專(zhuān)利名稱(chēng)：人β-防御素3在酵母菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)了一種人P -防御素3的表達(dá)方法，特別是指一種在酵母菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)人P -防御素3的方法。
背景技術(shù)：
防御素是抗菌肽家庭中最大的亞家族，是生物體內(nèi)產(chǎn)生的一類(lèi)對(duì)抗外源性病原體致病作用的防御性多肽活性物質(zhì)，是生物體先天免疫的重要組成部分，與干擾素、補(bǔ)體等組成了宿主的免疫防御系統(tǒng)。截止目前研究發(fā)現(xiàn)防御素的種類(lèi)有哺乳動(dòng)物防御素、昆蟲(chóng)防御素和植物防御素；而根據(jù)二硫鍵的位置，連接上的差異以及前體和表達(dá)方式不同，防御素又分為a -防御素、P -防御素和0 -防御素3類(lèi)。人P -防御素 3 (human 3-defensin-3,hBD_3)是 2001 年 Harder 等在銀屑病患者皮損組織中發(fā)現(xiàn)的防御素P家族抑菌活性最高的肽。hBD-3是由45個(gè)氨基酸組成的小分子多肽，相對(duì)分子質(zhì)量為5154. 7，由I個(gè)a螺旋和3個(gè)反向平行的P折疊片層組成，同時(shí)有一個(gè)短螺旋環(huán)在氨基末端區(qū)域形成。hBD-3由6個(gè)半胱氨酸殘基形成3個(gè)二硫鍵，其連接方式為2 4、1 5、3 6。3個(gè)反向平行的P折疊片層通過(guò)17 19、27 31、39 43殘基形成。hBD-3是兩親結(jié)構(gòu)，包括疏水端和親水端，疏水端聚集在肽表面的底部，正電荷在它的表面兩端是不對(duì)稱(chēng)分布的。相較于其他@防御素而言，人防御素3的功能性更廣(一)顯著的抗細(xì)菌、 抗真菌及抗病毒的活性，且抑菌濃度比已經(jīng)觀(guān)察到的防御素家族的其他成員更低；(二)在連接先天和獲得性免疫應(yīng)答中起到重要的橋梁作用；(三)誘導(dǎo)專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞產(chǎn)生和活化，有望成為疫苗佐劑；(四)其抗菌活性是非鹽離子濃度敏感性的，不易引起溶血。在濫用抗菌藥物，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重的今天，人￠-防御素3因具有高效殺菌、不易產(chǎn)生耐藥性突變、無(wú)毒、適用性廣、性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的抗生素，開(kāi)發(fā)成為新一代抗細(xì)菌、真菌、病毒和抗癌的藥物，應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景廣闊。但是，要將人0 -防御素3真正應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，必須首先建立成本低廉、高效穩(wěn)定的制備工藝，解決工業(yè)批量化生產(chǎn)問(wèn)題。目前，防御素主要通過(guò)以下3種途徑獲得(1)誘導(dǎo)生物體分泌表達(dá)后分離純化；(2)化學(xué)合成；(3)構(gòu)建防御素基因工程菌株。但天然存在的防御素產(chǎn)量很低，無(wú)法從動(dòng)植物體內(nèi)大量提取，且分離純化具有抗菌活性的組成無(wú)疑是一件非常繁瑣的工作；而化學(xué)合成防御素也存在成本高，大批量生產(chǎn)困難的弱點(diǎn)，因此，前 2種方法無(wú)法滿(mǎn)足防御素工業(yè)化生產(chǎn)的需求。相較而言，以工程菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)防御素， 可大規(guī)模生產(chǎn)，其生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低且不受季節(jié)和氣候變化等外在環(huán)境影響，因而探索適當(dāng)?shù)姆烙卣T導(dǎo)途徑成為該領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。有許多實(shí)驗(yàn)對(duì)不同來(lái)源的防御素進(jìn)行了重組表達(dá)嘗試，涉及的表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌系統(tǒng)、酵母系統(tǒng)等。自基因工程等生物技術(shù)發(fā)展以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)借助于基因工程菌制備人￠-防御素3展開(kāi)了廣泛的研究，包括基因的獲取、使用受體菌偏好基因人工合成基因、表達(dá)載體的構(gòu)建、以及采用融合蛋白策略實(shí)驗(yàn)人￠-防御素3在大腸桿菌的高效表達(dá)。