專利名稱：一種基因工程包涵體的洗滌方法
一種基因工程包涵體的洗滌方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種基因工程包涵體的洗滌方法，特別涉及了一種利用中空纖維濾膜對基因工程包涵體進(jìn)行洗滌的方法。
背景技術(shù)：
基因重組技 術(shù)可以用來大量生產(chǎn)自然界極其微量的功能蛋白或多肽，大腸桿菌等原核生物因其生長速度快，營養(yǎng)要求低，通常作為基因重組技術(shù)的首選宿主菌。然而，用大腸桿菌高效表達(dá)的重組蛋白常常會形成不溶性的且無活性的包涵體。包涵體是重組基因在表達(dá)過程中因蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)錯(cuò)誤折疊所形成的一種致密性的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于重組蛋白不被胞內(nèi)蛋白酶水解，保證了重組蛋白的高效表達(dá)。基因工程包涵體可以通過變性劑將其溶解，再緩慢除去變性劑，從而使其恢復(fù)天然活性。
由于基因包涵體不僅僅含有重組蛋白，還有外膜蛋白，質(zhì)粒DNA和其他雜質(zhì)，因此為了提高包涵體的質(zhì)量，增加其中重組蛋白的含量，以利于重組蛋白重新折疊恢復(fù)其天然構(gòu)象，通常需要將包涵體經(jīng)過充分洗滌，以除去細(xì)胞膜等脂溶性組分，雜蛋白，核酸等物質(zhì)， 提高包涵體的純度。包涵體洗滌的傳統(tǒng)方法為第一次洗滌加入含一定比例去垢劑(曲拉通、吐溫等)的緩沖液，將包涵體懸液攪拌洗滌一定時(shí)間后離心去除上清，收集沉淀；第二次洗滌加入含低濃度變性劑(2-4M脲、1-2M鹽酸胍)的緩沖液，將包涵體懸液攪拌洗滌一定時(shí)間后離心去除上清，收集沉淀；根據(jù)需要再洗滌第三次或第四次，同樣離心去除上清，收集沉淀。李曉紅等在《重組人胰島素制備工藝》(《四川大學(xué)學(xué)報(bào)》，2007年)中報(bào)道了重組人胰島素原包涵體的收集和洗滌，包涵體先用含2 M尿素的緩沖液洗滌第一次，4度17000g 離心收集沉淀；沉淀再用含2%脫氧膽酸鈉的緩沖液洗滌第二次，4度17000g離心收集沉淀；沉淀再用Tris緩沖液洗洚兩次，同樣4度17000g離心收集沉淀。但對洗漆得到的包涵體的純度和收率沒有詳細(xì)的數(shù)據(jù)報(bào)道。許崇利等在《重組人Y-干擾素純化工藝的建立》 (《中國獸藥雜志》，2012年)中報(bào)道了 Y-干擾素包涵體的純化，加入洗滌液洗滌四次，以 10000r/m離心收集包涵體，電泳檢測其純度達(dá)90%。
傳統(tǒng)洗滌方法需要使用高速離心機(jī)或者連續(xù)流離心機(jī)來完成，由此帶來一系列的問題如成本高昂、操作繁瑣、容易產(chǎn)生污染、維修成本高、工藝放大困難。雖然獲得的包涵體純度較高，但包涵體的收率較低。中空纖維過濾膜以其獨(dú)特的開放式流路結(jié)構(gòu)，溫和低剪切力，可以很好地滿足對剪切力敏感的生物大分子以及成分較復(fù)雜的生物樣品不同規(guī)模的濃縮和過濾需要，廣泛用于單抗、病毒類疫苗、菌苗、多糖、核酸、中草藥、生化藥以及乳品飲料等各個(gè)領(lǐng)域。中空纖維膜開放式的流路，可以直接處理菌體發(fā)酵液或高密度細(xì)胞培養(yǎng)液等含有固體的復(fù)雜料液而不會堵塞流路，省去離心等繁瑣的前處理步驟。然而，目前還沒有將中空纖維濾膜用于包涵體洗滌的文獻(xiàn)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)在基因工程包涵體洗滌工藝中存在的問題，達(dá)到減少復(fù)雜操作，易于工業(yè)化生產(chǎn)的目的，本發(fā)明人經(jīng)過大量創(chuàng)造性試驗(yàn)研究，提供一種利用中空纖維濾膜進(jìn)行基因工程包涵體洗滌的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
一種基因工程包涵體的洗滌方法，包括如下步驟
a、膜平衡取中空纖維膜，用純化水潤洗平衡，調(diào)整進(jìn)水流速使過膜壓力為 (trans-membrane pressure、TMP) 5 15 bar,透過通量(Flux,單位升 / 平米 / 小時(shí)，L/ m2 /hr、LMH)為 10 30 LMH ；
b、第一次洗滌配制洗滌緩沖液I，按5 15 :1 (V/W)加入包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)所述中空纖維膜，使過膜壓力(trans-membrane pressure、TMP)為 5 15 bar，透過通量(Flux，單位升/平米/小時(shí)，L/m2/hr、LMH)為10 30 LMH，包涵體懸液被濃縮3 5倍后停止進(jìn)液，收集包涵體濃縮液；所述洗滌緩沖液I的組成為20 100 mM Tris-HCl，I 5% 曲拉通-Χ_100，ρΗ9· 0，或者組成為 20 100 mM Tris-HCl，I 5% 吐溫-20，ρΗ9· O ；
C、第二次洗滌配制洗滌緩沖液II，按5 15:1 (V/W)加入步驟b處理后的包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)所述中空纖維膜，使過膜壓力 (trans-membrane pressure>TMP)為 5 15 bar,透過通量(Flux,單位升 / 平米 / 小時(shí)， L/ m2 /hr、LMH)為10 30 LMH，包涵體懸液被濃縮3 5倍后停止進(jìn)液，收集包涵體濃縮液；所述洗滌緩沖液II的組成為20 100 mM Tris_HCl，2 4 M尿素，pH9. 0，或者組成為 20 100 mM Tris-HCl，I 3 M 鹽酸胍，ρΗ9· O ；
d、第三次洗滌配制洗滌緩沖液III，按5 15:1 (V/W)加入步驟c處理后的包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)所述中空纖維膜，使過膜壓力為 (trans-membrane pressure、TMP) 5 15 bar,透過通量(Flux,單位升 / 平米 / 小時(shí)，L/ m2 /hr,LMH)為10 30 LMH，包涵體懸液被濃縮3 5倍后停止進(jìn)液，收集包涵體濃縮液； 所述洗滌緩沖液III的組成為20 100 mM Tris-HCl, pH9. O。
