用于提純l-半胱氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于由含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯制備提純的含L-半胱氨酸的溶液的方法。在所述方法中，將含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯在6-9的pH下與堿性陰離子交換劑接觸，其中L-半胱氨酸與所述陰離子交換劑結(jié)合。然后用第一洗滌溶液洗滌陰離子交換劑，通過酸將結(jié)合的L-半胱氨酸從陰離子交換劑去除，并將其轉(zhuǎn)移到洗出液中。將pH≤4的所述洗出液與酸性陽離子交換劑接觸，其中L-半胱氨酸與所述陽離子交換劑結(jié)合。用第二洗滌溶液洗滌陽離子交換劑，并通過強(qiáng)酸將結(jié)合的L-半胱氨酸從陽離子交換劑去除。
【專利說明】用于提純L-半胱氨酸的方法
[0001]本發(fā)明涉及用于從含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯中提純L-半胱氨酸的方法。
[0002]L-半胱氨酸是一種氨基酸，其由于良好的水溶解性和SH基對(duì)許多試劑，例如對(duì)氧化劑的高敏感性，在較大的難度和高費(fèi)用下才能提純和分離。
[0003]US2590209描述了用于將氨基酸混合物分離成酸性、中性和堿性的氨基酸的一般方法，其中首先將酸性蛋白質(zhì)水解物通過陽離子交換劑，然后通過氫氧化銨洗脫酸性和中性的氨基酸，同時(shí)保留堿性氨基酸。隨后使用碳酸鹽溶液將這些堿性氨基酸從陽離子交換劑洗出。進(jìn)而通過下游的陰離子交換劑分離酸性和中性的氨基酸，在陰離子交換劑上只結(jié)合酸性氨基酸。所述方法不適于提純半胱氨酸，因?yàn)閷A用作洗脫劑，而半胱氨酸在高PH值下是特別對(duì)氧化敏感的。
[0004]EP1958933A1 (對(duì)應(yīng)US2008-0190854)描述了提純中的問題以及分離L-半胱氨酸的現(xiàn)有技術(shù)。該申請(qǐng)描述了一種方法，其中使包含能夠在PH值〈5下氧化半胱氨酸的氧化劑的含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯在pH為5-9下與離子交換劑接觸，其中發(fā)酵肉湯中出現(xiàn)pH〈5，優(yōu)選pH〈2。在此，L-半胱氨酸與離子交換劑結(jié)合，并且結(jié)合的L-半胱氨酸通過洗脫劑從離子交換劑去除。隨后可通過分級(jí)結(jié)晶從洗出液中得到L-半胱氨酸單鹽酸鹽一水合物。通過加入濃HCl或通過引入HCl氣體首先結(jié)晶出無機(jī)堿金屬離子和堿土金屬離子的氯化物以及氯化銨。在過濾后，將含L-半胱氨酸的母液冷卻至-10°C，L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物結(jié)晶。但是，收率和純度取決于所使用的含L-半胱氨酸溶液的純度；高達(dá)>98重量％的純度要求進(jìn)一步的分級(jí)結(jié)晶和/或重結(jié)晶。
[0005]例如從EP0885962B1 (對(duì)應(yīng)US5972663A)得知用于L-半胱氨酸的發(fā)酵制備的方法。這些方法使得可以經(jīng)濟(jì)地得到含大量L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯。
[0006]這種含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯是復(fù)雜的混合物。它不僅包含L-半胱氨酸，而且通常還包含在發(fā)酵條件下，特別是 通過存在的氧氣的氧化而易于由L-半胱氨酸形成的L-胱氨酸。如EP0885962B1所述，在醛或酮的存在下，還可存在相應(yīng)的L-半胱氨酸的半硫縮酮(hemithioketal)和/或噻唑烷的衍生物。發(fā)酵肉湯還可包含少量的其它氨基酸或它們的衍生物。它們通常還包含糖類、有機(jī)和無機(jī)陽離子和陰離子的鹽例如堿金屬鹽和堿土金屬鹽以及痕量的重金屬鹽(例如Fe、Cu、Mn、Zn等)、著色劑和其它雜質(zhì)和添加劑，例如發(fā)酵中使用的微生物的不希望的代謝物。此外，發(fā)酵肉湯還可包含發(fā)酵中使用的原料和成分，例如常規(guī)碳源，例如葡萄糖、乳糖、淀粉等；氮源，例如氨/銨或蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解物等；以及硫源，例如硫化物、亞硫酸鹽、硫酸鹽、硫代硫酸鹽或連二亞硫酸鹽等。由于L-半胱氨酸是含硫的氨基酸，所以硫源例如硫化物、亞硫酸鹽、硫酸鹽、硫代硫酸鹽或連二亞硫酸鹽等通常在發(fā)酵過程中供入以提供用于形成L-半胱氨酸所需的足夠量的硫。此外，由于發(fā)酵過程中引入氧氣，溶解氧也存在于發(fā)酵肉湯中。如EP0885962B1所示，這些發(fā)酵肉湯的pH通常為7。除了發(fā)酵肉湯的組成的復(fù)雜性之外，還會(huì)出現(xiàn)各成分比例上的自然波動(dòng)，因?yàn)槿鉁巧镞^程的產(chǎn)物。
