胞如大腸埃希氏菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、人類(lèi)胚腎293細(xì)胞(例如293E細(xì)胞)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以便在重組宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)單克隆抗體的合成?？贵w的重組產(chǎn)生是本領(lǐng)域熟知的。
[0315]表達(dá)控制序列是指在特定的宿主生物體中表達(dá)可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。適合于原核生物的控制序列例如包括啟動(dòng)子，任選地操縱子序列，以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、多聚腺苷酸化信號(hào)以及增強(qiáng)子。
[0316]在使核酸與另一個(gè)核酸序列存在功能關(guān)系時(shí)，它是可操作地連接的。舉例來(lái)說(shuō)，前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA在它被表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白的情況下是與多肽的DNA可操作地連接的；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子在它會(huì)影響序列轉(zhuǎn)錄的情況下是與編碼序列可操作地連接的；或核糖體結(jié)合位點(diǎn)在它經(jīng)過(guò)定位而能夠促成翻譯的情況下是與編碼序列可操作地連接的。一般來(lái)說(shuō)，可操作地連接的意思是所連接的DNA序列是連續(xù)的，并且在分泌前導(dǎo)序列的情況下，是連續(xù)的并且處于閱讀相中。然而，增強(qiáng)子未必是連續(xù)的。通過(guò)在適宜的限制性位點(diǎn)上連接來(lái)實(shí)現(xiàn)連接。如果這些位點(diǎn)不存在，那么根據(jù)常規(guī)慣例使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。
[0317]細(xì)胞、細(xì)胞系以及細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)?？苫Q使用并且所有這些名稱(chēng)在本文中均包括子代。轉(zhuǎn)化體和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞包括原代主體細(xì)胞和由其衍生的培養(yǎng)物而與傳代的次數(shù)無(wú)關(guān)。還應(yīng)了解的是，所有子代可能因有意或無(wú)意的突變而在DNA內(nèi)含物方面并非完全相同。包括篩選出的具有與原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞相同的功能或生物活性的突變型子代在內(nèi)。當(dāng)意圖采用不同的名稱(chēng)時(shí)，可以從上下文中明顯看出。[0318]在一個(gè)替代性實(shí)施方案中，可以通過(guò)直接蛋白質(zhì)測(cè)序來(lái)測(cè)定所關(guān)注的免疫球蛋白的氨基酸序列?？梢愿鶕?jù)通用密碼子表設(shè)計(jì)適合的編碼核苷酸序列。
[0319]可以通過(guò)將適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓氲骄幋aDNA中或通過(guò)肽合成來(lái)制備氨基酸序列變體。這些變體包括例如抗體的氨基酸序列內(nèi)殘基的缺失和/或插入和/或取代。產(chǎn)生缺失、插入以及取代的任何組合以獲得最終構(gòu)建體，條件是最終構(gòu)建體具有所需的特征。氨基酸的變化也可能會(huì)改變分子的翻譯后加工，如使糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置發(fā)生變化。
[0320]通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法制備編碼抗體的氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括但不限于:從天然來(lái)源中分離(在天然存在的氨基酸序列變體的情況下)或通過(guò)對(duì)抗體的早期制備的變體或非變體形式進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變以及盒式誘變來(lái)制備。
[0321]本公開(kāi)還提供了編碼本公開(kāi)抗體的分離的核酸，所述核酸任選地與由宿主細(xì)胞識(shí)別的控制序列可操作地連接；包含所述核酸的載體和宿主細(xì)胞；以及用于產(chǎn)生所述抗體的重組技術(shù)，所述技術(shù)可以包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞以使得核酸表達(dá)以及任選地，從宿主細(xì)胞培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中回收所述抗體。用于產(chǎn)生抗體的不同系統(tǒng)和方法由Birch和Racher (Adv.Drug Deliv.Rev.671-685 (2006))進(jìn)行綜述。
[0322]為了重組產(chǎn)生抗體，分離編碼其的核酸，并且將所述核酸插入可復(fù)制載體中以進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或以進(jìn)行表達(dá)。能夠容易地使用常規(guī)程序(例如，通過(guò)使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)分離編碼單克隆抗體的DNA并且進(jìn)行測(cè)序。許多載體是可供使用的。載體組分一般包括但不限于以下一個(gè)或多個(gè):信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄終止序列。
[0323](I)信號(hào)序列組分
[0324]本公開(kāi)的抗體不僅可以直接重組產(chǎn)生，還可以與異源多肽的融合多肽形式重組產(chǎn)生，所述異源多肽優(yōu)選地是信號(hào)序列或在成熟蛋白質(zhì)或多肽的N端上具有特異性切割位點(diǎn)的其他多肽。所選的信號(hào)序列優(yōu)選地是可以由宿主細(xì)胞識(shí)別和加工(即通過(guò)信號(hào)肽酶切割)的信號(hào)序列。如果原核宿主細(xì)胞不識(shí)別和加工天然抗體信號(hào)序列，那么可以將所述信號(hào)序列用從由例如以下各項(xiàng)組成的群組中選出的信號(hào)序列取代:果膠酸裂解酶(例如pelB)、堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩(wěn)定性腸毒素II前導(dǎo)序列。對(duì)于酵母分泌，可以將天然信號(hào)序列用以下各項(xiàng)取代:例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、α因子前導(dǎo)序列(包括酵母菌屬(Saccharomyces)和克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的α -因子前導(dǎo)序列)或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列，或W090/13646中所述的信號(hào)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌前導(dǎo)序列(例如單純皰疹gD信號(hào))是可供使用的。
[0325]這種前體區(qū)的DNA與編碼抗體的DNA在閱讀框內(nèi)連接。
[0326](2)復(fù)制起點(diǎn)組分
[0327]表達(dá)載體和克隆載體均含有使載體能夠在一種或多種所選宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的核酸序列。一般來(lái)說(shuō)，在克隆載體中，這種序列是使載體能夠獨(dú)立于宿主染色體DNA而進(jìn)行復(fù)制的序列，并且包括復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。對(duì)于多種細(xì)菌、酵母以及病毒而言，這些序列是熟知的。來(lái)自質(zhì)粒PBR322的復(fù)制起點(diǎn)適用于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2 μ質(zhì)粒起點(diǎn)適用于酵母，并且不同的病毒起點(diǎn)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。一般來(lái)說(shuō)，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)組分(典型地可以使用SV40起點(diǎn)，這只是因?yàn)樗性缙趩?dòng)子)。 [0328](3)選擇標(biāo)記組分