黃蓬亮(黃蓬亮，趙亞華，許少鵬.人P防御素3在大腸桿菌中可溶性表達(dá)及其生物活性的鑒定.生命科學(xué)研究，2005，9(2): 129-133)等根據(jù)大腸桿菌對(duì)精氨酸密碼子使用偏好合成了人P -防御素3,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)成功。李春麗等(李春麗，何國(guó)慶，崔淑貞.人P防御素3基因的合成及其克隆.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，39(3) : 282-285) 根據(jù)已知人P -防御素3的成熟區(qū)氨基酸序列和酵母密碼子的偏好，人工合成人P -防御素3基因，并成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pPIC9k-hBD-3。庹曉曄等(庹曉曄，徐明達(dá)，陳璧， 等.人P防御素3在大腸桿菌中的融合表達(dá)及其抗微生物活性的初步分析[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2004，28(2) : 114 - 122)構(gòu)建了人P -防御素3基因真核表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)成功。李春麗等(李春麗，徐雪麗，鄭振宇，等.人@防御素3和植物des-pGLul-brazzein融合蛋白表達(dá)菌的誘導(dǎo)條件優(yōu)化及其活性分析.生物工程學(xué)報(bào)， 2008，24(3) : 485-490)對(duì)人￠-防御素3和植物甜蛋白des-pGlul-Brazzein嵌合基因的工程菌株BL-pET-hBD3-Bra的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了研究，經(jīng)優(yōu)化目的蛋白表達(dá)量占總蛋白的35%左右。何國(guó)慶等(何國(guó)慶，李春麗，阮暉等.人@防御素3與植物甜蛋白 Brazzein嵌合基因的合成及其在大腸桿菌中的表達(dá).農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，13(2): 217-220)嵌合人P -防御素3與植物甜蛋白Brazzein基因,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)后，目的蛋白約占總蛋白的30%。然而，用大腸桿菌表達(dá)體系所表達(dá)的防御素常常無(wú)生物活性。大腸桿菌表達(dá)體系雖具有一定簡(jiǎn)易性和大眾性，但仍有一些缺陷1)缺少真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后修飾和加工過(guò)程，二硫鍵無(wú)法正確形成，影響了蛋白的正確折疊，表達(dá)后的抗菌肽活性受到影響；2) 表達(dá)的蛋白質(zhì)多以包含體形式存在，防御素的純化和回收，不僅增加成本，而且影響防御素的生物活性；3)雜蛋白多，純化步驟復(fù)雜等。本發(fā)明針對(duì)目前尚未有人@ -防御素3在真核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)的報(bào)道和現(xiàn)有重組技術(shù)制備技術(shù)的不足，提供了一種低成本、高效率制備人3 -防御素3的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種在酵母菌系統(tǒng)中表達(dá)人￠-防御素3的方法，使人 ^ -防御素3基因在甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下獲得高水平表達(dá)，并將人P -防御素3表達(dá)產(chǎn)物分泌到發(fā)酵液培養(yǎng)基中。本發(fā)明的人P -防御素3的表達(dá)方法是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。采用受體菌GS115、載體質(zhì)粒pPIC9k ;目的蛋白的45個(gè)氨基酸的基因片段；重組質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)，質(zhì)粒pPIC9k的^bo/ I和I位點(diǎn)間插入該載體質(zhì)粒的人P防御素3目的基因片段；重組質(zhì)粒導(dǎo)LiCl法導(dǎo)入受體菌GS115前，采用fee I酶進(jìn)行線(xiàn)性化；導(dǎo)入受體菌后，PCR篩選出陽(yáng)性重組子，再用甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到胞外，離心所得到的上清液中即含有表達(dá)的蛋白產(chǎn)物——人P防御素3。人旦-防御素3在酵母菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)方法,包括以下步驟