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種用于由含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯制備提純的含L-半胱氨酸溶液的簡(jiǎn)單、不昂貴且工業(yè)可實(shí)施的方法。[0008]該目的通過一種方法實(shí)現(xiàn)，在所述方法中將含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯在6-9的pH下與堿性陰離子交換劑接觸，其中L-半胱氨酸與陰離子交換劑結(jié)合，用第一洗滌溶液沖洗所述陰離子交換劑，用酸將結(jié)合的L-半胱氨酸從陰離子交換劑中去除，并將其轉(zhuǎn)移到洗出液中，將所述洗出液在< 4的pH下與酸性陽離子劑接觸，其中L-半胱氨酸與陽離子交換劑結(jié)合，用第二洗滌溶液沖洗陽離子交換劑，并用強(qiáng)酸將結(jié)合的L-半胱氨酸從陽離子交換劑去除。
[0009]本發(fā)明的方法總是得到均勻的溶液，而無論發(fā)酵肉湯組成的波動(dòng)，這是因?yàn)長(zhǎng)-半胱氨酸可靠并且?guī)缀跬耆貜乃邪殡S的物質(zhì)中分離出。如需要，然后可從溶液中得到固體形式的L-半胱氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽或L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物。為此，優(yōu)選濃縮所得溶液，直至結(jié)晶出理想的產(chǎn)物，優(yōu)選是L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物。以此方式得到的L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物具有>98重量％的純度。不需要EP1958933A1中所述的分級(jí)結(jié)晶。
[0010]優(yōu)選在已分離出細(xì)胞和固體物之后，使用本發(fā)明的方法首先通過堿性離子交換劑，然后通過酸性離子交換劑提純含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯。
[0011]酸性離子交換劑和堿性離子交換劑是已知且市售的。各種合適材料的選擇見于Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol.A14,ρ.451。作為活性離子交換基團(tuán)，它們包含例如羧酸基(弱酸性離子交換劑)、磺酸基和磷酸基(強(qiáng)酸性離子交換劑)、季銨基(強(qiáng)堿性離子交換劑)或胺基(弱堿性離子交換劑)。作為活性離子交換基的反荷離子，陽離子或陰離子可與離子交換劑結(jié)合。酸性離子交換劑通常以質(zhì)子化H+形式使用，但其它的常規(guī)反荷離子是例如銨離子、堿金屬離子和/或堿土金屬離子。堿性離子交換劑，特別是強(qiáng)堿性離子交換劑常以O(shè)H—形式使用，但其它常規(guī)的反荷離子是例如氯離子和現(xiàn)有技術(shù)中描述的其它尚子。
[0012] 優(yōu)選使用強(qiáng)酸性離子交換劑和強(qiáng)堿性離子交換劑。陰離子交換劑優(yōu)選以0Η—形式使用，而陽離子交換劑優(yōu)選以H+形式使用。但是，原則上也可使用具有其它反荷離子的離子交換劑。
[0013]含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯優(yōu)選首先與強(qiáng)堿性陰離子交換劑接觸，然后將來自陰離子交換劑的含L-半胱氨酸的洗出液與強(qiáng)酸性陽離子交換劑接觸。這可例如通過使發(fā)酵肉湯或洗出液泵入用相應(yīng)的離子交換劑填充的柱而實(shí)施。所使用的發(fā)酵肉湯的PH相當(dāng)于發(fā)酵過程中的PH，為6-9，優(yōu)選為6-8。
[0014]來自陰離子交換劑的含L-半胱氨酸的洗出液優(yōu)選在pH為1-4下施用于陽離子交換劑。
[0015]所述第一洗滌溶液優(yōu)選是pH為6-8的水，特別優(yōu)選是pH為7的水(中性水)。使用該洗滌溶液洗滌從陰離子交換劑中去除發(fā)酵肉湯中的中性和陽離子成分。