[0329]表達(dá)載體和克隆載體可以含有選擇基因，也被稱(chēng)為選擇標(biāo)記。典型的選擇基因編碼如下的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)(a)賦予對(duì)抗生素或其他毒素的抗性，所述抗生素或其他毒素例如氨比西林(ampicillin)、新霉素(neomycin)、甲氨蝶呤、四環(huán)素(tetracycline)、G418、遺傳霉素(geneticin)、組氨醇或霉酹酸(mycophenolic acid) ； (b)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷型缺乏；或(c)提供不可獲自復(fù)合培養(yǎng)基的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)素，例如編碼用于芽孢桿菌屬(Bacilli)的D-丙氨酸消旋酶的基因。
[0330]選擇方案的一個(gè)實(shí)例利用藥物來(lái)使宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯。那些經(jīng)過(guò)異源基因成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生賦予抗藥性的蛋白質(zhì)并且因此能夠在所述選擇方案下存活。這種顯性選擇的實(shí)例使用如下藥物:甲氨蝶呤、新霉素、組氨醇、嘌呤霉素(puromycin)、霉酚酸以及潮霉素(hygromycin)o
[0331]適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)記的另外的實(shí)例是能夠鑒定對(duì)于吸收抗體編碼核酸呈感受態(tài)的細(xì)胞的那些標(biāo)記，如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-1和金屬硫蛋白-1I，優(yōu)選地靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶等。
[0332]舉例來(lái)說(shuō)，首先通過(guò)將所有轉(zhuǎn)化體在含有甲氨蝶呤(Mtx) (DHFR的一種競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以對(duì)經(jīng)過(guò)DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。在使用野生型DHFR時(shí)，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是DHFR活性缺陷型中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。
[0333]或者，經(jīng)過(guò)編碼本公開(kāi)抗體、野生型DHFR蛋白以及另一種選擇標(biāo)記(如氨基糖苷3’ -磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH))的DNA序列轉(zhuǎn)化或共同轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(特別是含有內(nèi)源性DHFR的野生型宿主)可以通過(guò)在含有針對(duì)選擇標(biāo)記的選擇劑(如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素(kanamycin)、新霉素或G418)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)選擇。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，965，199。
[0334]適用于酵母的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trpl基因(Stinchcomb等，Nature，282:39 (1979))。所述trpl基因提供了用于不能夠在色氨酸中生長(zhǎng)的酵母突變株(例如 ATCC 號(hào) 44076 或 PEP4-1)的選擇標(biāo)記。Jones (Genetics85:12 (1977))。酵母宿主細(xì)胞基因組中trpl損害的存在則提供了通過(guò)在不存在色氨酸的情況下進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類(lèi)似地，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC20，622或38，626)由帶有Leu2基因的已知質(zhì)粒補(bǔ)充。Ura3缺陷型酵母菌株由帶有ura3基因的質(zhì)粒補(bǔ)充。
[0335]另外，源自于1.6 μ m環(huán)狀質(zhì)粒pKDl的載體可以用于對(duì)克魯維酵母屬酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化?；蛘?，Van den Berg (Bio/Technology, 8:135 (1990))報(bào)道了一種用于在乳酸克魯維酵母(K.1actis)中大規(guī)模生產(chǎn)重組小牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)。還已經(jīng)公開(kāi)了用于使克魯維酵母屬的工業(yè)菌株分泌成熟重組人血清白蛋白的穩(wěn)定多拷貝表達(dá)載體(Fleer等，Bio/Technology, 9:968-975(1991))。
[0336](4)啟動(dòng)子組分
[0337]表達(dá)載體和克隆載體通常含有由宿主生物體識(shí)別并且與抗體編碼核酸可操作地連接的啟動(dòng)子。適于與原核宿主一起使用的啟動(dòng)子包括阿拉伯糖(例如araB)啟動(dòng)子phoA啟動(dòng)子、β -內(nèi)酰胺酶以及乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)以及雜合啟動(dòng)子(如tac啟動(dòng)子)。然而，其他已知的細(xì)菌啟動(dòng)子也是適合的。用于細(xì)菌系統(tǒng)中的啟動(dòng)子還將含有與編碼本公開(kāi)抗體的DNA可操作地連接的Shine-Dalgarno (S.D.)序列。[0338]用于真核生物的啟動(dòng)子序列是已知的。幾乎所有的真核生物基因皆具有富含AT的區(qū)域，所述區(qū)域位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約25至30個(gè)堿基處。存在于許多基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游70至80個(gè)堿基處的另一個(gè)序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核生物基因的3’端處是AATAAA序列，所述序列可能是向編碼序列的3’端添加多聚腺苷酸尾的信號(hào)。所有這些序列皆適于插入到真核表達(dá)載體中。
[0339]適于與酵母宿主一起使用的啟動(dòng)序列的實(shí)例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶(如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶以及葡糖激酶)的啟動(dòng)子。
[0340]作為另外的優(yōu)勢(shì)在于轉(zhuǎn)錄受到生長(zhǎng)條件控制的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的其他酵母啟動(dòng)子是以下各項(xiàng)的啟動(dòng)子區(qū)域:醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C (isocytochrome C)、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。適用于酵母表達(dá)的載體和啟動(dòng)子進(jìn)一步描述于EP73，657中。酵母增強(qiáng)子也可以有利地與酵母啟動(dòng)子一起使用。
