專(zhuān)利名稱(chēng)：大豆疫霉卵孢子發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白基因的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因領(lǐng)域，具體涉及一種大豆疫霉鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因的用途。
背景技術(shù)：
欠豆:疫霉Phytophthora 是一種極為重要的植物病原菌，由其引起的大豆根腐病是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害之一。該病原菌可以在大豆的各個(gè)生育 期侵染大豆，一般發(fā)生年份減產(chǎn)10-30%，重病田塊可減產(chǎn)60%，甚至絕產(chǎn)。盡管我國(guó)于80年代后期才在東北地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)大豆疫霉，但目前該病已在我國(guó)部分地區(qū)擴(kuò)散并成為東北、安徽和福建等大豆主產(chǎn)區(qū)的主要病害，在一些年份，其造成的大豆產(chǎn)量損失高達(dá)50%以上。人們廣泛地選育抗病品種防治此病，但由于該病原菌的致病性易變，新的致病小種的產(chǎn)生易導(dǎo)致新選育的抗病品種失去利用價(jià)值。因此，大豆疫霉根腐病的防治始終是大豆生產(chǎn)上的一個(gè)重要難題，而控制該病原菌的一個(gè)重要前提是了解其生長(zhǎng)發(fā)育與致病過(guò)程的分子機(jī)制，尋找阻斷其生長(zhǎng)與致病過(guò)程的分子靶標(biāo)。轉(zhuǎn)錄因子在真核生物的生命活動(dòng)中起著重要的調(diào)控作用，某個(gè)或某些基因在特定時(shí)期的打開(kāi)或關(guān)閉則決定了所有生物有機(jī)體的特征性狀，在整個(gè)基因組水平上了解基因的表達(dá)與調(diào)控是闡明疫霉菌生長(zhǎng)發(fā)育與致病性的關(guān)鍵，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的研究將有助于明確疫霉菌細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)和相互作用。鋅指蛋白(zinc finger protein)是一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子家族,具有“手指狀”結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)調(diào)控基因的表達(dá)，主要通過(guò)與核酸相互作用，顯示出不同功能。鋅指蛋白最初在非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，已知廣泛分布在動(dòng)植物和微生物中，人類(lèi)基因組中可能有將近1%的序列編碼含有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。根據(jù)鋅指蛋白氨基酸序列中半胱氨酸(Cys，C)和組氨酸殘基(His, H)的數(shù)目和位置可將鋅指轉(zhuǎn)錄因子分為C2H2、C2HC, C2C2, C2HCC2C2,C2C2C2C2等亞類(lèi)，其中大部分鋅指蛋白屬于C2H2型鋅指蛋白。鋅指通過(guò)與靶分子DNA、RNA、DNA - RNA的序列特異性結(jié)合，以及與自身或其他鋅指蛋白的結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)。由于其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以選擇性的結(jié)合特異的靶結(jié)構(gòu)，使鋅指蛋白在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用。分析大豆疫霉中鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的作用，明確鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子如何通過(guò)操縱病原菌的基因表達(dá)，啟動(dòng)侵染相關(guān)發(fā)育過(guò)程，從而為尋找化學(xué)分子作用于鋅指蛋白，抑制其功能，控制大豆疫霉生長(zhǎng)或發(fā)育的某一環(huán)節(jié)，造成病害繁殖體的缺失，進(jìn)而達(dá)到控制病害發(fā)生與傳播。這些研究工作的開(kāi)展對(duì)控制大豆疫霉根腐病具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值，為開(kāi)發(fā)以病原真菌生長(zhǎng)發(fā)育為靶標(biāo)的新型高效、低毒的殺菌劑具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種大豆疫霉與卵孢子發(fā)育相關(guān)的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因該基因?qū)τ谶M(jìn)一步深入了解大豆疫霉與卵孢子發(fā)育過(guò)程，并通過(guò)化學(xué)藥劑手段調(diào)控大豆疫霉與卵孢子發(fā)育，從而為控制大豆疫霉根腐病的發(fā)生起到重要作用。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種大豆疫霉與卵孢子發(fā)育相關(guān)的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因?yàn)镾EQ ID NO. I所示的核苷酸序列。