[0016]所述第二洗滌溶液優(yōu)選是pH為4-8的水，特別優(yōu)選是pH為5-7的水。使用該中性至略酸性的水洗滌從陽離子交換劑中去除陰離子雜質(zhì)。
[0017]在本專利申請(qǐng)中給出的所有pH值都是在25o°C下測(cè)定的pH。
[0018]在產(chǎn)生本發(fā)明的試驗(yàn)中，出人意料地發(fā)現(xiàn)在>7的pH值下通過環(huán)境氧或其它氧化劑很容易轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-胱氨酸的L-半胱氨酸可吸收在堿性離子交換劑上，并在無顯著的氧化下又洗脫掉。這是特別出人意料的，因?yàn)楫?dāng)在洗脫與酸性陽離子交換劑結(jié)合的L-半胱氨酸中使用堿例如氨水時(shí)，觀察到L-半胱氨酸顯著氧化為L(zhǎng)-胱氨酸。該氧化造成收率直接顯著的下降(參見實(shí)施例3-6)，因此方法的經(jīng)濟(jì)性不再是理想的。
[0019]如果中性的含L-半胱氨酸的溶液或發(fā)酵肉湯與陰離子交換劑，優(yōu)選0H_形式的強(qiáng)堿性陰離子交換劑接觸，L-半胱氨酸在該操作中基本定量地與陰離子交換劑結(jié)合。其它氨基酸例如L-胱氨酸和/或可存在于發(fā)酵肉湯中的其它陰離子在此也可與離子交換樹脂結(jié)合。許多其它雜質(zhì)，例如中性化合物或陽離子或它們相應(yīng)的堿不與陰離子交換樹脂結(jié)合，而存在于流出物中。
[0020]在使用酸洗脫之后，將含L-半胱氨酸的溶液與陽離子交換劑，優(yōu)選H+形式的強(qiáng)酸性陽離子交換劑接觸，導(dǎo)致L-半胱氨酸與陽離子交換劑定量結(jié)合。仍存在的陰離子雜質(zhì)不與陽離子交換樹脂結(jié)合，而存在于流出物中。
[0021 ] 作為洗脫劑，優(yōu)選使用強(qiáng)酸，為此目的優(yōu)選是pKa小于4.5的酸，特別優(yōu)選是鹽酸。鹽酸水溶液是特別適用的。
[0022]在使用鹽酸洗脫中，將優(yōu)選具有不同當(dāng)量濃度的鹽酸水溶液，更優(yōu)選0.01-12NHC1，特別優(yōu)選0.0l-1N HC1，泵壓通過吸附有L-半胱氨酸的陰離子交換劑。非常特別優(yōu)選在洗脫過程中HCl濃度從初始0.0lN增加至IN的洗脫劑。
[0023]在使用鹽酸洗脫中，優(yōu)選泵壓具有不同當(dāng)量濃度的鹽酸水溶液，優(yōu)選0.1-12NHC1，特別優(yōu)選1-2N HCl通過裝載有L-半胱氨酸的陽離子交換劑。
[0024]優(yōu)選在25°C和周圍大氣壓力即900_1100hPa下實(shí)施吸附、洗滌步驟和洗脫。但是，也可在更低或更高的溫度和壓力下實(shí)施。
[0025]使用鹽酸洗脫L-半胱氨酸得到L-半胱氨酸的提純HCl溶液。該溶液可任選濃縮，并且例如通過活性炭脫色。任選地，在加入HCl之后，使工業(yè)上特別重要的產(chǎn)物L(fēng)-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物結(jié)晶。通過雙離子交換劑的提純能夠得到高純度的L-半胱氨酸，無論初始采用的發(fā)酵肉湯的組成如何。不需要例如通過分級(jí)結(jié)晶的其它提純。
[0026]本發(fā)明的方法能夠從含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯有效提純L-半胱氨酸，并具有良好的收率和經(jīng)濟(jì)性。當(dāng)需要或希望時(shí)，可能存在的任何L-半胱氨酸的衍生物，例如L-胱氨酸或噻唑烷衍生物可例如在特定的方法條件下轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-半胱氨酸，以提高所達(dá)到的收率。因此，例如經(jīng)過強(qiáng)酸性陽離子交換劑而使半胱氨酸的噻唑烷衍生物斷裂是已知的，并且描述于EP1059288B1中。通過加入合適的還原劑而使L-胱氨酸斷裂形成L-半胱氨酸也是可想到的。
[0027]無論初始采用的發(fā)酵肉湯的組成如何，所述方法能夠?qū)⑼鈦淼陌被岷拷档椭粱贚-半胱氨酸〈5重量％，優(yōu)選〈I重量％。此外，還可將含鹽量降低至基于L-半胱氨酸<10重量％，優(yōu)選〈I重量％。此外，所述方法可由含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯制備純度>98重量％且光學(xué)純度>99%的L-半胱氨酸或L-半胱氨酸鹽酸鹽或L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物，而不需要例如通過分級(jí)結(jié)晶再額外提純。
