專利名稱：一種綜合利用Cohn組分IV的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白制備領(lǐng)域，尤其涉及綜合利用Cohn組分IV的方法。
背景技術(shù)：
目前，從血漿中制備白蛋白和IgG所采用的大都為Cohn冷乙醇沉淀法。這種方法中的組分IV中主要是含有蛋白，其中包括很多有潛在價值的蛋白質(zhì)，但現(xiàn)在通常作為廢棄物丟掉。其中這些蛋白無論作為臨床使用還是作為生化診斷試劑都有著非常廣闊的前景。 比如Q1-抗胰蛋白酶可以治療CI1-抗胰蛋白酶先天性缺乏伴肺氣腫患者，是美國FDA批準(zhǔn)的藥品；α 2-巨球蛋白用于質(zhì)量放射損傷的治療以及眼角膜損傷和角膜炎的治療；補(bǔ)體 I酯酶抑制劑遺傳性血管神經(jīng)性水腫；結(jié)合珠蛋白靜脈輸注結(jié)合珠蛋白或用固相化結(jié)合珠蛋白體外循環(huán)去除血液中的游離血紅蛋白，防止和治療溶血性腎衰竭；運(yùn)鐵蛋白治療先天性無運(yùn)鐵蛋白血癥，用脫鐵的運(yùn)鐵蛋白治療鐵血黃素沉著癥；銅藍(lán)蛋白促進(jìn)紅細(xì)胞生成，治療貧血。此外血液中的很多檢測指標(biāo)都是針對某一種蛋白的檢測，這對于判斷疾病類型有著重要的臨床意義，而檢測試劑盒的制備需要采用純度非常高的抗原來免疫動物， 得到相應(yīng)的抗體。這類產(chǎn)品的市場空間也非常大，因?yàn)殡S著技術(shù)的成熟，會有越來越多的醫(yī)院都采用這類檢測指標(biāo)更有效的輔助疾病類型的判斷。比如銅藍(lán)蛋白的升高可以作為某些疾病的前兆，現(xiàn)在醫(yī)院對于載脂蛋白檢測的需求也越來越多。
目前有一些專門針對組分IV中某一種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的報道，比如黃凱等人用尿素溶解組分IV，然后從中提取載脂蛋白Al (CN 101205250Α)，此方法中采用的尿素濃度可以高達(dá)6-8Μ，這可能會對組分IV中其它的組分造成潛在的破壞。
周燕翔等人米用Con A Sepharose 4Β以及DEAE Sepharose FF從組分IV中分離Ci1-抗胰蛋白酶(周雁翔，端義坤，李策生，彭良俊，張愛華，鄒漢武，低溫乙醇法分離正常人血漿組分IV沉淀中Ci1-抗胰蛋白酶的分離純化，中國生物制品學(xué)雜質(zhì)，2011，24: 1090-1093)。Coan等人采用PEG沉淀結(jié)合DEAE離子交換層析的方法從組分IV中提取 α f 抗膜蛋白酶(Coan MH, Brockway WJ, Eguizabal H, Krieg T, Fournel M. Preparation and properties of alpha1-proteinaseinhibitor concentrate from human plasma. Vox Sanguinis, 1985，48:333 - 342)。這些方法中要么采用了沉淀技術(shù)，要么采用親和層析技術(shù)，所使用的工藝與本發(fā)明不同。
Deutsch等人采用硫酸銨沉淀、DEAE層析以及乙醇-氯仿沉淀的工藝從組分IV 中提取銅藍(lán)蛋白(Deutsch HF, Kasper CB, Walsh DA, Papid method forpreparation of crystalline human ceruloplasmin from Cohn Fraction IV-1. Archives ofBiochemistry and Biophysics, 1962,99:132-135)。該工藝采用兩步沉淀，而且其中一步沉淀為含有氯仿的有機(jī)溶劑沉淀，對蛋白質(zhì)的破壞比較大。
目前也從組分IV同時提取多種蛋白的報道，處理過程包括先對組分IV進(jìn)行 PEG沉淀處理，然后再依次用疏水層析和離子交換層析處理，能夠得到的蛋白包括5種 (白高英，Cohn組分IV沉淀中血漿蛋白的分離工藝及過程自動化研究，2010，蘭州大學(xué)碩士生學(xué)位論文；Kong YJ, Li XN, Bai GY, Ma GH, SuZG. An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography, Journal of Chromatography A, 2010, 1217:6898-6904)。此方法中采用了蛋白損失率較高的沉淀步驟，而且所采用層析的順序也與本發(fā)明存在不同。
這些方法雖然能夠得到比較高純度的蛋白，但是往往具有如下缺點(diǎn)①在純化過程中往往不得不犧牲其它的蛋白質(zhì)組分，或者將其它的蛋白往往作為廢棄物丟棄了，這對于寶貴的血液資源也是一種浪費(fèi)；②這些方法包括超速離心法，沉淀法等等，處理量比較小，蛋白的損失比較多蛋白質(zhì)的收率比較低，純化步驟多，有的純化中還涉及有機(jī)溶劑或者變性劑，不利于蛋白質(zhì)活性的保持；④采用抗體或者抗體片段親和層析技術(shù)針對某種蛋白進(jìn)行純化，雖然效率比較高，但是由于親和介質(zhì)的價格比較貴而且穩(wěn)定性可能存在問題，所以僅適合實(shí)驗(yàn)室用，而不適合工業(yè)生產(chǎn)放大；
因此，本領(lǐng)域非常需要一種能夠充分利用組分IV中豐富而且寶貴的蛋白資源的方法。該方法的蛋白質(zhì)得率高，過程中不涉及有機(jī)溶劑和變性劑，容易放大適合工業(yè)生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施方式
來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
本發(fā)明旨在提供一種綜合利用組分IV的方法。該方法的蛋白質(zhì)得率高，過程中不涉及有機(jī)溶劑和變性劑，容易放大進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)。
為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
一種綜合利用組分IV的方法，其特征在于，所述方法包括步驟a :將Cohn低溫乙醇法獲得的組分IV溶液I溶解，分離沉淀，獲得上清I和沉淀I，將所述沉淀I溶液II溶解，分離沉淀，獲得上清II和沉淀II，再將所述沉淀II溶液III溶解，分離沉淀，獲得上清 III ;
其中，優(yōu)選地，所述溶液I為酸性緩沖溶液，pH值為優(yōu)選地3. 8-5. 2、更優(yōu)選地 4. 1-4. 8、最優(yōu)選地4. 3-4. 5，濃度為優(yōu)選地0. OIM-0. 5M、更優(yōu)選地0. 01-0. 2M、最優(yōu)選地 O. 02-0. 05M，所述溶液II為中性緩沖溶液，pH值為優(yōu)選地6. 0-7. 5、更優(yōu)選地6. 3-7. 2、最優(yōu)選地6. 5-7. 0，濃度為優(yōu)選地0. OIM-0. 5M、更優(yōu)選地0. 01-0. 2M、最優(yōu)選地0. 02-0. 05M和 /或所述溶液III為堿性緩沖溶液，PH值為優(yōu)選地8. 0-9. 5、更優(yōu)選地8. 3-9. 2、最優(yōu)選地 8. 5-9. O,濃度為優(yōu)選地0. OIM-0. 5M、更優(yōu)選地0. 01-0. 2M、最優(yōu)選地0. 02-0. 05M,且優(yōu)選地，所述酸性緩沖溶液的緩沖體系包括但不限于醋酸-醋酸鈉體系和檸檬酸-檸檬酸鈉體系、所述中性緩沖溶液的緩沖體系包括但不限于磷酸鹽緩沖體系和Tris-HCl緩沖體系和 /或所述堿性緩沖溶液的緩沖體系包括但不限于Tris-HCl緩沖體系和硼酸-硼砂緩沖體
優(yōu)選地，所述組分IV與所述溶液I、所述溶液II和所述溶液III的質(zhì)量比分別為 1:500-1:1，更優(yōu)選地 1:100-1:2，最優(yōu)選地 1:10-1:4，
優(yōu)選地，所述分離通過離心來進(jìn)行，
優(yōu)選地，所述步驟a在0-4 °C下進(jìn)行。
本發(fā)明的綜合利用組分IV的方法，所述方法還可包括步驟b :將上清I經(jīng)由離子交換層析柱分離，收集穿透峰，獲得組分A，之后用洗脫緩沖液I洗脫，獲得組分B，最后用洗8脫緩沖液II洗脫，獲得α 2-巨球蛋白，其中，分離過程中所用的平衡緩沖液為平衡緩沖液 I ;
其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液I的緩沖體系包括但不限于醋酸-醋酸鈉體系或者檸檬酸-檸檬酸鈉體系，pH值為3. 5-5. 2、優(yōu)選地3. 8-5. O、更優(yōu)選地4. 1-4. 9、最優(yōu)選地 4. 2-4. 6，濃度為 5-200mM、優(yōu)選地 lO-lOOmM、更優(yōu)選地 20_40mM，
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液I為在所述平衡緩沖液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、 NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液 I的鹽濃度為O. 05-0. 15M、優(yōu)選地O. 08-0. 12M、更優(yōu)選地O. 1M，
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液II為在所述平衡緩沖液I中加入包括但不限于NaCl、 KCl,NaBr,KBr和MgCl2，優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液II的鹽濃度為O. 18-0. 35M、優(yōu)選地O. 2-0. 3M、更優(yōu)選地O. 25M，
優(yōu)選地，所述離子交換層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、QSepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE 以及 Capto Q0
本發(fā)明的綜合利用組分IV的方法，所述方法還可包括步驟c :將上清II的pH值調(diào)節(jié)至所述平衡緩沖液I的PH值，經(jīng)由離子交換層析柱分離，收集穿透峰，獲得組分C，之后用所述洗脫緩沖液I洗脫，獲得組分D和根據(jù)610nm處的特征吸收收集的富含銅藍(lán)蛋白的組分E，最后用所述洗脫緩沖液II洗脫，獲得Ci2-巨球蛋白，其中，分離過程中所用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液I ;
其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液I的緩沖體系包括但不限于醋酸-醋酸鈉體系或者檸檬酸-檸檬酸鈉體系，pH值為3. 5-5. 2、優(yōu)選地3. 8-5. O、更優(yōu)選地4. 1-4. 9、最優(yōu)選地 4. 2-4. 6，濃度為 5-200mM、優(yōu)選地 lO-lOOmM、更優(yōu)選地 20_40mM，
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液I為在所述平衡緩沖液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、 NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液 I的鹽濃度為O. 05-0. 15M、優(yōu)選地O. 08-0. 12M、更優(yōu)選地O. 1M，
