專利名稱：牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及乳酪蛋白抑菌肽的制備方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
乳是新生哺乳動物的主要食物來源。新生嬰兒尚未完成免疫系統(tǒng)的發(fā)育，其抗病和免疫作用主要來源于母乳，這是由于其中存在著多種生物活性肽的緣故。乳中含有多種生物活性因子，包括像乳鐵蛋白這樣的抗菌、抗病毒生物活性肽等。研究表明，在體外條件下，用適當的蛋白酶對乳中的蛋白進行水解，可以將這些生物活性肽釋放出來。酪蛋白占牛乳蛋白質含量的78. 8%，是一種全價蛋白質。近年來研究表明，酪蛋白 除了營養(yǎng)功能外，還具有非常重要的生理功能，是生物活性肽的重要來源，包括抑菌肽、酪啡肽、降血壓肽、抗血栓肽、免疫活性肽、促進礦物離子吸收肽等活性肽。抑菌肽在體外條件下能抑制多種細菌的生長，在體內具有類似抗生素的活性，可以預防感染、提高機體對病原菌的抵抗能力。抑菌肽還可以通過參與非特異性細胞的吞噬作用和激活免疫系統(tǒng)使動物產生長效的免疫抵抗力?？咕囊蚱浞€(wěn)定性好，對高等動物正常細胞無害等特點而備受關注，但以食物蛋白來源的抗菌肽的研究報道還較少。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于避免現有技術的不足，提供一種牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制備方法。用胰蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制備抑菌肽，實現了牦牛乳酪蛋白的深加工，工藝簡單，水解產物抑菌活性高，適合工業(yè)化推廣生產。水解產物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌具有較強的抑制活性。為實現上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為一種牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制備方法，其主要特點是包括以下步驟(I)牦牛乳酪蛋白溶解配置2%_10%的牦牛乳酪蛋白水溶液，調節(jié)溫度300C -65°C,pH6. 5-9. O，攪拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；(2)加胰蛋白酶水解稱取按步驟(I) 2%_10%的牦牛乳酪蛋的量加入O. 5%-2%的胰蛋白酶，維持反應溫度30°C -65°C,pH6. 5-9. O,反應I 4小時；(3)滅活胰蛋白酶，升溫至80°C -100°C，維持15-30分鐘(4)沉淀酪蛋白用鹽酸調節(jié)pH到3. 8-4. 6,使酪蛋白在其等電點處析出(5)離心4000g-12000g離心力，離心除去酪蛋白沉淀，留上清液(6)葡聚糖凝膠層析分離采用SephadeXG25凝膠柱對離心液進行分部收集，檢測各收集液抑菌活性；(7)質譜測定分子量采用質譜儀對抑菌組分層析液進行分子量測定，確定肽分子量，確定超濾膜分子量范圍；(8)超濾取離心后上清液，過截留量1000Da_2500Da的超濾膜，收集分子量在1000Da-2500Da之間的多肽；(9)噴霧干燥取超濾液，采用噴霧干燥機，進行噴干，得到牦牛乳酪蛋白抑菌肽。所述的牦牛乳酪蛋白為食品級；所述的鹽酸為食品級。所選用的酶制劑為胰蛋白酶。本發(fā)明的有益效果I.本發(fā)明采用牦牛乳酪蛋白為原料，原料蛋白含量高，價格低，間接降低了生產成本；同時酶水解牦牛乳酪蛋白，產物溶解性好，不但提高了牦牛乳酪蛋白的營養(yǎng)價值，而且賦予產品功能特性。2.食源牦牛乳酪蛋白抑菌肽，與抗生素產品相比，安全性高，不存在抗性和過敏反 應，肽段結構簡單，分子量小，穩(wěn)定性高。3.操作工藝簡單，綠色環(huán)保，生產成本低，適合工業(yè)化生產和推廣。