中空纖維濾膜的材質(zhì)會顯著影響濾膜的化學(xué)耐受性、過濾速度、吸附性能，因此本發(fā)明對用于基因工程包涵體洗滌所用的中空纖維濾膜進(jìn)行了優(yōu)選。優(yōu)選地，所述基因工程包涵體的洗滌方法，其中所述中空纖維膜的材質(zhì)為聚醚砜(PES)，或是再生纖維素(RC)，或是醋酸纖維素(CA)，或是親水性聚偏氟乙烯(PVDF)。
中空纖維濾膜同時(shí)具有多種纖維管內(nèi)徑可選，應(yīng)用于不同性質(zhì)的料液，因此本發(fā)明對用于基因工程包涵體洗滌的中空纖維濾膜的纖維管內(nèi)徑進(jìn)行了優(yōu)選。優(yōu)選地，所述基因工程包涵體的洗滌方法，其中所述中空纖維膜的纖維管內(nèi)徑為O. 75-1. 75mm。
另外，本發(fā)明對用于基因工程包涵體洗滌的中空纖維濾膜的濾膜孔徑進(jìn)行了優(yōu)選。優(yōu)選地，所述基因工程包涵體的洗滌方法，其中所述中空纖維膜的濾膜孔徑為750 k、 O. I μπι、0. 2 μ m 或 O. 45 μ m。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著的進(jìn)步
中空纖維膜開放式的流路，可以直接處理菌體發(fā)酵液或高密度細(xì)胞培養(yǎng)液等含有固體的復(fù)雜料液而不會堵塞流路，省去離心等繁瑣的前處理步驟。本發(fā)明利用中空纖維膜處理基因工程包涵體的洗滌，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)自動操作，工藝過程簡單，操作方便，提高了生產(chǎn)效率，得到的包涵體純度高、收率高、特別適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)上的應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
現(xiàn)通過以下實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明的有益效果，實(shí)施例僅用于例證的目的， 不限制本發(fā)明的范圍，同時(shí)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
實(shí)施例I大腸桿菌表達(dá)重組人胰島素原包涵體(O. 2公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質(zhì)，纖維管內(nèi)徑為I mm，濾膜孔徑為O. I ym)先用純化水潤洗平衡，調(diào)整進(jìn)水流速使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH。將3 L洗滌緩沖液I (20 mM Tris-HCl, 1%曲拉通-Χ_100，pH9. O)加入O. 2公斤大腸桿菌表達(dá)重組人胰島素原包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力為5 bar，透過通量為 10 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進(jìn)液。
將5 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, 2 M尿素，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。
將5 L洗滌緩沖液111(20 mM Tris-HCl,pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。收集得到的包涵體經(jīng)變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為90%，包涵體收率經(jīng)計(jì)算為87%。
實(shí)施例2大腸桿菌表達(dá)重組人胰島素原包涵體(I公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質(zhì)，纖維管內(nèi)徑為1.75 mm，濾膜孔徑為0.2 ym)先用純化水潤洗平衡，調(diào)整進(jìn)水流速使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH。將15 L洗滌緩沖液 I (20 mM Tris-HCl, 5%吐溫_20，pH9. O)加入大腸桿菌表達(dá)重組人胰島素原包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。
將45 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, 3 M鹽酸胍，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。
將45 L洗滌緩沖液IIKlOO mM Tris_HCl，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。收集得到的包涵體經(jīng)變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為91%，包涵體收率經(jīng)計(jì)算為86%。
實(shí)施例3大腸桿菌表達(dá)重組人胰島素原包涵體(5公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質(zhì)，纖維管內(nèi)徑為I mm，濾膜孔徑為O. 2 ym)先用純化水潤洗平衡，調(diào)整進(jìn)水流速使過膜壓力為10 bar，透過通量為20 LMH。將75 L洗滌緩沖液 I (100 mM Tris-HCl, 5%曲拉通-Χ_100，pH9. O)加入大腸桿菌表達(dá)重組人胰島素原包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。
將45 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl,4 M尿素，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力5 bar，透過通量為10LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進(jìn)液。