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液II為在所述平衡緩沖液I中加入包括但不限于NaCl、 KCl,NaBr,KBr和MgCl2，優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液II的鹽濃度為O. 18-0. 35M、優(yōu)選地O. 2-0. 3M、更優(yōu)選地O. 25M，
優(yōu)選地，所述離子交換層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、QSepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE 以及 Capto Q0
本發(fā)明的綜合利用組分IV的方法，所述方法還可包括步驟d :將上清III的pH值調(diào)節(jié)至所述平衡緩沖液I的PH值，經(jīng)由離子交換層析柱分離，收集穿透峰，獲得組分F，之后用所述洗脫緩沖液I洗脫，獲得組分G，最后用所述洗脫緩沖液II洗脫，獲得α 2-巨球蛋白，其中，分離過程中所用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液I ;
其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液I的緩沖體系包括但不限于醋酸-醋酸鈉體系或者檸檬酸-檸檬酸鈉體系，pH值為3. 5-5. 2、優(yōu)選地3. 8-5. O、更優(yōu)選地4. 1-4. 9、最優(yōu)選地4. 2-4. 6，濃度為 5-200mM、優(yōu)選地 lO-lOOmM、更優(yōu)選地 20_40mM，
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液I為在所述平衡緩沖液I中加入包括但不限于NaCl、KCl、 NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液 I的鹽濃度為O. 05-0. 15M、優(yōu)選地O. 08-0. 12M、更優(yōu)選地O. 1M，
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液II為在所述平衡緩沖液I中加入包括但不限于NaCl、 KCl,NaBr,KBr和MgCl2，優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液II的鹽濃度為O. 18-0. 35M、優(yōu)選地O. 2-0. 3M、更優(yōu)選地O. 25M，
優(yōu)選地，所述離子交換層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、QSepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE 以及 Capto Q0
本發(fā)明的綜合利用組分IV的方法，所述方法還可包括步驟e :將組分A、C、F或其組合的PH值調(diào)節(jié)至平衡緩沖液II的pH值，經(jīng)由離子交換層析柱分離，收集穿透峰，獲得免疫球蛋白，用洗脫緩沖液III洗脫獲得轉(zhuǎn)鐵蛋白，再用洗脫緩沖液IV洗脫獲得白蛋白和載脂蛋白Al的混合物，將所述白蛋白和載脂蛋白Al的混合物的鹽濃度調(diào)節(jié)至平衡緩沖液III 的鹽濃度，經(jīng)由疏水層析柱分離，用洗脫緩沖液V洗脫獲得白蛋白，再用洗脫緩沖液VI洗脫獲得載脂蛋白Al ;其中，離子交換層析柱分離過程中所用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液 II，疏水層析分離過程中所使用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液III ;
其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液II的緩沖體系包括但不限于磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl緩沖體系，pH值為6. 0-8. O、優(yōu)選地6. 5-7. 5M、更優(yōu)選地6. 8-7. 2M，濃度為 5-200mM、優(yōu)選地 10-100mM、更優(yōu)選地 20_40mM，
優(yōu)選地，所述平衡緩沖液III的緩沖體系包括但不限于磷酸-磷酸鹽或者 Tris-HCl緩沖體系，pH值為6. 0-8. O、優(yōu)選地6. 5-7. 5、更優(yōu)選地6. 8-7. 2，且所述平衡緩沖液 III 還含有包括但不限于(NH4)2S04、K2SO4, Na2SO4, NaH2PO4 和 Na2HPO4,優(yōu)選地(NH4)2S04、 K2SO4和Na2SO4，更優(yōu)選地(NH4)2SO4的另外的鹽，所述平衡緩沖液III的鹽濃度為I. 5-0. 8M， 優(yōu)選地I. 2-0. 8M，最優(yōu)選地1M，
優(yōu)選地,所述洗脫緩沖液III為在所述平衡緩沖液II中加入包括但不限于NaCl、 KCl、NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液III的鹽濃度為O. 05-0. 15M、優(yōu)選地O. 06-0. 14M、更優(yōu)選地O. 08-0. 12M,最優(yōu)選地 O. 1M,
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液IV為在所述平衡緩沖液II中加入包括但不限于NaCl、 KCl,NaBr,KBr和MgCl2，優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液IV的濃度為O. 15-0. 35M、優(yōu)選地O. 18-0. 3M、更優(yōu)選地O. 20-0. 28M，最優(yōu)選地O. 25M，
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液V與所述平衡緩沖液III相同，且所述洗脫緩沖液V的鹽濃度為0. 25-0. 8M、優(yōu)選地0. 3-0. 6M、最優(yōu)選地0. 4-0. 5M,
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液VI與所述平衡緩沖液III相同，且所述洗脫緩沖液VI的鹽濃度為0-0. 2M、優(yōu)選地0. 01-0. 1M、最優(yōu)選地0. 02-0. 05M,
優(yōu)選地，所述離子交換層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、QSepharose FF、ANXSepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE 以及 Capto Q,
優(yōu)選地，所述疏水層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基、辛集以及苯基瓊脂糖介質(zhì)，GE公司的Butyl Sepharose FF>OctyISepharose FF、Phenyl Sepharose FF high sub 或者 Phenyl Sepharose FF low sub。
本發(fā)明的綜合利用組分IV的方法，所述方法還可包括步驟f :分別將組分B、D和 G的pH值和鹽濃度分別調(diào)節(jié)至平衡緩沖液III的pH值和鹽濃度，經(jīng)由疏水層析柱分離，用洗脫緩沖液VII洗脫組分B、D和G均獲得結(jié)合珠蛋白，再用洗脫緩沖液VIII洗脫，分別獲得a i-抗胰蛋白酶，組分H和組分I，其中，疏水層析分離過程中所用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液III ;
其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液III的緩沖體系包括但不限于磷酸-磷酸鹽或者 Tris-HCl緩沖體系，pH值為6. 0-8. O、優(yōu)選地6. 5-7. 5、更優(yōu)選地6. 8-7. 2，且所述平衡緩沖液 III 還含有包括但不限于(NH4)2S04、K2SO4, Na2SO4, NaH2PO4 和 Na2HPO4,優(yōu)選地(NH4)2S04、 K2SO4和Na2SO4，更優(yōu)選地(NH4)2SO4的另外的鹽，所述平衡緩沖液III的鹽濃度為I. 5-0. 8M， 優(yōu)選地I. 2-0. 8M，最優(yōu)選地1M，
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液VII與所述平衡緩沖液III相同，且所述洗脫緩沖液VII 的鹽濃度為O. 6-0. 9M、優(yōu)選地O. 75-0. 85M、最優(yōu)選地O. 8M，
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液VIII與所述平衡緩沖液III相同，且所述洗脫緩沖液 VIII的鹽濃度為0-0. 6M、優(yōu)選地O. 01-0. 4M、更優(yōu)選地O. 02-0. 1M，最優(yōu)選地O. 05M,
優(yōu)選地，所述疏水層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基、辛集以及苯基瓊脂糖介質(zhì)，GE公司的Butyl Sepharose FF>OctyISepharose FF、Phenyl Sepharose FF high sub 或者 Phenyl Sepharose FF low sub。
本發(fā)明的綜合利用組分IV的方法，所述方法還可包括步驟g :將組分D、H或其組合的PH值和鹽濃度分別調(diào)節(jié)至平衡緩沖液II的pH值和鹽濃度，經(jīng)由親和層析柱分離，用洗脫緩沖液IX洗脫去除雜質(zhì)，再用洗脫緩沖液X洗脫獲得抗凝血酶III，其中親和層析分離過程中使用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液IV ；
其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液IV的緩沖體系包括但不限于磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl緩沖體系，pH值為6. 0-8. O、優(yōu)選地6. 5-7. 5M、更優(yōu)選地6. 8-7. 2M，濃度為 5-200mM、優(yōu)選地 10-100mM、更優(yōu)選地 20_40mM，
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液IX為在所述平衡緩沖液IV中加入包括但不限于NaCl、 KCl,NaBr,KBr和MgCl2，優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液III的鹽濃度為O. 05-0. 25M、優(yōu)選地O. 1-0. 2M、更優(yōu)選地O. 15M，