本發(fā)明還同時(shí)提供了編碼上述大豆疫霉與卵孢子發(fā)育相關(guān)的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因的蛋白質(zhì)，為SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述大豆疫霉與卵孢子發(fā)育相關(guān)的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因Ps-ZfAl的用途，用于殺菌劑的作用靶標(biāo)。本發(fā)明的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因&-^沒(méi)2全長(zhǎng)1393bp，從cDNA中克隆的⑶S序列為993bp，該基因中只存在I個(gè)外顯子序列，如圖1，翻譯后的蛋白質(zhì)由330個(gè)氨基酸殘基組成。 Ps-zfAl蛋白序列第244-258位點(diǎn)上的氨基酸序列為Cys-Arg-His-Cys- His-Met-Arg-Gly-His-Phe-Ile-Arg-Asp-Cys,如圖2下劃線部分所示,符合CHCC型鋅指蛋白的特征序列 Cys-X2-Cys-X4-His-X4_Cys。將該基因沉默后進(jìn)行基因功能分析，得到的沉默的突變體產(chǎn)生很少的卵孢子，而且發(fā)育不完全，多為空孢。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了大豆疫霉與卵孢子發(fā)育相關(guān)的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因，Ps-zfAl基因的主要作用是能夠調(diào)控其靶基因轉(zhuǎn)錄，控制大豆疫霉卵孢子的發(fā)育，在控制大豆疫霉根腐病中具有很高的應(yīng)用價(jià)值，以該基因?yàn)樽饔冒袠?biāo)，開(kāi)發(fā)的殺菌劑對(duì)控制大豆疫霉根腐病的發(fā)生與流行具有重要的實(shí)踐意義。


圖I是Ps-ZfAl基因結(jié)構(gòu)模式。圖2是Ps-zfAl蛋白質(zhì)氨基酸序列，下劃線序列為鋅指蛋白DNA結(jié)合區(qū)域保守序列。圖3是轉(zhuǎn)化子中Ps-zfAl的時(shí)實(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析。P26為野生型菌株，CK3為轉(zhuǎn)化對(duì)照菌株，As2為基因沉默突變體。圖4是基因沉默突變體As2和野生型P26產(chǎn)生卵孢子表型。圖片拍攝于接菌后第7天。
具體實(shí)施例方式供試菌株
供試菌株為大豆疫霉全基因組測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)26,由美國(guó)菌種保藏中心(AmericanType Culture Collection)保存。菌株保存在10% V8固體培養(yǎng)基，保存溫度是10攝氏度。大豆品種Williams對(duì)大豆疫霉菌株P(guān)26的侵染表現(xiàn)為感病，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心提供。數(shù)據(jù)庫(kù)信息和同源檢索
大豆疫霉數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome, jgi-psf. org/Physo3/Physo3. home, html)
橡樹(shù)疫霉數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome, jgi-psf. org/Phyral_l/Phyral_l. home, html)
致病疫霉數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. broad, mit. edu)疫霉菌功能基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. pfgd. org/)。序列比對(duì)分析
將得到的大豆疫霉基因在歐洲生物信息學(xué)中心(European BioinformaticsInstitute, EBI)的網(wǎng)站(www. ebi. ac. uk/clustalw)上用 culstal W 軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，無(wú)需改動(dòng)用其默認(rèn)值即可。序列的系統(tǒng)發(fā)育用Mega 4. O軟件分析，采用NJ(neighbor-joining)算法 1000 次重復(fù)。核糖核酸(RNA )的提取和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction, RT-PCR)