將75 L洗滌緩沖液111(20 mM Tris-HCl, pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。收集得到的包涵體經(jīng)變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為88%，包涵體收率經(jīng)計(jì)算為85%。
實(shí)施例4大腸桿菌表達(dá)重組人Y -干擾素包涵體(O. 2公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質(zhì)，纖維管內(nèi)徑為I mm，濾膜孔徑為O. I ym)先用純化水潤洗平衡，調(diào)整進(jìn)水流速使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH0將3 L洗滌緩沖液I (20 mM Tris-HCl, 1%曲拉通-X-100，pH9. O)加入大腸桿菌表達(dá)重組人Y-干擾素包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進(jìn)液。
將5 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, 2 M尿素，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進(jìn)液。
將25 L洗滌緩沖液111(20 mM Tris-HCl, pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。收集得到的包涵體經(jīng)變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為89%，包涵體收率經(jīng)計(jì)算為86%。
實(shí)施例5大腸桿菌表達(dá)重組人Y -干擾素包涵體(I公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質(zhì)，纖維管內(nèi)徑為1.75 mm，濾膜孔徑為0.2 ym)先用純化水潤洗平衡，調(diào)整進(jìn)水流速使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH。將15 L洗滌緩沖液 I (20 mM Tris-HCl, 1%吐溫-20，pH9. O)加入大腸桿菌表達(dá)重組人Y -干擾素包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。
將15 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, I M鹽酸胍，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。
將45 L洗滌緩沖液IIKlOO mM Tris_HCl，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進(jìn)液。收集得到的包涵體經(jīng)變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為85%，包涵體收率經(jīng)計(jì)算為89%。
實(shí)施例6大腸桿菌表達(dá)重組人Y -干擾素包涵體(5公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質(zhì)，纖維管內(nèi)徑為I mm，濾膜孔徑為0.2 ym)先用純化水潤洗平衡，調(diào)整進(jìn)水流速使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH。將25 L洗滌緩沖液I (20 mM Tris-HCl, 5%曲拉通X-100，pH9. O)加入大腸桿菌表達(dá)重組人Y-干擾素包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。
將75 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, 4 M尿素，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。
將75 L洗滌緩沖液111(20 mM Tris-HCl, pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。收集得到的包涵體經(jīng)變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為90%，包涵體收率經(jīng)計(jì)算為85%。
實(shí)施例7大腸桿菌表達(dá)重組人粒 細(xì)胞集落刺激因子包涵體(O. 2公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質(zhì)，纖維管內(nèi)徑為I mm，濾膜孔徑為O. I ym)先用純化水潤洗平衡，調(diào)整進(jìn)水流速使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH。將I L洗滌緩沖液I (20 mM Tris-HCl, 1%曲拉通X_100，pH9. O)加入大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進(jìn)液。
將I. 5 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, 2 M尿素，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進(jìn)液。
將7. 5 L洗滌緩沖液111(20 mM Tris-HCl,pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。收集得到的包涵體經(jīng)變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為92%，包涵體收率經(jīng)計(jì)算為89%。