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液IX為在所述平衡緩沖液IV中加入包括但不限于NaCl、 KCl,NaBr,KBr和MgCl2，優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液III的鹽的度為O. 4-0. 6M、優(yōu)選地O. 45-0. 55M、更優(yōu)選地O. 5M，
優(yōu)選地，所述親和層析介質(zhì)包括但是不限于過程所生產(chǎn)的肝素瓊脂糖介質(zhì)以及GE 公司的 heparin Sepharose FF0
本發(fā)明的綜合利用組分IV的方法，所述方法還可包括步驟h :將組分E的pH值和鹽濃度分別調(diào)節(jié)至平衡緩沖液III的PH值和鹽濃度，經(jīng)由疏水層析柱分離，用洗脫緩沖液VII洗脫獲得富含銅藍(lán)蛋白的組分，將所述富含銅藍(lán)蛋白的組分用超濾膜濃縮，之后用凝膠過濾層析柱分離，按照紫外信號收集洗脫峰，獲得銅藍(lán)蛋白，其中，疏水層析分離過程中所用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液III，凝膠過濾層析分離過程中所用的平衡緩沖液為緩沖液V ;
其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液III的緩沖體系包括但不限于磷酸-磷酸鹽或者 Tris-HCl緩沖體系，pH值為6. 0-8. O、優(yōu)選地6. 5-7. 5、更優(yōu)選地6. 8-7. 2，且所述平衡緩沖液 III 還含有包括但不限于(NH4)2S04、K2SO4, Na2SO4, NaH2PO4 和 Na2HPO4,優(yōu)選地(NH4)2S04、 K2SO4和Na2SO4，更優(yōu)選地(NH4)2SO4的另外的鹽，所述平衡緩沖液III的鹽濃度為I. 5-0. 8M， 優(yōu)選地I. 2-0. 8M，最優(yōu)選地1M，
優(yōu)選地,所述平衡緩沖液V的緩沖體系包括但不限于磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl 體系，pH值為5. 5-9. 9，優(yōu)選地6. 0-8. O、更優(yōu)選地6. 5-7. 5、最優(yōu)選地6. 8-7. 2且所述平衡緩沖液IV還含有包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2，優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr， 更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述平衡緩沖液IV的鹽濃度為O. 05-0. 4M，優(yōu)選地O. 1-0. 25M， 更優(yōu)選地O. 15-0. 2M，
優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液VII與平衡緩沖液III相同，但其中所述另外的鹽的濃度為 O. 6-0. 9M、優(yōu)選地 O. 75-0. 85M、最優(yōu)選地 O. 8M,
優(yōu)選地，所述疏水層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基、辛集以及苯基瓊脂糖介質(zhì)，GE公司的Butyl Sepharose FF>OctyISepharose FF、Phenyl Sepharose FF high sub 或者 Phenyl Sepharose FF low sub,
優(yōu)選地，所述凝膠過濾層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的快球速瓊脂糖介質(zhì)和魔芋葡糖聚糖介質(zhì)以及GE公司Sepharose 6FF、Superdex75、 Superdex200> Sephadex G 75、Sephacryl 200HR 和 SephadexGl50,
優(yōu)選地，所述超濾膜為截留分子為Ι-lOOkDa、優(yōu)選地5_30kDa、更優(yōu)選地IOkDa的膜包。
本發(fā)明的綜合利用組分IV的方法，所述方法還可包括步驟i :將組分G、I或其組合的PH值和鹽濃度分別調(diào)節(jié)至平衡緩沖液VI的pH值和鹽濃度，經(jīng)由離子交換層析柱分離，收集穿透峰獲得C I酯酶抑制劑；
其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液VI的緩沖體系包括但不限于醋酸-醋酸鈉體系或者檸檬酸-檸檬酸鈉體系，pH值為3. 0-3. 8、優(yōu)選地3. 2-3. 6、更優(yōu)選地3. 4，濃度為 5-200mM、優(yōu)選地 10-100mM、更優(yōu)選地為 20_40mM，
優(yōu)選地，所述離子交換層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、QSepharose FF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE 以及 Capto Q0
本發(fā)明的綜合利用組分IV的方法，在步驟a之后和步驟b_i之前可進(jìn)行步驟j 分別將所述步驟a中的上清I、II、III離心除去助濾劑，之后用微濾膜過濾；
其中，所述離心的離心速度為優(yōu)選地5000-1000rpm,更優(yōu)選地6000-8000rpm,所述離心的離心時間為優(yōu)選地10_60min,更優(yōu)選地30_45min ；
所述微濾膜的孔徑為優(yōu)選地O. 1-1. Oym,更優(yōu)選地O. 45 μ m。
Cohn組分IV是指按照Cohn等人的冷乙醇沉淀法分離血衆(zhòng)蛋白時獲得的沉淀組分 IV，其含有多種有藥用價值的血漿蛋白。


圖I本發(fā)明的工藝生產(chǎn)流程圖。
圖2上清I、II和III的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。
其中I為marker，2為上清1，3為上清11，4為上清III。
圖3上清I的離子交換層析譜圖，其中橫坐標(biāo)為洗脫體積，左側(cè)縱坐標(biāo)為280nm處的吸光度，右側(cè)縱坐標(biāo)為電導(dǎo)率。
圖4上清I在離子交換層析上洗脫峰的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖，其中I為marker， 2為圖3中的Pl峰，3為圖3中的P2峰，4為圖3中的P3峰，5為圖3中的P4峰。
圖5中試得到產(chǎn)品的SDS-PAGE電泳結(jié)果，其中I和5為marker, 2為IgG, 3為轉(zhuǎn)鐵蛋白，4為白蛋白，6為結(jié)合·珠蛋白，7為a r抗胰蛋白酶。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供的綜合利用組分IV的方法見附圖I的流程圖。其純化工藝由以下幾個步驟組成。
(I)組分IV沉淀的溶解
本專利所采用的原料是人血漿經(jīng)Cohn低溫冷乙醇沉淀法得到的沉淀，沉淀采用壓濾法得到，吸附于珍珠巖等助濾劑上。將組分IV先用酸性的緩沖溶液溶解，離心分離沉淀，得到的上清作為物料I ;再將沉淀中性的緩沖溶液溶解，離心分離沉淀，得到的上清作為物料II，其中富含銅藍(lán)蛋白和抗凝血酶III;在將沉淀用堿性的緩沖溶液溶解，離心分離沉淀，得到的上清作為物料III，其中富含Cl酯酶抑制劑。
所使用酸性緩沖液可以是醋酸-醋酸鈉緩沖液，也可以是檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。溶液的PH值為3.8-5. 2，優(yōu)選地4. 1-4. 8，最優(yōu)選地4. 3-4. 5。緩沖液濃度為O. OIM-0. 5M，優(yōu)選地O. 01-0. 2M，最優(yōu)選地O. 02-0. 05M。組分IV與緩沖液的質(zhì)量比為 1:500-1:1，優(yōu)選地 1:100-1:2，最優(yōu)選地 1:10-1:4。
所使用中性緩沖液可以是磷酸鹽緩沖體系，也可以是Tris-HCl緩沖體系。溶液的pH值為6. 0-7. 5，優(yōu)選地6. 3-7. 2，最優(yōu)選地6. 5-7. O。緩沖液濃度為O. OIM-0. 5M，優(yōu)選地O. 01-0. 2M，最優(yōu)選地O. 02-0. 05M。組分IV與緩沖液的質(zhì)量比為1:500-1: 1，優(yōu)選地 1:100-1:2，最優(yōu)選地 1:10-1:4。
所使用堿性緩沖液可以是Tris-HCl體系，也可以是硼酸-硼砂緩沖體系。溶液的PH值為8. 0-9. 5，優(yōu)選地8. 3-9. 2，最優(yōu)選地8. 5-9. O。緩沖液濃度為O. OIM-0. 5M，優(yōu)選地O. 01-0. 2M，最優(yōu)選地O. 02-0. 05M。組分IV與緩沖液的質(zhì)量比為1:500-1: 1，優(yōu)選地 1:100-1:2，最優(yōu)選地 1:10-1:4。
在另一優(yōu)選地例中，組分IV的溶解操作在0-4度條件下進(jìn)行。
在另一優(yōu)選地例中，組分IV的溶出物首先采用離心出去助濾劑，然后用微濾膜過濾。離心速度為5000-1000rpm,離心時間為10-60min,離心速度更優(yōu)選地為6000-8000rpm, 離心時間更優(yōu)選地為30-45min。微濾膜孔徑為O. 1-1. 0m，更優(yōu)選地為O. 45m濾膜。所得到的上清用于后續(xù)的層析處理。
(2)離子交換層析對組分的初步分離
將物料I上到離子交換層析柱上，通過對平衡緩沖液的控制白蛋白、免疫球蛋白、 轉(zhuǎn)鐵蛋白以及載脂蛋白Al在不會吸附在層析柱上，收集此穿透峰(FractionA)，而結(jié)合珠蛋白、Ci1-抗胰蛋白酶和Ci2-巨球蛋白則會吸附到層析介質(zhì)上。再用洗脫緩沖液I將結(jié)合珠蛋白和Q1-抗胰蛋白酶洗脫下來，收集此洗脫峰(Fraction B)，接著再用洗脫緩沖液II 將α2-巨球蛋白洗脫下來，得到Ci2-巨球蛋白的純品。
所使用的離子交換層析介質(zhì)可以是中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及 Q 瓊脂糖介質(zhì)，或者 GE 公司的 DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、Q SepharoseXL、Capto DEAE 以及 Capto Q 等等。 優(yōu)選地中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub。更優(yōu)選地選擇中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF介質(zhì)。
平衡緩沖液為醋酸-醋酸鈉體系或者檸檬酸-檸檬酸鈉體系。緩沖液pH為 3. 5-5. 2，優(yōu)選地3. 8-5. O,更優(yōu)選地為4. 2-4. 6。緩沖液濃度為5_200mM，優(yōu)選地IO-IOOmM, 更優(yōu)選地為20-40mM。
洗脫緩沖液與平衡緩沖液相同，但是其中含有一定濃度的鹽類。所含的鹽類為 NaCl、KCl、NaBr、KBr、MgCl2，優(yōu)選地 NaCl、KCl、NaBr，更優(yōu)選地為 NaCl。第一步洗脫的鹽濃度為0.05-0. 1511，優(yōu)選地0.08-0. 12，更優(yōu)選地為O. 1M。第二個階梯洗脫的鹽濃度為 O. 18-0. 35M，優(yōu)選地 O. 2-0. 3M，最優(yōu)選地 O. 25M。