(1)目的基因hBD-3的擴(kuò)增；
(2)雙酶切hBD-3基因與載體pPIC9k，連接構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化宿主菌巴斯德畢赤酵母 (PicAia pastoriS^)；
(3)篩選后的轉(zhuǎn)化子再用甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心所得上清液中即為人P防御素3。
所述甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)是挑取轉(zhuǎn)化子接種于50 mL BMGY液體培養(yǎng)基，30°C、200 r/min 振蕩培養(yǎng)18h至OD6tltl為2 6, 5000 r/min離心5 min收集菌體,菌體用滅菌水水洗兩次， 將菌體用BMMY液體培養(yǎng)基重懸至OD6tltl值為0. 8 I. 2，每24h補(bǔ)加甲醇至終濃度為0. 5%v/ V，28°C，200r/min連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5天。所述BMGY液體培養(yǎng)基為l%wt酵母提取物，2%wt蛋白胨，I. 34%wtYNB, 0. 0004%。wt 生物素，100 mM pH 6. 0磷酸鹽緩沖液，l%wt甘油。所述轉(zhuǎn)化宿主菌前先將重組質(zhì)粒用Sac I酶進(jìn)行線(xiàn)性化。所述目的基因hBD-3的獲取方法是
設(shè)計(jì)上游引物為5’ -ATCGAATTCATGGGAATCATAAACACATTACAGA-3，,
下游引物為5’ -TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT-3 ;以含 hBD_3 序列的 T 載體為模板，PCR擴(kuò)增出末端帶有I和I酶切位點(diǎn)的目的基因，PCR擴(kuò)增條件如下 94°C變性2 min進(jìn)入循環(huán)，94°C變性30 S，68°C退火50 S，72°C延伸I min，35個(gè)循環(huán)后于 72°C繼續(xù)延伸10 min。所述雙酶切所用限制性?xún)?nèi)切酶為及^7 I和I。所用的宿主為巴斯德畢赤酵母(/7ZcAiaGS115,購(gòu)于Invitrogen。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有的優(yōu)點(diǎn)及有益效果。本發(fā)明的人0防御素3表達(dá)方法，比之于現(xiàn)有技術(shù)，受體菌選用操作簡(jiǎn)便、快捷， 穩(wěn)定及易高密度發(fā)酵特性的畢赤酵母/7ZcAia pastor is作為基因表達(dá)宿主，不僅避免了融合蛋白所造成宿主表達(dá)潛能浪費(fèi)，而且免去移除載體蛋白的繁瑣程序。而且，本發(fā)明所用的表達(dá)載體是pPIC9k，其自身所帶的信號(hào)肽能將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)上清中，易分離提取，純化工藝簡(jiǎn)單，同時(shí)也易于檢測(cè)，為今后的分析研究及工業(yè)化批量生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。


圖I PCR 擴(kuò)增 hBD-3 基因；
圖2 :重組表達(dá)載體pPIC9K-hBD-3的PCR鑒定；
圖3 :重組酵母GS115/ pPIC9K-hBD-3的菌落PCR鑒定；
圖 4 =Tricine-SDS-PAGE 電泳圖譜；
圖5 hBD-3對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性測(cè)定；
Al :金黃色葡萄球菌濃度IO4 cfu /mL下重組酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培養(yǎng)上清液的抗菌活性；
A2 :金黃色葡萄球菌濃度IO4 cfu /mL下宿主菌GS115的培養(yǎng)上清液的抗菌活性；
BI :金黃色葡萄球菌濃度IO5 cfu /mL下重組酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培養(yǎng)上清液的抗菌活性；
B2 :金黃色葡萄球菌濃度IO5 cfu /mL下宿主菌GS115的培養(yǎng)上清液的抗菌活性；
Cl :金黃色葡萄球菌濃度IO6Cfu /mL下重組酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培養(yǎng)上清液的抗菌活性；
C2 :金黃色葡萄球菌濃度IO6 cfu /mL下宿主菌GS115的培養(yǎng)上清液的抗菌活性；
圖6 hBD-3對(duì)大腸桿菌的抗菌活性測(cè)定；
Al :大腸桿菌濃度IO4 cfu /mL下重組酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培養(yǎng)上清液的抗菌活性；