實(shí)施例8大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子包涵體(I公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質(zhì)，纖維管內(nèi)徑為1.75 mm，濾膜孔徑為0.2 ym)先用純化水潤洗平衡，調(diào)整進(jìn)水流速使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH。將15 L洗滌緩沖液 I (20 mM Tris-HCl, 5%吐溫_20，pH9. O)加入大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力為5 bar，透過通量為10 LMH，包涵體懸液被濃縮3倍后停止進(jìn)液。
將25 L洗滌緩沖液II (100 mM Tris-HCl, 3 M鹽酸胍，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。
將75 L洗滌緩沖液III加入上述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。收集得到的包涵體經(jīng)變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為87%，包涵體收率經(jīng)計(jì)算為88%。
實(shí)施例9大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子包涵體(5公斤)的洗滌
中空纖維膜(聚醚砜材質(zhì)，纖維管內(nèi)徑為I mm，濾膜孔徑為O. 2 ym)先用純化水潤洗平衡，調(diào)整進(jìn)水流速使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH。將25 L洗滌緩沖液I (20 mM Tris-HCl，5%曲拉通X-100，pH9. O)加入大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞集落刺激因子包涵體，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力為15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。
將75 L洗滌緩沖液II (20 mM Tris-HCl, 2 M尿素，pH9. O)加入上述包涵體濃縮液， 攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH,包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。
將75 L洗滌緩沖液III加入上 述包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)中空纖維膜，使過膜壓力15 bar，透過通量為30 LMH，包涵體懸液被濃縮5倍后停止進(jìn)液。收集得到的包涵體經(jīng)變性的SDS-PAGE凝膠電泳表明重組蛋白占包涵體總蛋白的含量為90%，包涵體收率經(jīng)計(jì)算為87%。
權(quán)利要求
1.一種基因工程包涵體的洗滌方法，其特征在于包括如下步驟a、膜平衡取中空纖維膜，用純化水潤洗平衡，調(diào)整進(jìn)水流速使過膜壓力為5 15 bar，透過通量為10 30 LMH ；b、第一次洗滌配制洗滌緩沖液I，按5 15:1 (V/W)加入包涵體，攪拌使成懸浮液， 將包涵體懸液泵進(jìn)所述中空纖維膜，使過膜壓力為5 15 bar，透過通量為10 30 LMH, 包涵體懸液被濃縮3 5倍后停止進(jìn)液，收集包涵體濃縮液；所述洗滌緩沖液I的組成為 20 100 mM Tris-HCl，I 5% 曲拉通-Χ-100，ρΗ9· 0，或者組成為 20 100 mM Tris-HCl，I 5% 吐溫-20，pH9. O ；C、第二次洗滌配制洗滌緩沖液II，按5 15 :1 (V/W)加入步驟b處理后的包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)所述中空纖維膜，使過膜壓力為5 15 bar，透過通量為10 30 LMH,包涵體懸液被濃縮3 5倍后停止進(jìn)液，收集包涵體濃縮液；所述洗滌緩沖液II的組成為20 100 mM Tris_HCl，2 4 M尿素，pH9. O，或者組成為20 100 mM Tris-HCl，I 3 M 鹽酸胍，pH9. O ；d、第三次洗滌配制洗滌緩沖液III，按5 15 1 (V/W)加入步驟c處理后的包涵體濃縮液，攪拌使成懸浮液，將包涵體懸液泵進(jìn)所述中空纖維膜，使過膜壓力為5 15 bar，透過通量為10 30 LMH，包涵體懸液被濃縮3 5倍后停止進(jìn)液，收集包涵體濃縮液；所述洗滌緩沖液III的組成為20 100 mM Tris-HCl, ρΗ9· O。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述基因工程包涵體的洗滌方法，其特征在于所述中空纖維膜的材質(zhì)為聚醚砜、再生纖維素、醋酸纖維素或親水性聚偏氟乙烯。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述基因工程包涵體的洗滌方法，其特征在于所述中空纖維膜的纖維管內(nèi)徑為O. 75 I. 75mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述基因工程包涵體的洗滌方法，其特征在于所述中空纖維膜的濾膜孔徑為 750 k、0. I μπκθ.2 μ m 或 O. 45 μ m。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因工程包涵體的洗滌方法，該方法采用中空纖維膜處理基因工程包涵體的洗滌，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)自動操作，工藝過程簡單，操作方便，提高了生產(chǎn)效率，得到的包涵體收率高、純度高、特別適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)上的應(yīng)用。
文檔編號C07K1/34GK102977183SQ20121053305
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者趙志全, 熊繼元, 柳常青 申請人:魯南新時(shí)代生物技術(shù)有限公司