將物料II的pH調(diào)節(jié)到與平衡緩沖液的pH值一致，然后上到離子交換層析柱上， 通過對平衡緩沖液的控制白蛋白、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及載脂蛋白Al在不會吸附在層析柱上，收集此穿透峰(Fraction C),而結(jié)合珠蛋白、Ct1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白和抗凝血酶III則會吸附到層析介質(zhì)上。再用洗脫緩沖液I將結(jié)合珠蛋白、a i-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III洗脫下來,收集此洗脫峰(Fraction D),洗脫時根據(jù)610nm處的特征吸收收集富含銅藍(lán)蛋白的組分(Fraction E)，接著再用洗脫緩沖液II將α 2-巨球蛋白洗脫下來，得到 α2_巨球蛋白的純品。
所使用的離子交換層析介質(zhì)可以是中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及 Q 瓊脂糖介質(zhì)，或者 GE 公司的 DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、Q SepharoseXL、Capto DEAE 以及 Capto Q 等等。 優(yōu)選地中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub。更優(yōu)選地選擇中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF介質(zhì)。
平衡緩沖液為醋酸-醋酸鈉體系或者檸檬酸-檸檬酸鈉體系。緩沖液pH為 3. 5-5. 2，優(yōu)選地3. 8-5. O,更優(yōu)選地為4. 2-4. 6。緩沖液濃度為5_200mM，優(yōu)選地IO-IOOmM, 更優(yōu)選地為20-40mM。
洗脫緩沖液與平衡緩沖液相同，但是其中含有一定濃度的鹽類。所含的鹽類為 NaCl、KCl、NaBr、KBr、MgCl2，優(yōu)選地 NaCl、KCl、NaBr，更優(yōu)選地為 NaCl。第一步洗脫的鹽濃度為0.05-0. 1511，優(yōu)選地0.08-0. 12，更優(yōu)選地為O. 1M。第二個階梯洗脫的鹽濃度為 O. 18-0. 35M，優(yōu)選地 O. 2-0. 3M，最優(yōu)選地 O. 25M。
將物料III的pH調(diào)節(jié)到與平衡緩沖液的pH值一致，然后上到離子交換層析柱上， 通過對平衡緩沖液的控制白蛋白、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及載脂蛋白Al在不會吸附在層析柱上，收集此穿透峰(Fraction F),而結(jié)合珠蛋白、Ct1-抗胰蛋白酶、α 2-巨球蛋白和Cl 酯酶抑制劑則會吸附到層析介質(zhì)上。再用洗脫緩沖液I將結(jié)合珠蛋白、α「抗胰蛋白酶、Cl 酯酶抑制劑洗脫下來，收集此洗脫峰(Fraction G)，接著再用洗脫緩沖液II將α 2_巨球蛋白洗脫下來，得到α2-巨球蛋白的純品。
所使用的離子交換層析介質(zhì)可以是中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及 Q 瓊脂糖介質(zhì)，或者 GE 公司的 DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、Q SepharoseXL、Capto DEAE 以及 Capto Q 等等。 優(yōu)選地中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub。更優(yōu)選地選擇中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF介質(zhì)。
平衡緩沖液為醋酸-醋酸鈉體系或者檸檬酸-檸檬酸鈉體系。緩沖液pH為 3. 5-5. 2，優(yōu)選地3. 8-5. O,更優(yōu)選地為4. 2-4. 6。緩沖液濃度為5_200mM，優(yōu)選地IO-IOOmM, 更優(yōu)選地為20-40mM。
洗脫緩沖液與平衡緩沖液相同，但是其中含有一定濃度的鹽類。所含的鹽類為 NaCl、KCl、NaBr、KBr、MgCl2，優(yōu)選地 NaCl、KCl、NaBr，更優(yōu)選地為 NaCl。第一步洗脫的鹽濃度為0.05-0. 1511，優(yōu)選地0.08-0. 12，更優(yōu)選地為O. 1M。第二個階梯洗脫的鹽濃度為 O. 18-0. 35M，優(yōu)選地 O. 2-0. 3M，最優(yōu)選地 O. 25M。
(3)人血清白蛋白、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和載脂蛋白Al的純化
調(diào)節(jié)FractionA或D或F的pH值與平衡緩沖液的pH值一致,然后上到陰離子交換層析介質(zhì)上，收集穿透峰，其中所含蛋白為IgG。再用洗脫緩沖液洗脫得到轉(zhuǎn)鐵蛋白。在提高鹽濃度洗脫的到白蛋白和載脂蛋白Al。將白蛋白和載脂蛋白Al的混合物的鹽濃度調(diào)節(jié)到與疏水層析平衡緩沖液的鹽濃度一致，然后降低洗脫緩沖液的鹽濃度進(jìn)行洗脫，得到白蛋白，再進(jìn)一步降低洗脫緩沖液的鹽濃度得到載脂蛋白Al。
所使用的離子交換層析介質(zhì)可以是中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及 Q 瓊脂糖介質(zhì)，或者 GE 公司的 DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、Q SepharoseXL、Capto DEAE 以及 Capto Q 等等。 優(yōu)選地中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub。更優(yōu)選地選擇中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF介質(zhì)。
離子交換層析平衡緩沖液為磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl體系。緩沖液pH為6.0-8. 0，優(yōu)選地6. 5-7. 5，更優(yōu)選地為6. 8-7. 2。緩沖液濃度為5_200mM，優(yōu)選地IO-IOOmM, 更優(yōu)選地為20-40mM。
洗脫緩沖液與平衡緩沖液相同，但是其中含有一定濃度的鹽類。所含的鹽類為 NaCl、KCl、NaBr、KBr、MgCl2，優(yōu)選地 NaCl、KCl、NaBr，更優(yōu)選地為 NaCl。第一步洗脫的鹽濃度為0.05-0. 1511，優(yōu)選地0.08-0. 12，更優(yōu)選地為O. 1M。第二個階梯洗脫的鹽濃度為 O. 18-0. 35M，優(yōu)選地 O. 2-0. 3M，更優(yōu)選地為 O. 25M。
疏水介質(zhì)為中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基、辛基以及苯基瓊脂糖介質(zhì)，也可以是GE 公司的Butyl Sepharose FF、0ctyl Sepharose FF、PhenylS印harose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。優(yōu)選地中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的辛基以及苯基瓊脂糖介質(zhì)，也可以是GE公司的PhenylSepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。更優(yōu)選地為中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的苯基瓊脂糖介質(zhì), 也可以是 GE 公司的 Phenyl SepharoseFF high sub。
疏水層析平衡緩沖液為磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl體系。緩沖液pH為6. 0-8. 0， 優(yōu)選地6. 5-7. 5，更優(yōu)選地為6. 8-7. 2。其中含有較高濃度的鹽類。鹽為為(NH4)2SO4、 K2SO4, Na2SO4, NaH2PO4, Na2HPO4,優(yōu)選地(NH4)2SO4, K2SO4, Na2SO4,更優(yōu)選地為(NH4)2SO40 鹽濃度為I. 5-0. 8M，優(yōu)選地I. 2-0. 8M，最優(yōu)選地1M。第一步洗脫鹽濃度為O. 6-0. 25M，優(yōu)選地O. 3-0. 5M，最優(yōu)選地為O. 4M。第二部洗脫鹽濃度為0-0. 2M，優(yōu)選地O. 01-0. 1M，最優(yōu)選地 O. 02-0. 05M。
(4)結(jié)合珠蛋白和Ci1-抗胰蛋白酶的純化
調(diào)節(jié)Fraction B的pH值和鹽濃度與疏水層析的平衡緩沖液一致，然后上到疏水層析柱上，降低鹽濃度洗脫得到結(jié)合珠蛋白，在進(jìn)一步降低鹽濃度洗脫可以得到Ci1-抗胰蛋白酶。對于Fraction D按此工藝處理也可以得到結(jié)合珠蛋白純品以及Ci1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶III的混合物(Fraction H)。對于Fraction G按此工藝處理可以得到結(jié)合珠蛋白純品以及α廠抗胰蛋白酶和Cl酯酶抑制劑的混合物(Fraction I)。
疏水介質(zhì)為中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基、辛基以及苯基瓊脂糖介質(zhì)， 也可以是GE 公司的Butyl Sepharose FF、0ctyl Sepharose FF>PhenyISepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。優(yōu)選地中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基或者辛基介質(zhì)，也可以是GE公司的Butyl SepharoseFF>Octyl Sepharose FF。更優(yōu)選地為中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基瓊脂糖介質(zhì)，也可以是GE公司的Butyl Sepahrose FF high sub ο
疏水層析平衡緩沖液為磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl體系。緩沖液pH為6. 0-8. 0， 優(yōu)選地6. 5-7. 5，更優(yōu)選地為6. 8-7. 2。其中含有較高濃度的鹽類。鹽為為(NH4)2SO4、 K2SO4, Na2SO4, NaH2PO4, Na2HPO4,優(yōu)選地(NH4)2SO4, K2SO4, Na2SO4,更優(yōu)選地為(NH4)2SO40 鹽濃度為I. 5-0. 8M，優(yōu)選地I. 2-0. 8M，最優(yōu)選地1M。第一步洗脫鹽濃度為O. 9-0. 6M，優(yōu)選地 O. 85-0. 75M，最優(yōu)選地為O. 8M。第二部洗脫鹽濃度為0-0. 6M，優(yōu)選地O. 01-0. 4M，最優(yōu)選地 O. 02-0. IM0