[0341]在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中從載體對(duì)抗體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄例如受到以下各項(xiàng)的控制:從病毒基因組中獲得的啟動(dòng)子，所述病毒如艾貝爾森白血病病毒(Abelson leukemia virus)、多瘤病毒、禽 痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、鳥(niǎo)類(lèi)肉瘤病毒，最優(yōu)選地，巨細(xì)胞病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40 (SV40);從異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子獲得的啟動(dòng)子，例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子；從熱激啟動(dòng)子獲得的啟動(dòng)子，條件是這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
[0342]SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可以方便地以還含有SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)的SV40限制性片段的形式獲得。人類(lèi)巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子可以方便地以HindIII E限制性片段的形式獲得。在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，419，446中公開(kāi)了一種在哺乳動(dòng)物宿主中使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體來(lái)表達(dá)DNA的系統(tǒng)。這種系統(tǒng)的一種改進(jìn)形式描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，601，978中。關(guān)于在小鼠細(xì)胞中在來(lái)自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子的控制下表達(dá)人類(lèi)β-干擾素cDNA，還參見(jiàn)Reyes等，Nature297:598-601 (1982)。或者，可以使用勞斯氏肉瘤病毒(rous sarcoma virus)的長(zhǎng)末端重復(fù)序列作為啟動(dòng)子。
[0343](5)增強(qiáng)子元件組分
[0344]經(jīng)常通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入到載體中來(lái)增強(qiáng)高等真核生物對(duì)編碼本公開(kāi)抗體的DNA的轉(zhuǎn)錄。已知來(lái)自哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白以及胰島素)的許多增強(qiáng)子序列。然而，典型地將使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括位于復(fù)制起點(diǎn)下游(late side)的SV40增強(qiáng)子(bpl00_270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)下游的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子。關(guān)于活化真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件，還參見(jiàn)Yaniv, Nature297:17-18 (1982).增強(qiáng)子可以在抗體編碼序列的5’端或3’端的位置上剪接至載體中，但優(yōu)選地位于啟動(dòng)子的5’端位點(diǎn)上。
[0345](6)轉(zhuǎn)錄終止組分
[0346]用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人類(lèi)細(xì)胞或來(lái)自其他多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)中的表達(dá)載體還將含有終止轉(zhuǎn)錄和使mRNA穩(wěn)定所需的序列。這些序列通常可獲自真核生物或病毒DNA或cDNA的5’端和有時(shí)3’端非翻譯區(qū)。這些區(qū)域含有被轉(zhuǎn)錄成編碼抗體的mRNA的非翻譯部分中的多聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止組分是牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸化區(qū)域。參見(jiàn)W094/11026和其中所公開(kāi)的表達(dá)載體。另一種是小鼠免疫球蛋白輕鏈轉(zhuǎn)錄終止子。
[0347](7)對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇和轉(zhuǎn)化
[0348]適用于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的宿主細(xì)胞是上述原核生物、酵母或高等真核生物細(xì)胞。適用于這一目的的原核生物包括真細(xì)菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物體，例如腸桿菌科(Enterobacteriaceae),如埃希氏菌屬(Escherichia),例如大腸埃希氏菌；腸桿菌屬(Enterobacter);歐文氏菌屬(Erwinia);克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)；變形桿菌屬(Proteus);沙門(mén)氏菌屬(Salmonella),例如鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium);沙雷氏菌屬(Serratia),例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans);和志賀菌屬(Shigella);以及芽孢桿菌屬，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽胞桿菌(B.1icheniformis)(例如公開(kāi)于1989年4月12日公布的DD266, 710中的地衣芽胞桿菌41P);假單胞菌屬(Pseudomonas),如綠膿假單胞菌(P.aeruginosa);和鏈霉菌屬(Streptomyces)。一種優(yōu)選的大腸埃希氏菌克隆宿主是大腸埃希氏菌294 (ATCC31, 446),但是其他菌株，如大腸埃希氏菌B、大腸埃希氏菌X1776 (ATCC31，537)以及大腸埃希氏菌W3110 (ATCC27，325)也是適合的。這些實(shí)例是說(shuō)明性的而非限制性的。
[0349]除了原核生物外，真核微生物(如絲狀真菌或酵母)也是適用于抗體編碼載體的克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母(baker’s yeast)是在低等真核宿主微生物中最常使用的。然而，許多其他屬、種以及株系也是通?？晒┦褂玫牟⑶铱捎糜诒疚闹校缢诰屏阎辰湍?Schizosaccharomyces pombe);克魯維酵母屬宿主，例如像乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC12，424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus) (ATCC16, 045)、魏氏克魯維酵母(K.wickeramii) (ATCC24, 178)、克魯雄酵母(K.waltii) (ATCC56, 500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum) (ATCC36, 906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)以及馬克斯克魯維酵母(K.marxianus);耶氏酵母(yarrowia)(EP402, 226);畢赤氏酵母(Pichia pastors)(EP183, 070);念珠菌屬(Candida);里氏木霉(Trichoderma reesia) (EP244, 234);粗糖鏈抱霉(Neurospora crassa);許旺酵母屬(Schwanniomyces),如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及絲狀真菌，例如像鏈孢霉屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)和曲霉屬(Aspergillus)宿主,如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