[0028]在實(shí)施本發(fā)明方法之前，優(yōu)選在第一方法步驟中從含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯分離出微生物細(xì)胞和/或不溶性成分。這例如通過離心、過濾、潷析、膜過濾或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的用于從發(fā)酵肉湯分離細(xì)胞/固體物的方法來實(shí)施。所述分離任選通過加入過濾助劑例如Celite?、活性炭或硅藻土實(shí)施。在該方法步驟中，在發(fā)酵中可由微生物形成的除了細(xì)胞之外的其它不溶性成分，例如從溶液沉淀的胱氨酸或其它微溶的成分的沉淀物也有利地從發(fā)酵肉湯中分尚出。此外，大分子，例如蛋白質(zhì)可在該方法步驟中例如分尚出或吸附在任選使用的過濾助劑或活性炭等上并因此分離出。通過該預(yù)處理得到的含L-半胱氨酸的溶液出于本發(fā)明目的也包括在術(shù)語“發(fā)酵肉湯”之下。
[0029]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明。
[0030]實(shí)施例1:通過本發(fā)明的方法提純含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯
[0031]在中性pH (pH:7)下將500ml無細(xì)胞的發(fā)酵肉湯(24g/l L-半胱氨酸、1.2g/lL-胱氨酸、18g/l N-乙酰絲氨酸)施用于150ml的陰離子交換樹脂(0H_形式)，所述陰離子交換樹脂從Rohm&Haas以名稱Amberlite? FPA42C1可購(gòu)得。然后用250ml水(pH7)洗滌樹脂，并用1750ml HCl洗脫。在此，逐步每250ml將酸濃度從0.0lM HCl提高至0.1M HCl至0.25M HCl至0.5MHC1。通過HPLC測(cè)定各情況中洗出液餾分的半胱氨酸含量，并合并含半胱氨酸的餾分。在該合并溶液中，將500ml施用于120ml的陽離子交換樹脂(H+形式)，所述陽離子交換樹脂從Rohm&Haas以名稱Amberlite? FPC14-Na可購(gòu)得。然后用120ml水洗滌樹脂，并用720mlIM HCl洗脫樹脂。
[0032]來自陰離子交換劑的洗出液中的含半胱氨酸餾分包含大于85%的所施用的發(fā)酵肉湯中存在的L-半胱氨酸，并且在來自陽離子交換樹脂的洗出液的產(chǎn)物餾分中的L-半胱氨酸的收率是定量的。
[0033]實(shí)施例2:對(duì)比例:僅通過陽離子交換劑提純含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯(對(duì)應(yīng)EP1958933A1中的方法)，洗脫劑:HC1
[0034]通過6M HCl將6500ml pH為7的無細(xì)胞的發(fā)酵肉湯酸化至pH=l，并在I小時(shí)后離
心分離掉變性蛋白質(zhì)和其它固體物。通過陽離子交換劑(丨100ml Amberlite? FPC14-Na，
H+形式)提純5350ml澄清的含HCl 的溶液(19g/l L-半胱氨酸、1.4g/l L-胱氨酸、8g/lN-乙酰絲氨酸)。將溶液施加至離子交換劑，用3300ml水洗滌柱，并用5500mllM HCl洗脫。洗出液中的含半胱氨酸餾分包含85%所用的半胱氨酸量以及溶液中存在的陽離子。
[0035]實(shí)施例3:對(duì)比例:通過陽離子交換劑在堿性條件下提純含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯，洗脫劑=NH4OH
[0036]通過6M HCl將100ml pH為7的無細(xì)胞的發(fā)酵肉湯酸化至pH=l，并在I小時(shí)后離心分離掉變性蛋白質(zhì)和其它固體物。通過陽離子交換劑(20ml Amberlite? FPCl4-Na，H+形式)提純澄清的含HCl的溶液(20g/l L-半胱氨酸、1.2g/l L-胱氨酸、8g/l N-乙酰絲氨酸)。將溶液施加至離子交換劑，用60ml水洗滌柱，并用100ml2M NH3洗脫。產(chǎn)物餾分包含約50%的所施用的發(fā)酵肉湯中存在的L-半胱氨酸、以及相對(duì)于初始量顯著提高的胱氨酸量。
[0037]實(shí)施例4:來自實(shí)施例1的HCl洗出液的L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物的結(jié)晶
[0038]將500ml來自實(shí)施例1的提純的含L-半胱氨酸的溶液(使用IM HCl得到的洗出液)在45°C和50mbar下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)，直至開始結(jié)晶，然后使溶液緩慢變?yōu)槭覝?，隨后繼續(xù)將溫度降低至_18°C。在攪拌3小時(shí)之后，在預(yù)冷的吸濾器上通過抽吸過濾掉沉淀物，并在空氣中干燥。