(5)抗凝血酶111的純化
調(diào)節(jié)Fraction D或者H的pH值和鹽濃度與平衡緩沖液一致，然后上到親和層析柱上，提高鹽濃度洗脫去除雜質(zhì)，再進(jìn)一步提高鹽濃度洗脫得到抗凝血酶III純品。
所用親和層析介質(zhì)為中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的肝素親和瓊脂糖介質(zhì)，也可以是 GE 公司的 heparin Sepharose FF。
親和層析的平衡緩沖液為磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl體系。緩沖液pH為6.0-8. 0，優(yōu)選地6. 5-7. 5，更優(yōu)選地為6. 8-7. 2。緩沖液濃度為5_200mM，優(yōu)選地IO-IOOmM, 更優(yōu)選地為20-40mM。
洗脫緩沖液與平衡緩沖液相同，但是其中含有一定濃度的鹽類。所含的鹽類為恥(1、1((1、似81'、1 1'、]\%(12，優(yōu)選地恥(1、1((1、似81'，更優(yōu)選地為恥(1。第一步洗脫的鹽濃度為O. 05-0. 25M，優(yōu)選地O. 1-0. 2，更優(yōu)選地為O. 15M。第二個階梯洗脫的鹽濃度為O. 4-0. 6M， 優(yōu)選地O. 45-0. 55M,更優(yōu)選地為O. 5M。
(6)銅藍(lán)蛋白的純化
調(diào)節(jié)Fraction E的pH值與鹽濃度與疏水層析的平衡緩沖液一致，然后上到疏水層析柱中。然后減低鹽濃度洗脫得到富含銅藍(lán)蛋白的組分，在進(jìn)一步降低鹽濃度洗脫洗去其它雜質(zhì)。將得到的富含銅藍(lán)蛋白的組分用超濾膜進(jìn)行濃縮，然后上到凝膠過濾層析柱上進(jìn)行分離，按照紫外信號收集洗脫峰，可以得到銅藍(lán)蛋白的純品。
疏水介質(zhì)為中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基、辛基以及苯基瓊脂糖介質(zhì)， 也可以是GE 公司的Butyl Sepharose FF、0ctyl Sepharose FF>PhenyISepharose FF high sub或者Phenyl Sepharose FF low sub。優(yōu)選地中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基或者辛基介質(zhì)，也可以是GE公司的Butyl SepharoseFF>Octyl Sepharose FF。更優(yōu)選地為中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基瓊脂糖介質(zhì)，也可以是GE公司的Butyl Sepahrose FF high sub ο
疏水層析平衡緩沖液為磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl體系。緩沖液pH為6. 0-8. 0， 優(yōu)選地6. 5-7. 5，更優(yōu)選地為6. 8-7. 2。其中含有較高濃度的鹽類。鹽為為(NH4)2SO4、 K2SO4, Na2SO4, NaH2PO4, Na2HPO4,優(yōu)選地(NH4)2SO4, K2SO4, Na2SO4,更優(yōu)選地為(NH4)2SO40 鹽濃度為I. 5-0. 8M，優(yōu)選地I. 2-0. 8M，最優(yōu)選地1M。第一步洗脫鹽濃度為O. 9-0. 6M，優(yōu)選地 O. 85-0. 75M，最優(yōu)選地為O. 8M。第二部洗脫鹽濃度為0-0. 6M，優(yōu)選地O. 01-0. 4M，最優(yōu)選地 O. 02-0. IM0
超濾過程可以選擇截留分子為I-IOOkDa的膜包進(jìn)行濃縮，優(yōu)選地截留分子量為 5-30kDa的膜包進(jìn)行濃縮，更優(yōu)選地選擇截留分子量為IOkDa的膜包。
中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的快球速瓊脂糖介質(zhì)和魔芋葡糖聚糖介質(zhì)以及 GE 公司 Sepharose 6FF、Superdex75、Superdex200、Sephadex G 75>Sephacryl 200HR 以及 Sephadex G150。優(yōu)選地中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的快球速瓊脂糖介質(zhì)和魔芋葡糖聚糖介質(zhì)以及GE公司Sepharose 6FF、Superdex200、以及Sephacryl 200HR,最優(yōu)選地選擇中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的快球速瓊脂糖介質(zhì)和魔芋葡糖聚糖介質(zhì)以及GE公司的 Sepharose 6FF 或者 Superdex200。
凝膠過濾層析的緩沖液為磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl體系。緩沖液pH為6.0-8. O，優(yōu)選地6. 5-7. 5，更優(yōu)選地為6. 8-7. 2。其中含有一定濃度的鹽類。鹽可以為NaCl、 KCl、NaBr、KBr、MgCl2，優(yōu)選地 NaCl、KCl、NaBr，更優(yōu)選地為 NaCl。鹽濃度為 O. 05-0. 25M，優(yōu)選地O. 1-0. 2，更優(yōu)選地為O. 15M。
(7) Cl酯酶抑制劑的純化
調(diào)節(jié)Fraction G或者I的pH值和鹽濃度和洗脫緩沖液的鹽濃度一致，然后上到離子交換層析柱上，收集穿透峰為Cl酯酶抑制劑純品。再用洗脫峰洗去層析介質(zhì)上吸附的其它雜質(zhì)。
所使用的離子交換層析介質(zhì)可以是中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及 Q 瓊脂糖介質(zhì)，或者 GE 公司的 DEAE Sepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、Q SepharoseXL、Capto DEAE 以及 Capto Q 等等。 優(yōu)選地中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAESepharose FF、Q SepharoseFF、ANX Sepharose FF high sub。更優(yōu)選地選擇中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的DEAE以及Q瓊脂糖介質(zhì)，或者GE公司的DEAE Sepharose FF介質(zhì)。
平衡緩沖液為醋酸-醋酸鈉體系或者檸檬酸-檸檬酸鈉體系。緩沖液pH為 3. 0-3. 8，優(yōu)選地3. 2-3. 6，更優(yōu)選地為3. 4。緩沖液濃度為5_200mM，優(yōu)選地lO-lOOmM，更優(yōu)選地為20-40mM。
洗脫緩沖液與平衡緩沖液相同，但是其中含有一定濃度的鹽類。所含的鹽類為 NaCl、KCl、NaBr、KBr、MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl、NaBr，更優(yōu)選地為NaCl。洗脫液的鹽濃度為 O. 1-2M，優(yōu)選地O. 5-1. 5，更優(yōu)選地為I. OM0
實(shí)施例I
組分IV的溶解過程
稱取5g組分IV，加入20mL pH4. 4的醋酸-醋酸鈉緩沖液，用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，在冰箱中放置4h，然后取出。在5000rpm條件下進(jìn)行離心，離心30min。分離上清和沉淀，得到上清I。將此沉淀再用20mL pH7. 2的磷酸鹽緩沖液溶解，用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌， 在冰箱中放置4h，然后取出。在5000rpm條件下進(jìn)行離心，離心30min。分離上清和沉淀， 得到上清II。再將此沉淀再用50mL pH9. 5的Tris-HCl緩沖液溶解，用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，在冰箱中放置4h，然后取出。在5000rpm條件下進(jìn)行離心，離心30min。分離上清和沉淀，得到上清III。
將上清I、II和III用SDS-PAGE進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。可以看出上清I中含有人血清白蛋白、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、結(jié)合珠蛋白、α2-巨球蛋白、Ci1-抗胰蛋白酶和載脂蛋白Al。而上清II中除了 I中含有的組分外，還富含銅藍(lán)蛋白和抗凝血酶III，上清 III中除了 I中含有的組分外，還富含Cl酯酶抑制劑。
實(shí)施例2
制備血清白蛋白、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、結(jié)合珠蛋白、載脂蛋白Al、α2-巨球蛋白、a i-抗胰蛋白酶
將中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的DEAE快流速瓊脂糖介質(zhì)裝柱，柱子大小為 7. 0*1. 6cm I. D.。柱子首先用20mM醋酸-醋酸鈉，pH4. 4緩沖溶液進(jìn)行平衡，平衡10個柱體積。平衡后進(jìn)料IOmL上清I，進(jìn)料流速為I. 5mL/min，進(jìn)料結(jié)束以后用平衡緩沖液淋洗， 淋洗流速為I. 5mL/min，收集穿透峰I。然后用20mM醋酸-醋酸鈉，pH4. 4，含O. IM NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰I。再用20mM醋酸-醋酸鈉，pH4. 4，含O. 2M NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰2。此洗脫峰中主要含有Ci2-巨球蛋白。層析譜圖如圖3所示。各洗脫峰的SDS-PAGE分析如圖4所示。
調(diào)節(jié)將穿透峰的pH至7. 0，然后用20mM PB, pH7. 2的緩沖溶液平衡此DEAE層析柱，平衡10個柱體積。平很厚開始進(jìn)料，進(jìn)料流速為I. 5mL/min，進(jìn)料結(jié)束以后用平衡緩沖液淋洗，淋洗流速為I. 5mL/min，收集穿透峰2。然后用20mM PB，pH7. 2，含O. IM NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰3，其中主要含有轉(zhuǎn)鐵蛋白。再用20mM PB，pH7. 2，含O. 2M NaCl 的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰4，其中含有白蛋白和載脂蛋白Al。