[0350]適用于表達(dá)糖基化抗體的宿主細(xì)胞源自于多細(xì)胞生物體。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。來(lái)自宿主(如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲(chóng))、埃及斑蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蜆(Drosophilamelanogaster)(果蜆)以及家蠶(Bombyx mori))的許多桿狀病毒株和變體以及相應(yīng)的允許的昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞已 經(jīng)被鑒定。用于轉(zhuǎn)染的多種病毒株是公共可獲得的，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)的L-1變體NPV和家香的Bm_5株NPV,并且這些病毒可以在本文中用作根據(jù)本公開(kāi)的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞。
[0351]棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、牽?；ā⒎?、煙草、浮萍以及其他植物細(xì)胞的植物細(xì)胞培養(yǎng)物還可以用作宿主。[0352]有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，包括CHOKl細(xì)胞(ATCCCCL61)、DXB-ll、DG-44 以及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 /-DHFR (CHO, Urlaub 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77:4216 (1980));經(jīng)過(guò) SV40 轉(zhuǎn)化的猴腎 CVl 細(xì)胞系(C0S-7，ATCC CRL1651)；人類(lèi)胚腎細(xì)胞系(經(jīng)過(guò)亞克隆而以懸浮培養(yǎng)方式培養(yǎng)的293或293細(xì)胞(Graham等，J.Gen Virol.36:59, 1977);幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL10);小鼠塞爾托利細(xì)胞(TM4，Mather (Biol.Reprod.23:243-251，1980));猴腎細(xì)胞(CV1ATCC CCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76，ATCC CRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL2);犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCCCCL34);布法羅大鼠肝細(xì)胞(buffalo rat liver cell) (BRL3A, ATCC CRL1442);人肺細(xì)胞(W138,ATCC CCL75);人肝細(xì)胞(H印 G2，HB8065);小鼠乳腺腫瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI 細(xì)胞(Mather 等，Annals N.Y Acad.Sc1.383:44-68 (1982) )；MRC5 細(xì)胞；FS4 細(xì)胞；以及人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系(ifep G2)。
[0353]使用上述用于抗體產(chǎn)生的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，并且將所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)于在適當(dāng)時(shí)經(jīng)過(guò)改良的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化體，或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。另外，通過(guò)選擇標(biāo)記分離的具有轉(zhuǎn)錄單位的多個(gè)拷貝的新型載體和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系對(duì)于表達(dá)結(jié)合靶標(biāo)的抗體是特別有用的和優(yōu)選的。 [0354](8)培養(yǎng)宿主細(xì)胞
[0355]可以將用于產(chǎn)生本公開(kāi)抗體的宿主細(xì)胞培養(yǎng)在多種培養(yǎng)基中?？缮藤?gòu)獲得的培養(yǎng)基，如漢姆氏 FlO(Ham’s F10)(Sigma)、最低必需培養(yǎng)基(MEM)(Sigma)、RPMI_1640(Sigma)以及杜氏改良伊格氏培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM, Sigma)適用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，以下文獻(xiàn)中所述的任何培養(yǎng)基也可以用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基:Ham 等(Meth.Enz.58:44, 1979) ；Barnes 等,Anal.Biochem.102:255 (1980);美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，767，704 ;4，657，866 ;4，927，762 ;4，560，655 ；或 5，122，469 ；W090103430 ；W087/00195 ；或美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)30，985。這些培養(yǎng)基中的任一種可以根據(jù)需要用以下各項(xiàng)補(bǔ)充:激素和/或其他生長(zhǎng)因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽以及磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如慶大霉素(gentamicin)藥物)、痕量元素(定義為通常以微克分子范圍內(nèi)的最終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)以及葡萄糖或等效的能量來(lái)源。還可以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)濃度包括任何其他的必需補(bǔ)充劑。培養(yǎng)條件，如溫度、PH值等是先前與被選用于表達(dá)的宿主細(xì)胞一起使用的培養(yǎng)條件，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
[0356](9)抗體純化
[0357]當(dāng)使用重組技術(shù)時(shí)，抗體可以在細(xì)胞內(nèi)，在周質(zhì)間隙中產(chǎn)生，或直接被分泌到培養(yǎng)基中，包括從微生物培養(yǎng)物分泌在內(nèi)。如果抗體在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，那么作為第一步驟，例如通過(guò)離心或超濾去除微粒碎片(是宿主細(xì)胞或溶解的碎片)。Better等，Science240:1041-43，1988 ;ICSU Short ReportslO:105(1990)；以及 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:457-461 (1993)描述了用于分離被分泌至大腸埃希氏菌的周質(zhì)間隙中的抗體的程序[還參見(jiàn) Carter 等,Bio/Techno logy 10:163-167 (1992)]。
[0358]可以使用例如羥磷灰石色譜法、陽(yáng)離子或陰離子交換色譜法以及親和色譜法來(lái)純化由微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備的抗體組合物，其中親和色譜法是優(yōu)選的純化技術(shù)。蛋白質(zhì)A作為親和配體的適合性取決于存在于抗體中的任何免疫球蛋白Fe結(jié)構(gòu)域的種類(lèi)和同種型?？梢允褂玫鞍踪|(zhì)A純化基于人類(lèi)Y 1、gamma2或Y 4重鏈的抗體(Lindmark等，J.1mmunol.Meth.62:1-13, 1983)。蛋白質(zhì)G被推薦用于所有小鼠同種型和用于人類(lèi)Y 3(Guss等，EMBO J.5:15671575(1986))。與親和配體連接的基質(zhì)最經(jīng)常是瓊脂糖，但其他基質(zhì)也是可供使用的。與可以使用瓊脂糖實(shí)現(xiàn)的流速和處理時(shí)間相比，機(jī)械上穩(wěn)定的基質(zhì)(如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)使得流速更快并且使得處理時(shí)間更短。當(dāng)抗體包含CH3結(jié)構(gòu)域時(shí)，Bakerbond ABX?樹(shù)脂(J.T.Baker, Phillipsburg, N.J.)可用于純化。用于蛋白質(zhì)純化的其他技術(shù)，如在離子交換柱上進(jìn)行的分級(jí)分離、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上進(jìn)行的色譜法、在肝素SHPl IAUO^l:1v上進(jìn)行的色譜法、在陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(如多聚天冬氨酸柱)上進(jìn)行的色譜法、色譜聚焦、SDS-PAGE以及硫酸銨沉淀也是可供使用的，這取決于有待回收的抗體。