A2 :大腸桿菌濃度IO4 cfu /mL下宿主菌GS115的培養(yǎng)上清液的抗菌活性；
BI :大腸桿菌濃度IO5 cfu /mL下重組酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培養(yǎng)上清液的抗菌活性；
B2 :大腸桿菌濃度IO5 cfu /mL下宿主菌GS115的培養(yǎng)上清液的抗菌活性；
Cl :大腸桿菌濃度IO6Cfu /mL下重組酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培養(yǎng)上清液的抗菌活性；
C2 :大腸桿菌濃度IO6 cfu /mL下宿主菌GS115的培養(yǎng)上清液的抗菌活性；
圖7 :載體質(zhì)粒pPIC9K。具體的實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的人￠-防御素3表達(dá)方法作進(jìn)一步具體的描述。本發(fā)明的表達(dá)方法是在酵母菌系統(tǒng)即巴斯德畢赤酵母(/7ZcAia pas ton’s)表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)人P _防御素3,表達(dá)出來(lái)的蛋白為可溶性分泌型蛋白，分子量約為5KD左右，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有明顯的抑菌活性。本發(fā)明的方法中受體菌是GS115、載體質(zhì)粒是pPIC9k ；目的基因?yàn)?5個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的核苷酸片段；重組質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)，質(zhì)粒pPIC9k的I和Ab( I位點(diǎn)間插入該載體質(zhì)粒的人P防御素3目的基因片段；重組質(zhì)粒導(dǎo)LiCl法導(dǎo)入受體菌GS115前，采用fee I酶進(jìn)行線(xiàn)性化；導(dǎo)入受體菌后，PCR篩選出陽(yáng)性重組子，再用甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中，離心所得到的上清液中即含有表達(dá)的蛋白產(chǎn)物——人P防御素3。表達(dá)方法的具體步驟如下
I.人防御素3基因的獲取
根據(jù)GenBank公布的序列，設(shè)計(jì)合成特異性引物，利用革蘭陰性菌胞膜外層的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激人支氣管上皮細(xì)胞造成損傷,上調(diào)表達(dá)抗菌多肽，提取總RNA，采用RT-PCR和DNA測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù)，獲得了 hBD_3閱讀框的編碼序列，并成功將其裝入T載體中。經(jīng)測(cè)序?qū)λ@得的hBD-3基因序列進(jìn)行驗(yàn)證。2.人￠-防御素3基因的擴(kuò)增
根據(jù)已發(fā)表的hBD-3基因序列，照表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點(diǎn)(圖7)，選取及^7 I 與Not I作為限制性酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了 I對(duì)引物，上游引物為
5’ - ATCGAATTCATGGGAATCATAAACACATTACAGA _3，下游引物為
5’ - TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT -3’ ；
以含以含hBD-3序列的T載體為模板，PCR擴(kuò)增條件如下94°C變性2 min進(jìn)入循環(huán)， 94°C變性30 S，68°C退火50 S，72°C延伸I min，35個(gè)循環(huán)后于72°C繼續(xù)延伸10 min，得到末端帶有及I和I酶切位點(diǎn)的138bp目的基因片段。電泳檢測(cè)如圖I所示，泳道I 為DNA Marker,泳道2、3在紫外光下可見(jiàn)約150 bp大小的目的條帶,與理論相符。3.重組質(zhì)粒pPIC9K-hBD_3的構(gòu)建