核糖核酸的提取使用的是Trizol (Invitrogen ,美國(guó)英杰Invitrogen公司)，液氮研磨組織，按100毫克組織加入I毫升Trizol，轉(zhuǎn)移入離心管，用電動(dòng)勻漿器充分勻漿I分鐘。加Trizol后，室溫放置5分鐘，使其充分裂解。12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄沉 淀，按I毫升Trizol加入200微升氯仿，振勻，室溫放置15分鐘，4攝氏度下12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。吸取上層水相，至另一離心管中。按每毫升Trizol加入O. 5毫升異丙醇并混勻，室溫放置10分鐘。攝氏度下12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清，核糖核酸沉于管底。按每毫升Trizol加入I毫升75%乙醇的比例加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4攝氏度下8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清。室溫晾干或真空干燥5到10分鐘。用50微升水,溶解核糖核酸。核糖核酸反轉(zhuǎn)錄使用ThermoScript反轉(zhuǎn)錄酶(ThermoScript ,美國(guó)英杰Invitrogen公司)體系進(jìn)行,先把下列組分加到反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中濃度為50微摩爾/毫升的Oligo (dT)20(多聚胸腺嘧啶20)(Invitrogen ，美國(guó)英杰Invitrogen公司)，I微升；總核糖核酸，2微克；10毫摩爾/毫升的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)混合物(Invitrogen ,美國(guó)英杰Invitrogen公司),2微升；加焦碳酸二乙酯(DEPC) (solarbio ，上海索萊寶生物科技有限公司)水12微升。65° C保溫5分鐘至于冰上,后依次加入一下組分5倍的單鏈脫氧核糖核酸(cDNA)綜合緩沖液(SynthesisBuffer) (Invitrogen ,美國(guó)英杰Invitrogen公司)4微升；濃度為O. I摩爾/升的的二硫蘇糖醇(DTT) (Invitrogen ,美國(guó)英杰Invitrogen公司)1微升；濃度為40單位/微升的RNaseOUT (Invitrogen ,美國(guó)英杰Invitrogen公司)I μ I ;滅菌水I μ I ;濃度為15單位 / 微升的 ThermoScript RT (ThermoScript ,美國(guó)英杰 Invitrogen 公司)I μ I。將混合物輕輕混勻，50攝氏度保溫60分鐘，再85攝氏度保溫5分鐘，所獲得的單鏈脫氧核糖核酸(cDNA)置于零下20攝氏度備用。Ps-zfAl脫氧核糖核酸序列擴(kuò)增和蛋白質(zhì)編碼序列分析
Ps-zfAl的脫氧核糖核酸序列從菌株P(guān)26基因組中和單鏈脫氧核糖核酸(cDNA)中通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到。引物序列為上游引物5’- ATGGACGCCGCCCCGACCG _3’，下游引物5’ -CTTCATGTACTCCTTCGAGTACG - 3’，程序?yàn)?4攝氏度2分鐘，然后94攝氏度30秒、54攝氏度30秒和72攝氏度2分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物克隆到PMD18-T載體上并測(cè)序驗(yàn)證。Ps-zfAl蛋白質(zhì)編碼序列由大豆疫霉數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome,jgi-psf. org/Physo3/Physo3. home, html)上獲得。從大豆疫霉基因組DNA和cDNA中克隆出Ps-zfAl全長(zhǎng)序列并測(cè)序。經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PsMybl基因全長(zhǎng)993 bp,從cDNA中克隆的CDS序列也為993bp，不含內(nèi)含子，參見(jiàn)圖I，翻譯后的蛋白質(zhì)由330個(gè)氨基酸殘基組成，參見(jiàn)圖2。
構(gòu)建反向轉(zhuǎn)化載體
酶切載體PTH210ZFA1S，回收純化后與高保真擴(kuò)增產(chǎn)物相連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，用PTH210ZFA1S啟動(dòng)子上游引物和&-^沒(méi)2下游引物PCR擴(kuò)增篩選反向插入的克隆。大豆疫霉遺傳轉(zhuǎn)化
1)配制40%聚乙二醇10 mL :稱(chēng)取6 g聚乙二醇4000放于50毫升燒杯中，于超凈臺(tái)中依次加入3. 75毫升0.8摩爾/升甘露醇，3毫升0.5摩爾/升氯化鈣和3毫升水，攪拌溶解；
2)用紗布和200毫升燒杯收集菌絲，并用鑷子將菌絲放入含有O. 8摩爾/升甘露醇的培養(yǎng)皿中漂洗將漂洗過(guò)后的菌絲移入盛有O. 8摩爾/升甘露醇的離心管中室溫?fù)u洗10分鐘；
3)用滅過(guò)菌的50毫升燒杯快速稱(chēng)取O. I克Lyzing酶和O. 06克纖維素,蓋緊杯口迅速拿回超凈臺(tái)。并依次加入10毫升0.8摩爾/升甘露醇，8毫升水，800微升0.5摩爾/升氯化鉀，800微升O. 5摩爾/升脂肪酸甲酯磺酸鹽(pH5. 7)和400微升O. 5摩爾/升氯化鈣，充分溶解酶液后將其倒入50毫升離心管，并加入已洗好的菌絲，25攝氏度下40轉(zhuǎn)/分鐘酶解45-60分鐘；
4)用兩層孔徑22-25 微米的濾膜(Miracloth. Calbiochem, La Jolla, CA)和燒杯過(guò)濾收集原生質(zhì)體，收集好以后倒入新的離心管中，1500轉(zhuǎn)/分鐘，3分鐘后輕輕倒掉上清液；
5)用35毫升W5溶液(154毫摩爾氯化鈉，125毫摩爾氯化鈣，5毫摩爾氯化鉀，5毫摩爾葡萄糖，pH 5. 8))洗滌原生質(zhì)體，1500轉(zhuǎn)/分鐘，4分鐘后輕輕倒掉上清液；