[0359]篩選方法
[0360]有效治療劑取決于對(duì)缺少顯著毒性的有效藥劑進(jìn)行鑒定?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的方法針對(duì)結(jié)合親和力對(duì)抗體進(jìn)行篩選。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用凝膠阻滯測(cè)定法、蛋白質(zhì)印跡法、放射性標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法、通過(guò)色譜法進(jìn)行的共同分級(jí)分離、共同沉淀、交聯(lián)、ELISA 等，以上各項(xiàng)描述于例如 Current Protocols in Molecular Biology (1999) Johnffiley&Sons, NY中，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。
[0361]在本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方案中，篩選調(diào)節(jié)靶標(biāo)抗原活性的抗體的方法包括使測(cè)試抗體與靶標(biāo)多肽接觸以及測(cè)定抗體與靶標(biāo)配體之間的復(fù)合體的存在。在這些測(cè)定法中，典型地對(duì)配體進(jìn)行標(biāo)記。在適當(dāng)?shù)姆跤螅瑢⒂坞x的配體與以結(jié)合形式存在的配體分離，并且游離或未復(fù)合的標(biāo)記的量是特定抗體結(jié)合靶標(biāo)配體的能力的量度。
[0362]在本公開(kāi)的另一個(gè)實(shí)施方案中，針對(duì)對(duì)于靶標(biāo)多肽具有適合的結(jié)合親和力的抗體片段或CDR使用高通量篩選。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在固體基質(zhì)上合成大量不同的小肽測(cè)試化合物。使肽測(cè)試抗體與靶標(biāo)多肽接觸并且進(jìn)行洗滌。然后通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法檢測(cè)結(jié)合的多肽。也可以將本公開(kāi)的經(jīng)過(guò)純化的抗體直接涂于用于上述藥物篩選技術(shù)中的培養(yǎng)板上。另外，可以使用非中和抗體來(lái)捕捉靶標(biāo)并且將它固定于固體支撐物上。
[0363]用于評(píng)估抗TGFP抗體對(duì)TGFP的生物活性的中和作用的方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利7，867，496。體外生物測(cè)定法的實(shí)例包括:(I)在軟瓊脂中在EGF存在下誘導(dǎo)NRK細(xì)胞的群落形成(Roberts等(1981) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 78:5339-5343) ； (2)誘導(dǎo)原始間葉細(xì)胞分化以表達(dá)軟骨表型(Seyedin等(1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82:2267-2271) ； (3)抑制 MvlLu 紹肺上皮細(xì)胞(Danielpour 等(1989) J.Cell.Physiol.，138:79-86)和 BBC-1 猴腎細(xì)胞(Holley 等(1980)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 77:5989-5992)生長(zhǎng)；(4)抑制C3H/HeJ小鼠胸腺細(xì)胞的有絲分裂發(fā)生(Wrann 等(1987)EMBO J., 6:1633-1636) ； (5)抑制大鼠 L6 成肌細(xì)胞分化(Florini 等(1986) J.Biol.Chem.，261:16509-16513) ； (6)測(cè)量纖維連接蛋白的產(chǎn)生(Wrana 等(1992)Cell, 71:1003-1014); (7)誘導(dǎo)與熒光素酶報(bào)告基因融合的纖溶酶原激活物抑制劑I(PA1-1)啟動(dòng)子(Abe 等(1994)Anal.Biochem., 216:276-284) ； (8)夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Danielpour 等(1989) Growth Factors, 2:61-71);以及(9) Singh 等(2003) Bioorg.Med.Chem.Lett.，13(24):4355-4359 中所述的細(xì)胞測(cè)定法。
[0364]在一些實(shí)施方案中，抗體中和TGF β I和TGF β 2的效力是中和TGF β 3的效力的至少2至50倍、10至100倍、2倍、5倍、10倍、25倍、50倍或100倍，或比中和TGFP 3的效力大 20% 至 50%、50% 至 100%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。
[0365]用于評(píng)估TGF β的生物活性和對(duì)TGF β的中和作用(例如TGF β抗體)的另外的方法提供于實(shí)施例中。舉例來(lái)說(shuō)，中和作用可以通過(guò)中和測(cè)定法來(lái)測(cè)量并且表示為IC50值?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)定分子對(duì)第二分子或細(xì)胞活性的最大生物反應(yīng)引出半數(shù)抑制作用所需的濃度來(lái)計(jì)算給定分子的IC50值。IC50越低，則分子抑制所需蛋白質(zhì)活性的效力越大。本文所涵蓋的示例性中和測(cè)定法包括但不限于白細(xì)胞介素-11釋放測(cè)定法和HT-2/IL-4細(xì)胞增殖測(cè)定法。另外，可以進(jìn)行TGFii活性測(cè)定法以確定所述抗體是否優(yōu)先地抑制一種TGFii亞型，包括pSMAD磷酸化測(cè)定法或rhLAP結(jié)合測(cè)定法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相較于對(duì)TGF β 3的IC50，所述抗體對(duì)TGFP I和TGF β 2的IC50更低(即結(jié)合更佳、效力更大)。
[0366]組合療法
[0367]在一個(gè)實(shí)施方案中，將本公開(kāi)的抗體與可用于治療如本文所述的疾病或病癥的第二藥劑一起施用。如果鑒定出超過(guò)一種有效結(jié)合靶標(biāo)抗原的抗體，那么預(yù)期可以將針對(duì)靶標(biāo)抗原的不同表位和/或優(yōu)先地結(jié)合TGFii的不同亞型的兩種或更多種抗體混合以使得抗體共同的組合使針對(duì)與靶標(biāo)多肽相關(guān)的病狀或病癥的功效得到進(jìn)一步提高。包含一種或多種本發(fā)明抗體的組合物可以向患有或易患有待治療的與靶標(biāo)多肽相關(guān)的病狀或病癥的人或哺乳動(dòng)物施用。
[0368]并行地施用兩種治療劑不需要同時(shí)或通過(guò)相同的途徑施用所述藥劑，只要所述藥劑發(fā)揮它們的治療作用的時(shí)間段上存在重疊即可。涵蓋了同時(shí)或依序施用，也涵蓋了在不同天或不同周施用。
[0369]第二藥劑可以是其他治療劑，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、針對(duì)其他靶標(biāo)抗原的抗體、抗炎劑、抗凝劑、抑制細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的藥劑、將降低或減小血壓的藥劑、將減少膽固醇、甘油三酯、LDL、VLDL或脂蛋白(a)或增加HDL的藥劑、將增加或降低膽固醇調(diào)節(jié)蛋白水平的藥劑、抗贅生藥物或分子。對(duì)于患有過(guò)度增殖性病癥(如癌癥或腫瘤)的患者，還涵蓋了與第二治療手段(如放射療法、化學(xué)療法、光動(dòng)力學(xué)療法或手術(shù))的組合。
[0370]預(yù)期本公開(kāi)的抗體與第二藥劑可以同時(shí)在相同的制劑中給予。進(jìn)一步預(yù)期，所述藥劑在單獨(dú)的制劑中施用并且并行地施用，其中并行地是指在彼此相隔30分鐘之內(nèi)給予藥劑。