圖I :本發(fā)明活性組分質譜圖。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實施例I :一種牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制備方法，其特征是包括以下步驟(I)牦牛乳酪蛋白購自華羚酪蛋白股份有限公司，食品級。(2)牦牛乳酪蛋白溶解稱取牦牛乳酪蛋白25g，加水500mL，調節(jié)反應溫度55°C，pH8. O，攪拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。(3)加胰蛋白酶胰蛋白酶購自北京格源天潤生物技術有限公司，效價測定不少于2500單位，按牦牛乳酪蛋白25g計算，稱取O. 25g酶，維持反應反應溫度55°C，pH8. O,反應2小時。(4)滅活胰蛋白酶，升溫至80°C，維持15分鐘。(5)沉淀酪蛋白用5mol/L食用級鹽酸調節(jié)pH到4. 6,使酪蛋白在其等電點處析出。(6)離心4000g離心力，離心除去酪蛋白沉淀，留上清液。(7)超濾取離心后上清液，過截留量IOOODa和2500Da的超濾膜，收集分子量在1000Da-2500Da之間的肽段。(8)噴霧干燥取超濾透過液，采用噴霧干燥機，對產品進行噴干，得到牦牛乳酪蛋白抑菌肽，得到干粉7. 3g，得率29. 2%。(9)抑菌活性測定，金黃色葡萄球桿菌最小抑制濃度270 μ g/mL,大腸埃希氏菌最小抑菌濃度980 μ g/mL。實施例2 : —種牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制備方法，其特征是包括以下步驟(I)牦牛乳酪蛋白購自華羚酪蛋白股份有限公司，食品級。(2)牦牛乳酪蛋白溶解稱取牦牛乳酪蛋白20g，加水500mL，調節(jié)反應溫度55°C，pH8. O，攪拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。(3)加胰蛋白酶加胰蛋白酶胰蛋白酶購自北京格源天潤生物技術有限公司，效價測定不少于2500單位，按牦牛乳酪蛋白20g計算，稱取O. 5g酶，維持反應反應溫度55°C，pH8. 0，反應2小時。(4)滅活胰蛋白酶，升溫至80°C，維持15分鐘。(5)沉淀酪蛋白用5mol/L食用級鹽酸調節(jié)pH到4. 6,使酪蛋白在其等電點處析出。(6)離心12000g離心力，離心除去酪蛋白沉淀，留上清液。(7)超濾取離心后上清液，取離心后上清液，過截留量IOOODa和2500Da的超濾膜，收集分子量在1000Da-2500Da之間的肽段。(8)噴霧干燥取超濾透過液，采用噴霧干燥機對產品進行噴干，得到牦牛乳酪蛋白抑菌肽，得到干粉5. 12g，得率25. 6%。
(9)抑菌肽活性測定,對金黃色葡萄球桿菌最小抑制濃度314 μ g/mL,大腸埃希氏菌最小抑菌濃度I. 07mg/mL。實施例3 : —種牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制備方法，其特征是包括以下步驟(I)牦牛乳酪蛋白購自華羚酪蛋白股份有限公司，食品級。(2)牦牛乳酪蛋白溶解稱取牦牛乳酪蛋白40g，加水500mL，調節(jié)反應溫度55°C，pH8. O，攪拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。(3)加胰蛋白酶加胰蛋白酶胰蛋白酶購自北京格源天潤生物技術有限公司，效價測定不少于2500單位，按牦牛乳酪蛋白40g計算，稱取O. 5g酶，維持反應反應溫度55°C，ρΗ8· 0，反應2小時。(4)滅活胰蛋白酶，升溫至80°C，維持15分鐘。(5)沉淀酪蛋白用5mol/L食用級鹽酸調節(jié)pH到4. 6,使酪蛋白在其等電點處析出。(6)離心12000g離心力，離心除去酪蛋白沉淀，留上清液。(7)超濾取離心后上清液，取離心后上清液，過截留量IOOODa和2500Da的超濾膜，收集分子量在1000Da-2500Da之間的肽段。(8)噴霧干燥取超濾透過液，采用噴霧干燥機對產品進行噴干，得到牦牛乳酪蛋白抑菌肽，得到干粉12. 2g，得率30. 4%。(9)抑菌肽活性測定,對金黃色葡萄球桿菌最小抑制濃度276 μ g/mL,大腸埃希氏菌最小抑菌濃度982 μ g/mL。實施例4 :一種牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制備方法，其特征是包括以下步驟(I)牦牛乳酪蛋白購自華羚酪蛋白股份有限公司，食品級。