用中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的苯基快流速瓊脂糖介質(zhì)裝柱，柱子大小為7.0*1. 6cm I. D.。柱子首先用20mM PB, pH7. 2，含有IM硫酸銨的緩沖溶液進(jìn)行平衡，平衡 10個柱體積。再將洗脫峰4的電導(dǎo)率調(diào)節(jié)至于平衡緩沖液相同。然后開始進(jìn)料，進(jìn)料流速為I. 5mL/min，無穿透峰。然后用20mM PB, pH7. 2，含有O. 4M硫酸銨的緩沖溶液進(jìn)行洗脫， 得到白蛋白，最后用水洗，得到載脂蛋白Al。
用中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基快流速瓊脂糖介質(zhì)裝柱，柱子大小為 7. 0*1. 6cm I. D.。柱子首先用20mM PB, pH7. 2，含有IM硫酸銨的緩沖溶液進(jìn)行平衡，平衡 10個柱體積。再將洗脫峰2的電導(dǎo)率調(diào)節(jié)至于平衡緩沖液相同。然后開始進(jìn)料，進(jìn)料流速為I. 5mL/min，無穿透峰。然后用20mM PB, pH7. 2，含有O. 8M硫酸銨的緩沖溶液進(jìn)行洗脫， 得到結(jié)合珠蛋白，再用20mMPB，pH7. 2洗脫，得到α「抗胰蛋白酶。
實(shí)施例3
制備抗凝血酶III
將中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的DEAE快流速瓊脂糖介質(zhì)裝柱，柱子大小為7.0*1. 6cm I. D.。柱子首先用20mM醋酸-醋酸鈉，pH4. 4緩沖溶液進(jìn)行平衡，平衡10個柱體積。調(diào)節(jié)上清II的pH值至4. 4，平衡后進(jìn)料IOmL上清II，進(jìn)料流速為I. 5mL/min,進(jìn)料結(jié)束以后用平衡緩沖液淋洗，淋洗流速為I. 5mL/min，得到穿透峰。然后用20mM醋酸-醋酸鈉，pH4. 4，含O. IM NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，此洗脫峰中富含抗凝血酶III。
用中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基快流速瓊脂糖介質(zhì)裝柱，柱子大小為 7. 0*1. 6cm I. D.。柱子首先用20mM PB, pH7. 2，含有IM硫酸銨的緩沖溶液進(jìn)行平衡，平衡 10個柱體積。調(diào)節(jié)富含抗凝血酶III的物料pH值和鹽濃度與平衡緩沖液一致。然后開始進(jìn)料，進(jìn)料流速為I. 5mL/min，無穿透峰。然后用20mM PB, pH7. 2，含有O. 8M硫酸銨的緩沖溶液進(jìn)行洗脫，得到結(jié)合珠蛋白，再用20mM PB，pH7.2洗脫，得到Ci1-抗胰蛋白酶和抗凝血酶III的混合物。
將此混合物用進(jìn)一步上到肝素親和層析柱上。用中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的肝素親和快流速瓊脂糖介質(zhì)裝柱，柱子大小為7. 0*1. 6cm I.D.。柱子首先用20mM PB， pH7. 2的緩沖液平衡，平衡10個柱體積，然后開始進(jìn)料。首先用20mM PB，pH7. 2，含有O. 23M NaCl的緩沖液洗脫，洗去其中a i-抗胰蛋白酶，然后再用20mM PB, pH7. 2，含有I. OM NaCl 的緩沖液洗脫得到抗凝血酶III的純品。
實(shí)施例4
制備銅藍(lán)蛋白
將中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的DEAE快流速瓊脂糖介質(zhì)裝柱，柱子大小為 7. 0*1. 6cm I. D.。柱子首先用20mM醋酸-醋酸鈉，pH4. 4緩沖溶液進(jìn)行平衡，平衡10個柱體積。調(diào)節(jié)上清II的pH值至4. 4，平衡后進(jìn)料IOmL上清II，進(jìn)料流速為I. 5mL/min，進(jìn)料結(jié)束以后用平衡緩沖液淋洗，淋洗流速為I. 5mL/min，得到穿透峰。然后用20mM醋酸-醋酸鈉，pH4. 4，含O. IM NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，根據(jù)610nm出吸收收集洗脫組分，此組分中富含銅藍(lán)蛋白。
用中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基快流速瓊脂糖介質(zhì)裝柱，柱子大小為 7. 0*1. 6cm I. D.。柱子首先用20mM PB, pH7. 2，含有IM硫酸銨的緩沖溶液進(jìn)行平衡，平衡 10個柱體積。調(diào)節(jié)富含銅藍(lán)蛋白的物料pH值和鹽濃度與平衡緩沖液一致。然后開始進(jìn)料， 進(jìn)料流速為I. 5mL/min，無穿透峰。然后用20mM PB，pH7. 2，含有O. 8M硫酸銨的緩沖溶液進(jìn)行洗脫富含銅藍(lán)蛋白的組分。
將上述富含銅藍(lán)蛋白的組分用Satorious Vavaflow 50 (截留分子量為IOkDa)進(jìn)19行濃縮，濃縮后的樣品用用Superdex 200預(yù)裝柱(HiLoad 16/60)進(jìn)行分離,進(jìn)料ImL,收集洗脫峰。其中第一個洗脫峰中主要為結(jié)合珠蛋白，第二個洗脫峰主要為銅藍(lán)蛋白。
實(shí)施例5
制備Cl酯酶抑制劑
將中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的DEAE快流速瓊脂糖介質(zhì)裝柱，柱子大小為7.0*1. 6cm I. D.。柱子首先用20mM醋酸-醋酸鈉，pH4. 4緩沖溶液進(jìn)行平衡，平衡10個柱體積。調(diào)節(jié)上清II的pH值至4. 4，平衡后進(jìn)料IOmL上清III，進(jìn)料流速為I. 5mL/min,進(jìn)料結(jié)束以后用平衡緩沖液淋洗，淋洗流速為I. 5mL/min，得到穿透峰。然后用20mM醋酸-醋酸鈉，pH4. 4，含O. IM NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫，此組分中Cl酯酶抑制劑。
用20mM檸檬酸-檸檬酸鈉，pH3. 4緩沖溶液進(jìn)行平衡，平衡10個柱體積。然后將富含Cl酯酶抑制劑組分的pH值調(diào)節(jié)至3. 4，再將調(diào)節(jié)pH值后的物料上到上述DEAE柱子上，收集穿透峰，其中為Cl酯酶抑制劑的純品。
實(shí)施例6
組分IV綜合利用的放大(中試)
近期根據(jù)上述工藝采用400mL的柱子對上述工藝進(jìn)行了放大。放大過程實(shí)際操作如下稱取組分IV 642g，加入3210mL 20mM NaAc-HAc緩沖液(pH4. 4)，室溫下溶解2個小時，然后離心；沉淀再用3L 20mM PB緩沖液(pH7. O)溶解，離心得到的沉淀再用3L50mM Tris-HCl緩沖液(pH8. 5)溶解，沉淀丟棄。
將ρΗ4· 4的緩沖液溶出的蛋白上DEAE Sepharose FF柱子(柱體積400mL)。分兩次進(jìn)料(相當(dāng)于每毫升介質(zhì)處理4mL溶出液)，得到穿透峰和洗脫峰。把穿透峰的pH值調(diào)節(jié)到7. 0，然后再上相同的DEAE Sepharose FF柱子，穿透峰共分三次進(jìn)料，分別得到IgG，轉(zhuǎn)鐵蛋白和白蛋白。pH4. 4條件下的洗脫峰用Butyl Sepharose 4FF介質(zhì)處理,得到結(jié)合珠蛋白和富含Ci1-抗胰蛋白酶的組分。得到產(chǎn)品的純度分析如圖所示。得到產(chǎn)品的總量如下 免疫球蛋白2. 5g,轉(zhuǎn)鐵蛋白6. 2g,白蛋白I. 6g,結(jié)合珠蛋白I. 2g, a r抗胰蛋白酶I. 2g。 放大得到的純品的SDS分析如圖5所示。
實(shí)施例6
轉(zhuǎn)鐵蛋白的ELISA鑒定
用奇松生物公司的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定以上各實(shí)施例中所得到的蛋白為相應(yīng)的活性蛋白。
設(shè)施標(biāo)品孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各家不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50L。取IOL待測樣品，再加入樣本稀釋液40L，空白孔不加。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本空中每個孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100L，用封板膜封住反應(yīng)孔，37度避光孵育I個小時。棄去液體，拍干，然后用洗液洗板，重復(fù)5次。然后每孔加入底物A和B各50L，度避光孵育15分鐘。然后每孔加入終止液50L。在450nm波長處測定各孔的OD值。檢測結(jié)果表明所純化出來的蛋白為相應(yīng)的活性蛋白。
以上結(jié)果僅是本發(fā)明中比較具有代表性的實(shí)施例，并非用于限定本發(fā)明專利的實(shí)質(zhì)技術(shù)范圍，本專利的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容廣義定義于申請的權(quán)利要求范圍內(nèi)，任何他人完成的技術(shù)實(shí)體或者方法，若與申請的權(quán)利要求范圍完全相同，也或是一種等效的變更，均將視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種綜合利用組分IV的方法，其特征在于，所述方法包括步驟a :將Cohn低溫乙醇法獲得的組分IV溶液I溶解，分離沉淀，獲得上清I和沉淀I，將所述沉淀I溶液II溶解，分離沉淀，獲得上清II和沉淀II，再將所述沉淀II溶液III溶解，分離沉淀，獲得上清III ； 其中，優(yōu)選地，所述溶液I為酸性緩沖溶液，pH值為優(yōu)選地3. 8-5. 2、更優(yōu)選地4. 1-4. 8、最優(yōu)選地4. 3-4. 5，濃度為優(yōu)選地0. 01M-0. 5M、更優(yōu)選地0. 01-0. 2M、最優(yōu)選地0. 02-0. 05M,所述溶液II為中性緩沖溶液，pH值為優(yōu)選地6. 0-7. 5、更優(yōu)選地6. 3-7. 2、最優(yōu)選地6.5-7. 0，濃度為優(yōu)選地0. 01M-0. 5M、更優(yōu)選地0. 01-0. 2M、最優(yōu)選地0. 02-0. 05M和/或所述溶液III為堿性緩沖溶液，pH值為優(yōu)選地8. 0-9. 5、更優(yōu)選地8. 3-9. 2、最優(yōu)選地8.5-9. 0，濃度為優(yōu)選地0. 01M-0. 5M、更優(yōu)選地0. 01-0. 2M、最優(yōu)選地0. 02-0. 