[0371]在另一個(gè)方面，在施用抗體組合物之前施用第二藥劑。在施用之前指的是在使用抗體治療前一周至在施用抗體前30分鐘的時(shí)間范圍內(nèi)施用第二藥劑。進(jìn)一步預(yù)期，在施用抗體組合物之后施用第二藥劑。在施用后意指描述了在抗體治療后30分鐘至在抗體施用后一周的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行施用。
[0372]進(jìn)一步預(yù)期，在適當(dāng)時(shí)可以施用其他輔助療法。舉例來(lái)說(shuō)，在適當(dāng)時(shí)還可以向患者施用細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白、手術(shù)療法、化學(xué)療法、細(xì)胞毒性劑或放射療法。
[0373]進(jìn)一步預(yù)期，在將抗體與第二藥劑組合施用時(shí)，例如像其中第二藥劑是細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子或化學(xué)治療劑，施用還包括了使用放射治療劑或放射療法。與抗體組合物組合施用的放射療法如由治療醫(yī)師所決定并且以典型地給予針對(duì)癌癥接受治療的患者的劑量加以施用。
[0374]細(xì)胞毒性劑是指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或?qū)?xì)胞造成破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意圖包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90以及Rel86)、化學(xué)治療劑以及毒素，如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶活性毒素或合成毒素，或其片段。非細(xì)胞毒性劑是指不抑制或阻止細(xì)胞功能和/或不對(duì)細(xì)胞造成破壞的物質(zhì)。非細(xì)胞毒性劑可以包括可以經(jīng)過(guò)活化而具有細(xì)胞毒性的藥劑。非細(xì)胞毒性劑可以包括珠粒、脂質(zhì)體、基質(zhì)或粒子(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公布2003/0028071和2003/0032995，以引用的方式并入本文)。這些藥劑可以與根據(jù)本公開(kāi)的抗體綴合、偶合、連接或締合。
[0375]所涵蓋的用于與本公開(kāi)的抗體一起使用的化學(xué)治療劑包括但不限于表1中所列的那些:
[0376]表1
【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF β ) K TGF^ 2以及TGF β 3的抗體，所述抗體包含: (a)表1或SEQID NO: 13、19以及25中所示出的重鏈CDRl氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體； (b)表1或SEQID NO: 14、20以及26中所示出的來(lái)自于與(a)相同的重鏈可變區(qū)的重鏈CDR2氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體；以及 (c)表1或SEQID NO: 15、21以及27中所示出的來(lái)自于與(a)相同的重鏈可變區(qū)的重鏈CDR3氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體。
2.一種結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGFβ ) l、TGFi3 2以及TGFβ 3的抗體，所述抗體包含: (a)表1或SEQID NO: 13、19以及25中所示出的重鏈⑶Rl氨基酸序列，或其與其具有至少70%同一性的變體； (b)表1或SEQID NO: 14,20以及26中所示出的來(lái)自于與(a)相同的重鏈可變區(qū)的重鏈CDR2氨基酸序列，或其與其具有至少70%同一性的變體；以及 (c)表1或SEQID NO:15、21以及27中所示出的來(lái)自于與(a)相同的重鏈可變區(qū)的重鏈CDR3氨基酸序列，或其與其具有至少70%同一性的變體。
3.一種結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGFβ ) l、TGFi3 2以及TGFβ 3的抗體，所述抗體包含: (a)表1或SEQID NO: 13、19以及25中所示出的重鏈⑶Rl氨基酸序列，或其與其具有至少70%同一性的變體； (b)表1或SEQID NO:` 14,20以及26中所示出的經(jīng)過(guò)獨(dú)立選擇的重鏈⑶R2氨基酸序列，或其與其具有至少70%同一性的變體；以及 (c)表1或SEQID NO: 15,21以及27中所示出的經(jīng)過(guò)獨(dú)立選擇的重鏈⑶R3氨基酸序列，或其與其具有至少70%同一性的變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述重鏈⑶R1、⑶R2或⑶R3氨基酸序列中的至少兩個(gè)示出于表1或SEQ ID NO: 13-15,19-21以及25-27中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述重鏈⑶R1、⑶R2以及⑶R3氨基酸序列中的三個(gè)示出于表1或SEQ ID NO: 13-15,19-21以及25-27中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體包含與表1或SEQID NO:2、6以及10中所示出的重鏈可變區(qū)氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體包含與表1或SEQID NO:2、6以及10中所示出的重鏈可變區(qū)氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體包含氨基酸序列與重鏈可變區(qū)中的所有三個(gè)HCDR具有至少70%同一性的多肽序列，HCDRl、HCDR2以及HCDR3的氨基酸序列示出于 SEQ ID NO: 13-15、19-21 以及 25-27 中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的抗體，其中一個(gè)或多個(gè)重鏈框架氨基酸已被另一個(gè)人類(lèi)抗體氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)氨基酸置換。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體進(jìn)一步包含表1或SEQIDNO: 16-18,22-24以及28-30中所示出的輕鏈CDR氨基酸序列中的任一個(gè)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體包含表1或SEQIDNO: 16-18,22-24以及28-30中所示出的所述輕鏈⑶R氨基酸序列中的至少兩個(gè)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體包含表1或SEQIDNO: 16-18,22-24以及28-30中所示出的所述輕鏈⑶R氨基酸序列中的至少三個(gè)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體包含: (a)表1或SEQID NO: 16、22以及28中所示出的輕鏈⑶Rl氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體； (b)表1或SEQID NO: 17、23以及29中所示出的來(lái)自于與(a)相同的輕鏈可變區(qū)的輕鏈CDR2氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體；以及 (c)表1或SEQID NO: 18、24以及30中所示出的來(lái)自于與(a)相同的輕鏈可變區(qū)的輕鏈CDR3氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體包含: (a)表1或SEQID NO: 16,22以及28中所示出的輕鏈⑶Rl氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體； (b)表1或SEQID NO: 17,23以及29中所示出的經(jīng)過(guò)獨(dú)立選擇的輕鏈⑶R2氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體；以及 (c)表1或SEQID NO: 18,24以及30中所示出的經(jīng)過(guò)獨(dú)立選擇的輕鏈⑶R3氨基酸序列，或其一個(gè)或兩個(gè)氨基酸已發(fā)生變化的變體。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的抗體，其中所述輕鏈CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列中的至少兩個(gè)示出于表1或SEQ ID NO: 16-18,22-24以及28-30中。