[0039]收率:6.5g細(xì)結(jié)晶固體，>98重量％的半胱氨酸鹽酸鹽一水合物(基于原溶液=無細(xì)胞的發(fā)酵肉湯，相當(dāng)于70%的總半胱氨酸收率)[0040]實(shí)施例5:對(duì)比例:來自實(shí)施例2的HCl洗出液的L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物的結(jié)晶
[0041]將5500ml來自實(shí)施例2的提純的含L-半胱氨酸的溶液(使用IM HCl得到的洗出液)在45°C和50mbar下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)，直至開始結(jié)晶，然后使溶液緩慢變?yōu)槭覝?，隨后繼續(xù)將溫度降低至_18°C。在攪拌3小時(shí)之后，在預(yù)冷的吸濾器上通過抽吸過濾掉沉淀物，并在空氣中干燥。
[0042]收率:120g細(xì)結(jié)晶固體，79重量％的半胱氨酸鹽酸鹽一水合物(基于原溶液=無細(xì)胞的發(fā)酵肉湯，相當(dāng)于64%的總半胱氨酸收率)
[0043]實(shí)施例6:對(duì)比例:來自實(shí)施例3的HCl洗出液的L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物的
結(jié)晶
[0044]將IOOml來自實(shí)施例3的提純的含L-半胱氨酸的溶液(使用2M NH3得到的洗出液)在45°C和50mbar下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)，直至開始結(jié)晶，然后使溶液緩慢變?yōu)槭覝兀S后繼續(xù)將溫度降低至-18°C。在攪拌3小時(shí)之后，在預(yù)冷的吸濾器上通過抽吸過濾掉沉淀物，并在空氣中干燥。
[0045]收率:所得產(chǎn)物的分析顯示在這些條件下，約90%所用的L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-胱氨酸。
【權(quán)利要求】
1.用于由含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯制備提純的含L-半胱氨酸的溶液的方法，其特征在于，將所述含L-半胱氨酸的發(fā)酵肉湯在6-9的pH下與堿性陰離子交換劑接觸，其中L-半胱氨酸與所述陰離子交換劑結(jié)合，用第一洗滌溶液沖洗該陰離子交換劑，通過酸將結(jié)合的L-半胱氨酸從陰離子交換劑去除，并將其轉(zhuǎn)移到洗出液中，將所述洗出液在<4的pH下與酸性陽離子交換劑接觸，其中L-半胱氨酸與所述陽離子交換劑結(jié)合，用第二洗滌溶液沖洗該陽離子交換劑，并通過強(qiáng)酸將結(jié)合的L-半胱氨酸從陽離子交換劑去除。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，使用強(qiáng)酸性離子交換劑和強(qiáng)堿性離子交換劑。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，所述陰離子交換劑以0H形式使用，以及所述陽離子交換劑以H+形式使用。
4.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述第一洗滌溶液是pH為6-8的水，特別優(yōu)選是pH為7的水。
5.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述第二洗滌溶液是pH為4-8的水，特別優(yōu)選是pH為5-7的水。
6.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，首先從所述發(fā)酵肉湯中分離掉細(xì)胞和固體物。
7.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所得溶液首先被濃縮，隨后從濃縮溶液中結(jié)晶出L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其特征 在于，所得L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物具有>98重量％的純度。
【文檔編號(hào)】C07C323/58GK103476748SQ201280019101
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月20日
【發(fā)明者】M·洛伊特, A·伯姆 申請(qǐng)人:瓦克化學(xué)股份公司