6)用5毫升W5溶液重懸原生質(zhì)體至濃度為2 X IO6個(gè)/毫升，冰置30分鐘后1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心4分鐘，輕輕倒掉上清液；
7)用5毫升W5溶液重懸原生質(zhì)體，室溫放置10分鐘；
8)取新的離心管放于冰上，在管底加入3-4微升的pTH209質(zhì)粒；
9)在每個(gè)含有質(zhì)粒的離心管中加入I毫升原生質(zhì)體，冰置5-10分鐘；
10)每個(gè)離心管加I. 74毫升聚乙二醇，分三次加入，每次580微升，輕輕混勻，冰置20分鐘；
11)將離心管中液體倒入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，25°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜；
12)將培養(yǎng)皿中的液體吸進(jìn)50毫升離心管，每分鐘2000轉(zhuǎn)離心5分鐘后吸去上清，剩余2毫升左右液體；
13)將15毫升準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基倒入離心管，混勻后倒入培養(yǎng)皿中25攝氏度黑暗培養(yǎng)。Ps-zfAl沉默突變體的表型分析
利用聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法將該基因沉默后進(jìn)行基因功能分析，篩選得到了 I個(gè)沉默的突變體，編號(hào)為As2。時(shí)實(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析轉(zhuǎn)化子中Ps-zfAl的轉(zhuǎn)錄水平變化，As2轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增不出目的條帶，而只轉(zhuǎn)有PTH210SPN質(zhì)粒的對(duì)照轉(zhuǎn)化子(CK3)和轉(zhuǎn)化受體菌株P(guān)26均擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明As2體內(nèi)不積累Ps-zfAl的信使核糖核酸(mRNA)，結(jié)果參見(jiàn)圖3。將供試菌株在1%瓊脂的利馬豆培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)(黑暗，25攝氏度下，培養(yǎng)皿用雙層透明膠帶封閉)，培養(yǎng)7天后觀察卵孢子產(chǎn)生情況。結(jié)果如圖4所示，沉默的突變體菌株As2產(chǎn)生很少的卵孢子，而且發(fā)育不完全，多為空孢。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，盡管為了舉例說(shuō)明的目的描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但可以對(duì)其進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的具體實(shí)施方案和實(shí)例不應(yīng)當(dāng)視為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。本申請(qǐng)中引用的所有文獻(xiàn)均完整地并入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.大豆疫霉卵孢子發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白基因的用途，大豆疫霉鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因Ps-ZfAl基因?yàn)镾EQ ID NO. I所示的核苷酸序列，大豆疫霉鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因的蛋白質(zhì)為SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，其特征在于大豆疫霉卵孢子發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白基因的用途是作為殺菌劑的作用靶標(biāo)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種大豆疫霉卵孢子發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白基因的用途，大豆疫霉鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子Ps-zfA1基因?yàn)镾EQIDNO.1所示的核苷酸序列，大豆疫霉鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子Ps-zfA1基因的蛋白質(zhì)為SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。Ps-zfA1主要作用是能夠調(diào)控其靶基因轉(zhuǎn)錄，控制大豆疫霉卵孢子的發(fā)育。本發(fā)明提供的基因在控制大豆疫霉根腐病中具有很高的應(yīng)用價(jià)值，以該基因?yàn)樽饔冒袠?biāo)，開(kāi)發(fā)的殺菌劑對(duì)控制大豆疫霉根腐病的發(fā)生與流行具有重要的實(shí)踐意義。
文檔編號(hào)C07K14/37GK102776208SQ20121020023
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者杜家亮, 王子迎, 王朝霞 申請(qǐng)人:合肥師范學(xué)院