16.根據(jù)權(quán)利要求10至15中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體包含與表1或SEQID NO:4、8以及12中所示出的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗體，所述抗體包含與表1或SEQID N0:4、8以及12中所示出的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列具有至少85%同一性的氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗體，所述抗體包含與表1或SEQID N0:4、8以及12中所示出的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的抗體,所述抗體包含表1或SEQID NO:4、8以及12中所示出的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體包含氨基酸序列與輕鏈可變區(qū)的所有三個(gè)IXDR具有至少70%同一性的多肽序列，IXDRl、IXDR2以及IXDR3的氨基酸序列示出于 SEQ ID NO: 16-18,22-24 以及 28-30 中。
21.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體包含(i)與輕鏈可變區(qū)的所有三個(gè)IXDR具有至少70%同一性的氨基酸序列，IXDR1、IXDR2以及IXDR3的氨基酸序列示出于SEQ ID NO: 16-18,22-24以及28-30中；以及(ii)與重鏈可變區(qū)的所有三個(gè)HCDR具有至少70%同一性的氨基酸序列，HCDRU HCDR2以及HCDR3的氨基酸序列示出于SEQ IDNO: 13-15、19-21 以及 25-27 中。
22.—種結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGFβ ) 1、TGFβ 2以及TGFβ 3的抗體，所述抗體包含輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)，其中 (a)所述輕鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID NO: 16、22以及28或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO: 17、23以及29或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R2，和/或從SEQ ID NO: 18、24以及30或與其具有至少80%同一性的序列中選出的CDR3 ;和/或其中(b)所述重鏈可變區(qū)至少包含從SEQ ID NO: 13、19以及25或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO: 14、20以及26或與其具有至少80%同一性的序列中選出的⑶R2，和/或從SEQ ID NO: 15、21以及27或與其具有至少80%同一性的序列中選出的CDR3。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的抗體，其中 (a)所述輕鏈可變區(qū)至少包含從SEQID NO: 16或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO: 17或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQID NO: 18或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3 ;和/或其中 (b)所述重鏈可變區(qū)至少包含從SEQID NO: 13或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO: 14或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQID NO: 15或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的抗體，其中 (a)所述輕鏈可變 區(qū)至少包含從SEQID NO: 22或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO:23或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQID NO:24或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3 ;和/或其中 (b)所述重鏈可變區(qū)至少包含從SEQID NO: 19或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO:20或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQID NO:21或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的抗體，其中 (a)所述輕鏈可變區(qū)至少包含從SEQID NO: 28或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO:29或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQID NO:30或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3 ;和/或其中 (b)所述重鏈可變區(qū)至少包含從SEQID NO: 25或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R1、從SEQ ID NO:26或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R2，以及從SEQID NO:27或與其具有至少90%同一性的序列中選出的⑶R3。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體進(jìn)一步包含重鏈恒定區(qū)，其中所述重鏈恒定區(qū)是經(jīng)過(guò)修飾或未經(jīng)過(guò)修飾的IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、其片段或其組合。
27.根據(jù)權(quán)利要求13至26中任一項(xiàng)所述的抗體，其中一個(gè)或多個(gè)輕鏈框架氨基酸已被另一個(gè)人類(lèi)抗體氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)氨基酸置換。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至3、13至14或22中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體從XPA.42.089、XPA.42.068 以及 XPA.42.681 中選出。
29.根據(jù)權(quán)利要求13至28中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體進(jìn)一步包含與所述輕鏈可變區(qū)連接的人類(lèi)輕鏈恒定區(qū)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的抗體，其中所述輕鏈恒定區(qū)是經(jīng)過(guò)修飾或未經(jīng)過(guò)修飾的λ輕鏈恒定區(qū)、K輕鏈恒定區(qū)、其片段或其組合。
31.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體以KT6M或更小的親和力Kd結(jié)合 TGFP 1、TGFP 2 以及 TGF β 3。
32.根據(jù)權(quán)利要求1至31中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體與TGFPI和TGFii 2結(jié)合的親和力大于與TGFii 3結(jié)合的親和力。
33.根據(jù)權(quán)利要求1至32中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體中和TGFPI和TGF β 2活性的程度大于中和TGFii 3活性的程度。
34.一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)所述的重鏈或輕鏈的核苷酸序列。
35.一種表達(dá)載體,所述表達(dá)載體包含與表達(dá)控制序列可操作地連接的根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸分子。