(2)牦牛乳酪蛋白溶解稱取牦牛乳酪蛋白10g，加水500mL，調節(jié)反應溫度30°C，pH6. 5,攪拌,使牦牛乳酪蛋白溶解。(3)加胰蛋白酶胰蛋白酶購自北京格源天潤生物技術有限公司，效價測定不少于2500單位，按牦牛乳酪蛋白IOg計算，稱取Ig酶，維持反應溫度30°C，pH6. 5，反應4小時。(4)滅活胰蛋白酶，升溫至100°C，維持15分鐘。其余步驟與實施例I相同。實施例5 : —種牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制備方法，其特征是包括以下步驟(I)牦牛乳酪蛋白購自華羚酪蛋白股份有限公司，食品級。
(2)牦牛乳酪蛋白溶解稱取牦牛乳酪蛋白50g，加水500mL，調節(jié)反應溫度65°C，pH9. O，攪拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。(3)加胰蛋白酶胰蛋白酶購自北京格源天潤生物技術有限公司，效價測定不少于2500單位，按牦牛乳酪蛋白50g計算，稱取O. 25g酶，維持反應反應溫度65°C，pH9. O,反應I小時。(4)滅活胰蛋白酶，升溫至80°C，維持30分鐘。其余步驟與實施例I相同。見圖I是葡聚糖凝膠柱分離液，具有最大抑菌活性的收集液的質譜圖，從圖中可以看出，該收集液有3個主要組分，分子量范圍在150(T2000Da。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制備方法，其特征是包括以下步驟 (O牦牛乳酪蛋白溶解配置2%-10%的牦牛乳酪蛋白水溶液，調節(jié)溫度30°C -65°C,pH6. 5-9. O，攪拌，使牦牛乳酪蛋白溶解； (2)加胰蛋白酶水解稱取按步驟(I)2%-10%的牦牛乳酪蛋的量加入O. 5%-2%的胰蛋白酶，維持反應溫度300C -65°C,pH6. 5-9. 0，反應I 4小時； (3)滅活胰蛋白酶，升溫至80°C-100°C，維持15-30分鐘 (4)沉淀酪蛋白用鹽酸調節(jié)pH到3.8-4. 6，使酪蛋白在其等電點處析出 (5)離心4000g-12000g離心力，離心除去酪蛋白沉淀，留上清液 (6)葡聚糖凝膠層析分離采用SephadeXG25凝膠柱對離心液進行分部收集，檢測各收集液抑菌活性； (7)質譜測定分子量采用質譜儀對抑菌組分層析液進行分子量測定，確定肽分子量，確定超濾膜分子量范圍； (8)超濾取離心后上清液，過截留量1000Da-2500Da的超濾膜，收集分子量在1000Da-2500Da之間的多肽； (9)噴霧干燥取超濾液，采用噴霧干燥機，進行噴干，得到牦牛乳酪蛋白抑菌肽。
2.如權利要求I所述的牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制備方法，其特征在于所述的牦牛乳酪蛋白為食品級；所述的鹽酸為食品級。
3.如權利要求I所述的牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制備方法，其特征在于所選用的酶制劑為膜蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及乳酪蛋白抑菌肽的制備方法，屬于生物技術領域。一種牦牛乳酪蛋白抑菌肽的制備方法，其制備步驟為(1)牦牛乳酪蛋白溶解；(2)加胰蛋白酶水解；(3)滅活胰蛋白酶；(4)沉淀酪蛋白；(5)離心除沉淀；(6)葡聚糖凝膠層析分離；(7)質譜測定分子量；(8)超濾。用截留量1000Da和2500Da的超濾膜，收集1000Da至2500Da分子量范圍的肽片段。(9)噴霧干燥。該方法制備的抑菌肽，肽分子量分布集中，抑菌活性強，金黃色葡萄球桿菌最小抑制濃度270μg/mL，大腸埃希氏菌最小抑菌濃度980μg/mL。
文檔編號C07K1/16GK102876764SQ20121037520
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月5日 優(yōu)先權日2012年10月5日
發(fā)明者謝小冬, 宋禮, 紀銀莉, 高維東, 何瀟, 葛靜微, 蘇艷萍 申請人:甘肅華羚生物技術研究中心