05M,且優(yōu)選地，所述酸性緩沖溶液的緩沖體系包括但不限于醋酸_醋酸鈉體系和檸檬酸_檸檬酸鈉體系、所述中性緩沖溶液的緩沖體系包括但不限于磷酸鹽緩沖體系和Tris-HCl緩沖體系和/或所述堿性緩沖溶液的緩沖體系包括但不限于Tris-HCl緩沖體系和硼酸-硼砂緩沖體系; 優(yōu)選地，所述組分IV與所述溶液I、所述溶液II和所述溶液III的質(zhì)量比分別為1:500-1:1，更優(yōu)選地 1:100-1:2，最優(yōu)選地 1:10-1:4， 優(yōu)選地，所述分離通過離心來進(jìn)行， 優(yōu)選地，所述步驟a在0-4 °C下進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟b:將上清I經(jīng)由離子交換層析柱分離，收集穿透峰，獲得組分A，之后用洗脫緩沖液I洗脫，獲得組分B，最后用洗脫緩沖液II洗脫，獲得a2-巨球蛋白，其中，分離過程中所用的平衡緩沖液為平衡緩沖液I ; 其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液I的緩沖體系包括但不限于醋酸-醋酸鈉體系或者檸檬酸-檸檬酸鈉體系，PH值為3. 5-5. 2、優(yōu)選地3. 8-5. O、更優(yōu)選地4. 1-4. 9、最優(yōu)選地4.2-4. 6，濃度為 5-200mM、優(yōu)選地 10-100mM、更優(yōu)選地 20_40mM， 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液I為在所述平衡緩沖液I中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液I的鹽濃度為0. 05-0. 15M、優(yōu)選地0. 08-0. 12M、更優(yōu)選地0. 1M， 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液II為在所述平衡緩沖液I中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液II的鹽濃度為0. 18-0. 35M、優(yōu)選地0. 2-0. 3M、更優(yōu)選地0. 25M， 優(yōu)選地，所述離子交換層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的 DEAE 以及 Q 瓊脂糖介質(zhì)，或者 GE 公司的 DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANXSepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE 以及Capto Q0
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟c:將上清II的pH值調(diào)節(jié)至所述平衡緩沖液I的PH值，經(jīng)由離子交換層析柱分離，收集穿透峰，獲得組分C，之后用所述洗脫緩沖液I洗脫，獲得組分D和根據(jù)610nm處的特征吸收收集的富含銅藍(lán)蛋白的組分E，最后用所述洗脫緩沖液II洗脫，獲得Ci2-巨球蛋白，其中，分離過程中所用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液I ;其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液I的緩沖體系包括但不限于醋酸-醋酸鈉體系或者檸檬酸-檸檬酸鈉體系，PH值為3. 5-5. 2、優(yōu)選地3. 8-5. O、更優(yōu)選地4. 1-4. 9、最優(yōu)選地4.2-4. 6，濃度為 5-200mM、優(yōu)選地 10-100mM、更優(yōu)選地 20_40mM， 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液I為在所述平衡緩沖液I中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液I的鹽濃度為0. 05-0. 15M、優(yōu)選地0. 08-0. 12M、更優(yōu)選地0. 1M， 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液II為在所述平衡緩沖液I中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液II的鹽濃度為0. 18-0. 35M、優(yōu)選地0. 2-0. 3M、更優(yōu)選地0. 25M， 優(yōu)選地，所述離子交換層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的 DEAE 以及 Q 瓊脂糖介質(zhì)，或者 GE 公司的 DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANXSepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE 以及Capto Q0
4.如權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟d:將上清III的PH值調(diào)節(jié)至所述平衡緩沖液I的pH值，經(jīng)由離子交換層析柱分離，收集穿透峰，獲得組分F，之后用所述洗脫緩沖液I洗脫，獲得組分G，最后用所述洗脫緩沖液II洗脫，獲得a2-巨球蛋白，其中，分離過程中所用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液I ; 其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液I的緩沖體系包括但不限于醋酸-醋酸鈉體系或者檸檬酸-檸檬酸鈉體系，PH值為3. 5-5. 2、優(yōu)選地3. 8-5. O、更優(yōu)選地4. 1-4. 9、最優(yōu)選地4.2-4. 6，濃度為 5-200mM、優(yōu)選地 10-100mM、更優(yōu)選地 20_40mM， 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液I為在所述平衡緩沖液I中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液I的鹽濃度為0. 05-0. 15M、優(yōu)選地0. 08-0. 12M、更優(yōu)選地0. 1M， 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液II為在所述平衡緩沖液I中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液II的鹽濃度為0. 18-0. 35M、優(yōu)選地0. 2-0. 3M、更優(yōu)選地0. 25M， 優(yōu)選地，所述離子交換層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的 DEAE 以及 Q 瓊脂糖介質(zhì)，或者 GE 公司的 DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANXSepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE 以及Capto Q0
5.如權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟e:將組分A、C、F或其組合的pH值調(diào)節(jié)至平衡緩沖液II的pH值，經(jīng)由離子交換層析柱分離，收集穿透峰，獲得免疫球蛋白，用洗脫緩沖液III洗脫獲得轉(zhuǎn)鐵蛋白，再用洗脫緩沖液IV洗脫獲得白蛋白和載脂蛋白Al的混合物，將所述白蛋白和載脂蛋白Al的混合物的鹽濃度調(diào)節(jié)至平衡緩沖液III的鹽濃度，經(jīng)由疏水層析柱分離，用洗脫緩沖液V洗脫獲得白蛋白，再用洗脫緩沖液VI洗脫獲得載脂蛋白Al ;其中，離子交換層析柱分離過程中所用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液II，疏水層析分離過程中所使用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液III ; 其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液II的緩沖體系包括但不限于磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl緩沖體系，pH值為6. 0-8. O、優(yōu)選地6. 5-7. 5M、更優(yōu)選地6. 8-7. 2M，濃度為5-200mM、優(yōu)選地 10-100mM、更優(yōu)選地 20_40mM， 優(yōu)選地，所述平衡緩沖液III的緩沖體系包括但不限于磷酸_磷酸鹽或者Tris-HCl緩沖體系，PH值為6. 0-8. O、優(yōu)選地6. 5-7. 5、更優(yōu)選地6. 8-7. 2，且所述平衡緩沖液III還含有包括但不限于(NH4)2SCV K2SO4, Na2SO4, NaH2PO4 和 Na2HPO4,優(yōu)選地(NH4) 2S04、K2SO4 和Na2SO4，更優(yōu)選地(NH4)2SO4的另外的鹽，所述平衡緩沖液III的鹽濃度為I. 5-0. 8M，優(yōu)選地I.2-0. 8M，最優(yōu)選地1M， 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液III為在所述平衡緩沖液II中加入包括但不限于NaCl、KCl、NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液III的鹽濃度為0. 05-0. 15M、優(yōu)選地0. 06-0. 14M、更優(yōu)選地0. 08-0. 12M,最優(yōu)選地0. 1M，優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液IV為在所述平衡緩沖液II中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液IV的濃度為0. 15-0. 35M、優(yōu)選地0. 18-0. 3M、更優(yōu)選地0. 20-0. 28M，最優(yōu)選地0. 25M, 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液V與所述平衡緩沖液III相同，且所述洗脫緩沖液V的鹽濃度為 0. 25-0. 8M、優(yōu)選地 0. 3-0. 6M、最優(yōu)選地 0. 4-0. 5M, 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液VI與所述平衡緩沖液III相同，且所述洗脫緩沖液VI的鹽濃度為 0-0. 2M、優(yōu)選地 0. 01-0. 1M、最優(yōu)選地 0. 02-0. 05M, 優(yōu)選地，所述離子交換層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的 DEAE 以及 Q 瓊脂糖介質(zhì)，或者 GE 公司的 DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANXSepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE 以及Capto Q, 優(yōu)選地，所述疏水層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基、辛集以及苯基瓊脂糖介質(zhì)，GE 公司的 Butyl Sepharose FF、OctylSepharose FF、PhenylSepharose FF high sub 或者 Phenyl Sepharose FF low sub。