36.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含根據(jù)權(quán)利要求35所述的載體或根據(jù)權(quán)利要求34所述的核酸分子。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核酸分子，其中所述重鏈核酸和所述輕鏈核酸由不同的核酸或在相同的核酸上表達(dá)。
38.一種使用根據(jù)權(quán)利要求36或37所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，所述方法包括在適合的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求3 6或37所述的宿主細(xì)胞以及回收所述抗體。
39.一種抗體，所述抗體由根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法產(chǎn)生。
40.一種無(wú)菌的藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1至33以及39中任一項(xiàng)所述的抗體以及藥學(xué)上可接受的載體。
41.一種用于治療與TGFP表達(dá)相關(guān)的疾病、病狀或病癥的方法,所述方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)所述的抗體或根據(jù)權(quán)利要求40所述的藥物組合物的步驟。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述疾病、病狀或病癥是從由以下各項(xiàng)組成的群組中選出:癌癥、眼睛疾病、病狀或病癥、眼科纖維組織形成或眼睛纖維化、肺纖維化、特發(fā)性肺纖維化、細(xì)支氣管周?chē)w維化、間質(zhì)性肺病、慢性阻塞性肺病(COPD)、小氣管疾病(例如阻塞性細(xì)支氣管炎)、肺氣腫、成人或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性肺損傷(ALI);因感染劑或毒性劑所致的肺纖維化；腎纖維化、由所有病因所致的腎小球腎炎(GN)、腎小球膜增生性GN、免疫性GN以及新月體性GN、腎小球硬化癥、腎小管間質(zhì)損傷、腎間質(zhì)性纖維化、腎纖維化以及腎間質(zhì)性纖維化的所有成因、由藥物暴露、對(duì)移植接受者進(jìn)行的環(huán)孢菌素治療的并發(fā)癥引起的腎纖維化、HIV相關(guān)腎病、移植腎病、糖尿病性腎臟疾病(糖尿病性腎病)、腎原性全身性纖維化、糖尿病、特發(fā)性腹膜后纖維化、硬皮病、肝纖維化、與過(guò)度瘢痕形成和進(jìn)行性硬化相關(guān)的肝臟疾病、肝硬化、膽道系統(tǒng)的病癥、可歸因于感染的肝功能失調(diào)、纖維囊性疾病、心血管疾病、充血性心力衰竭、擴(kuò)張性心肌病；心肌炎；血管狹窄、心臟纖維化(梗塞后心臟纖維化)、后壁心肌梗塞、左心室肥大、靜脈閉塞性疾病、再狹窄、血管成形術(shù)后再狹窄、動(dòng)靜脈移植失敗、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、高血壓性心臟病、心臟肥大、肥厚型心肌病、心力衰竭、主動(dòng)脈疾病、進(jìn)行性全身性硬化、多發(fā)性肌炎、全身性紅斑狼瘡、皮肌炎、筋膜炎、雷諾氏綜合征、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、佩羅尼氏病、全身性硬化、脊髓損傷后、骨質(zhì)疏松癥、卡-恩二氏病、克羅恩氏病、瘢痕形成、馬凡氏綜合征、卵巢早衰、阿爾茨海默氏病和帕金森氏病、因手術(shù)切口或機(jī)械性創(chuàng)傷所致的纖維化、與眼部手術(shù)相關(guān)的纖維化；以及由創(chuàng)傷或手術(shù)傷口引起的在傷口愈合期間皮膚中出現(xiàn)的過(guò)度或肥厚性瘢痕或瘢痕瘤形成。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述疾病、病狀或病癥是從由以下各項(xiàng)組成的群組中選出的眼睛疾病、病狀或病癥:纖維增生性病癥、眼睛纖維化、眼科纖維組織形成、視網(wǎng)膜功能失調(diào)、與視網(wǎng)膜功能失調(diào)相關(guān)的纖維化、濕性或干性黃斑變性、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病、由任何病因所致的玻璃體視網(wǎng)膜病、與眼部手術(shù)(如對(duì)青光眼的治療、視網(wǎng)膜復(fù)置術(shù)、白內(nèi)障摘除術(shù)或任何種類(lèi)的引流程序)相關(guān)的纖維化、角膜和結(jié)膜中的瘢痕形成、角膜內(nèi)皮纖維化、堿燒傷(例如角膜堿燒傷)、白內(nèi)障手術(shù)后晶狀體囊纖維化、斜視手術(shù)中圍繞眼外肌的組織中過(guò)度瘢痕形成、前囊下白內(nèi)障和后囊膜渾濁、眼睛前段纖維化疾病、角膜基質(zhì)纖維化(例如與角膜渾濁相關(guān))、小梁網(wǎng)纖維化(例如與青光眼相關(guān))、眼睛后段纖維化疾病、纖維血管性瘢痕形成(例如眼睛視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜血管結(jié)構(gòu)中)、視網(wǎng)膜纖維化、視網(wǎng)膜前纖維化、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)增生、視網(wǎng)膜下纖維化(例如與年齡相關(guān)性黃斑變性相關(guān))、與視網(wǎng)膜和青光眼手術(shù)后相關(guān)的纖維化、以及與糖尿病性視網(wǎng)膜病中的組織收縮相關(guān)的牽拉性視網(wǎng)膜脫離。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述疾病、病狀或病癥是纖維增生性眼睛疾病、病狀或病癥、眼睛纖維化或眼科纖維化。
45.一種用于治療癌癥的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)所述的抗體或根據(jù)權(quán)利要求40所述的藥物組合物。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述抗體或組合物增加腫瘤中自然殺傷(NK)細(xì)胞的數(shù)目和/或提高NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述抗體或組合物減少腫瘤中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)目和/或抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能。
48.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述抗體或組合物增加腫瘤中細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的數(shù)目和/或增強(qiáng)CTL的功能。
49.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述抗體減少腫瘤中骨髓衍生抑制性細(xì)胞(MDSC)的數(shù)目和/或抑制MDSC的功能。
50.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述抗體減少腫瘤中樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的數(shù)目和/或抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的致耐受性功能`。
51.根據(jù)權(quán)利要求45至50中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥是從由以下各項(xiàng)組成的群組中選出:肺癌、前列腺癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、食道癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、胃癌、纖維變性癌癥、神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及黑色素瘤。
52.一種用于治療纖維化的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)所述的抗體或根據(jù)權(quán)利要求40所述的藥物組合物。
53.一種用于治療與TGFii表達(dá)相關(guān)的病狀或病癥的組合物，所述組合物包含根據(jù)權(quán)利要求I至33中任一項(xiàng)所述的抗體或根據(jù)權(quán)利要求40所述的藥物組合物。
【文檔編號(hào)】C07K16/22GK103732623SQ201280037239
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月3日
【發(fā)明者】丹尼爾·貝丁格, 希琳·S·卡恩, 阿默·米爾扎, 阿賈伊·J·納拉辛哈, 竹內(nèi)俊彥 申請(qǐng)人:佐馬技術(shù)有限公司