6.如權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟f :分別將組分B、D和G的pH值和鹽濃度分別調(diào)節(jié)至平衡緩沖液III的pH值和鹽濃度，經(jīng)由疏水層析柱分離，用洗脫緩沖液VII洗脫組分B、D和G均獲得結(jié)合珠蛋白，再用洗脫緩沖液VIII洗脫，分別獲得a「抗胰蛋白酶，組分H和組分I，其中，疏水層析分離過程中所用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液III ; 其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液III的緩沖體系包括但不限于磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl緩沖體系，pH值為6. 0-8. O、優(yōu)選地6. 5-7. 5、更優(yōu)選地6. 8-7. 2，且所述平衡緩沖液 III 還含有包括但不限于(NH4)2S04、K2SO4, Na2SO4, NaH2PO4 和 Na2HPO4,優(yōu)選地(NH4)2S04、K2SOjP Na2SO4，更優(yōu)選地(NH4)2SO4的另外的鹽，所述平衡緩沖液III的鹽濃度為I. 5-0. 8M，優(yōu)選地I. 2-0. 8M，最優(yōu)選地1M， 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液VII與所述平衡緩沖液III相同，且所述洗脫緩沖液VII的鹽濃度為0. 6-0. 9M、優(yōu)選地0. 75-0. 85M、最優(yōu)選地0. 8M， 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液VIII與所述平衡緩沖液III相同，且所述洗脫緩沖液VIII的鹽濃度為0-0. 6M、優(yōu)選地0. 01-0. 4M、更優(yōu)選地0. 02-0. 1M，最優(yōu)選地0. 05M, 優(yōu)選地，所述疏水層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基、辛集以及苯基瓊脂糖介質(zhì)，GE 公司的 Butyl Sepharose FF、OctylSepharose FF、PhenylSepharose FF high sub 或者 Phenyl Sepharose FF low sub。
7.如權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟g:將組分D、H或其組合的pH值和鹽濃度分別調(diào)節(jié)至平衡緩沖液II的pH值和鹽濃度，經(jīng)由親和層析柱分離，用洗脫緩沖液IX洗脫去除雜質(zhì)，再用洗脫緩沖液X洗脫獲得抗凝血酶III，其中親和層析分離過程中使用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液IV ； 其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液IV的緩沖體系包括但不限于磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl緩沖體系，pH值為6. 0-8. O、優(yōu)選地6. 5-7. 5M、更優(yōu)選地6. 8-7. 2M，濃度為5-200mM、優(yōu)選地 10-100mM、更優(yōu)選地 20_40mM， 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液IX為在所述平衡緩沖液IV中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液III的鹽濃度為0. 05-0. 25M、優(yōu)選地0. 1-0. 2M、更優(yōu)選地0. 15M， 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液X為在所述平衡緩沖液IV中加入包括但不限于NaCl、KC1、NaBr、KBr和MgCl2,優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述洗脫緩沖液III的鹽的度為0. 4-0. 6M、優(yōu)選地0. 45-0. 55M、更優(yōu)選地0. 5M， 優(yōu)選地，所述親和層析介質(zhì)包括但是不限于過程所生產(chǎn)的肝素瓊脂糖介質(zhì)以及GE公司的 heparin Sepharose FF0
8.如權(quán)利要求2至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟h:將組分E的pH值和鹽濃度分別調(diào)節(jié)至平衡緩沖液III的pH值和鹽濃度，經(jīng)由疏水層析柱分離，用洗脫緩沖液VII洗脫獲得富含銅藍(lán)蛋白的組分，將所述富含銅藍(lán)蛋白的組分用超濾膜濃縮，之后用凝膠過濾層析柱分離，按照紫外信號收集洗脫峰，獲得銅藍(lán)蛋白，其中，疏水層析分離過程中所用的平衡緩沖液為所述平衡緩沖液III，凝膠過濾層析分離過程中所用的平衡緩沖液為緩沖液V ； 其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液III的緩沖體系包括但不限于磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl緩沖體系，pH值為6. 0-8. O、優(yōu)選地6. 5-7. 5、更優(yōu)選地6. 8-7. 2，且所述平衡緩沖液 III 還含有包括但不限于(NH4)2S04、K2SO4, Na2SO4, NaH2PO4 和 Na2HPO4,優(yōu)選地(NH4)2S04、K2SOjP Na2SO4，更優(yōu)選地(NH4)2SO4的另外的鹽，所述平衡緩沖液III的鹽濃度為I. 5-0. 8M，優(yōu)選地I. 2-0. 8M，最優(yōu)選地1M， 優(yōu)選地，所述平衡緩沖液V的緩沖體系包括但不限于磷酸-磷酸鹽或者Tris-HCl體系，pH值為5. 5-9. 9，優(yōu)選地6. 0-8. O、更優(yōu)選地6. 5-7. 5、最優(yōu)選地6. 8-7. 2且所述平衡緩沖液IV還含有包括但不限于NaCl、KCl、NaBr, KBr和MgCl2，優(yōu)選地NaCl、KCl和NaBr，更優(yōu)選地NaCl的另外的鹽，所述平衡緩沖液IV的鹽濃度為0. 05-0. 4M，優(yōu)選地0. 1-0. 25M，更優(yōu)選地 0. 15-0. 2M, 優(yōu)選地，所述洗脫緩沖液VII與平衡緩沖液III相同，但其中所述另外的鹽的濃度為.0.6-0. 9M、優(yōu)選地 0. 75-0. 85M、最優(yōu)選地 0. 8M, 優(yōu)選地，所述疏水層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的丁基、辛集以及苯基瓊脂糖介質(zhì)，GE 公司的 Butyl Sepharose FF、OctylSepharose FF、PhenylSepharose FF high sub 或者 Phenyl Sepharose FF low sub, 優(yōu)選地，所述凝膠過濾層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的快球速瓊脂糖介質(zhì)和魔芋葡糖聚糖介質(zhì)以及GE公司Sepharose 6FF、Superdex75、Superdex200> Sephadex G 75、Sephacryl 200HR 和 SephadexG150, 優(yōu)選地，所述超濾膜為截留分子為1-lOOkDa、優(yōu)選地5-30kDa、更優(yōu)選地IOkDa的膜包。
9.如權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟i:將組分G、I或其組合的pH值和鹽濃度分別調(diào)節(jié)至平衡緩沖液VI的pH值和鹽濃度，經(jīng)由離子交換層析柱分離，收集穿透峰獲得Cl酯酶抑制劑； 其中，優(yōu)選地，所述平衡緩沖液VI的緩沖體系包括但不限于醋酸-醋酸鈉體系或者檸檬酸-檸檬酸鈉體系，pH值為3. 0-3. 8、優(yōu)選地3. 2-3. 6、更優(yōu)選地3. 4，濃度為5_200mM、優(yōu)選地10-100mM、更優(yōu)選地為20-40mM， 優(yōu)選地，所述離子交換層析介質(zhì)包括但是不限于中國科學(xué)院過程工程研究所生產(chǎn)的的 DEAE 以及 Q 瓊脂糖介質(zhì)，或者 GE 公司的 DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、ANXSepharose FF high sub、ANX Sepharose FF low sub、QSepharoseXL、Capto DEAE 以及Capto Q0
10.如權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟a之后和步驟b-i之前進(jìn)行步驟j :分別將所述步驟a中的上清I、II、III離心除去助濾劑，之后用微濾膜過濾； 其中，優(yōu)選地，所述離心的離心速度為5000-1000rpm,優(yōu)選地6000-8000rpm,所述離心的離心時間為10-60min,優(yōu)選地30_45min ； 優(yōu)選地，所述微濾膜的孔徑為0. 1-1. Oum,優(yōu)選地0. 45 u m。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從組分IV中提取人血清白蛋白、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、結(jié)合珠蛋白、α2-巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、銅藍(lán)蛋白、抗凝血酶III、載脂蛋白A1、C1酯酶抑制劑等蛋白的方法。所述方法包括a)用不同pH值的溶液對沉淀進(jìn)行分布溶解，將不同的蛋白富集在不同的pH值緩沖液中；b)將溶出液用離子交換層析處理，將組分IV分穿透峰(HSA，IgG，Apo A1，轉(zhuǎn)鐵蛋白)和洗脫峰(結(jié)合珠蛋白，α2-巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶III、銅藍(lán)蛋白和C1酯酶抑制劑)，再進(jìn)一步針對不同的蛋白采用不同層析處理。本發(fā)明中所述方法蛋白收率高，容易放大，適合工業(yè)化生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了目前血漿生產(chǎn)中廢棄物的綜合利用。
文檔編號C07K1/18GK102977180SQ20121043897
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者蘇志國, 李巖, 楊延麗, 于孟冉 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所