將上述PCR產(chǎn)物和pPIC9K載體質(zhì)粒用及I和I雙酶切(37°C，2h)后，再T4連接酶(16°C，18h)將目的基因片段插入經(jīng)雙酶切處理的pPIC9K質(zhì)粒中。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克??；擴(kuò)增提取重組質(zhì)粒并經(jīng)PCR驗(yàn)證，如圖2所示，泳道I為DNA Marker，泳道2、3、4在紫外光下可見(jiàn)約150 bp大小的目的條帶，為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，NC為陰性對(duì)照樣，無(wú)目的條帶。再取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序， 證明目的基因已插入載體PPIC9K的多克隆位點(diǎn)，讀碼框正確，說(shuō)明重組質(zhì)粒pPIC9K-hBD-3 構(gòu)建成功。4.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115 :重組質(zhì)粒pPIC9K-hBD_3用5^1酶線(xiàn)性化后， 使用《畢赤酵母轉(zhuǎn)化手冊(cè)》LiCl法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GSl 15酵母菌中。5.重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-hBD_3的篩選
轉(zhuǎn)化結(jié)束后，立即吸取200 ii L涂布于MD平板，28-30°C培養(yǎng)2d。挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，篩選陽(yáng)性重組酵母，如圖3所示，泳道8為DNA Marker,泳道2 7在紫外光下可見(jiàn)約150 bp大小的目的條帶，為陽(yáng)性重組子，I為以GS115作為模板進(jìn)行菌落PCR的陰性對(duì)照樣，無(wú)目的條帶，說(shuō)明人P -防御素3基因已轉(zhuǎn)入宿主菌GS115，重組畢赤酵母GS115/ pPIC9K-hBD-3 構(gòu)建成功。6.重組人P -防御素3的表達(dá)
將重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-hBD-3接種于50mL BMGY液體培養(yǎng)基中，30°C、200r/ min振蕩培養(yǎng)18h至0D_為2 6, 5000r/min離心5min收集菌體,菌體用滅菌水水洗兩次，將菌體用BMMY培養(yǎng)基重懸至OD6tltl值為I. 0，每24h補(bǔ)加甲醇至終濃度為0. 5% (v/v), 28°C，200r/min連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5d。誘導(dǎo)表達(dá)完成后，室溫12000r/minX 5min離心，取上清， 即為人防御素3。7. SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物
取適量培養(yǎng)上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳參照《分子克隆手冊(cè)》選用適于分離分子量在IOOOODal以下的小分子多肽的電泳方法——Tricine-SDS-PAGE電泳。重組酵母菌甲醇誘導(dǎo)表達(dá)完后，取其上清液進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳，考馬斯亮蘭染色4h,經(jīng)脫色液脫色后，如圖4所示，泳道I為蛋白質(zhì)Marker,泳道4為重組酵母 GS115/pPIC9K-hBD-3,泳道2和3分別為對(duì)照樣宿主菌GS115和不含目的基因的重組酵母 GS115/pPIC9K，泳道4在約5KD處與對(duì)照樣相比有一明顯差異帶，與人防御素3的大小相符，經(jīng)Gene Tools軟件分析，重組hBD_3的表達(dá)量約為150 mg/L。8.人防御素生物活性的測(cè)定
融化的營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基，加入終濃度分別為104、105、106CfU /mL的大腸桿菌或金黃色葡萄球菌，混勻，制成含菌平板。待凝固后，放置牛津杯并注入200i! L重組酵母GS115/ pPIC9K-hBD-3誘導(dǎo)培養(yǎng)上清液，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，觀(guān)察不同菌濃度下抑菌圈的形成，以宿主菌 GSl 15培養(yǎng)上清作為對(duì)照。如圖5 (金黃色葡萄球菌)和圖6 (大腸桿菌)所示，標(biāo)識(shí)A、B、C分別代表平板中菌濃度為IO4 cfu /mL、105 cfu /mL和IO6 cfu /mL，標(biāo)識(shí)I和2分別代表重組酵母GSl 15/ pPIC9K-hBD-3和宿主菌GSl 15的培養(yǎng)上清液。重組酵母GS115/pPIC9K_hBD_3的培養(yǎng)上清液在不同的菌濃度下均能產(chǎn)生明顯的抑菌圈，其抑菌效果大大優(yōu)于宿主菌GS115，并且重組酵母GS115/pPIC9K-hBD-3的培養(yǎng)上清液對(duì)大腸桿菌或金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均具有不同程度的抑制作用，對(duì)濃度為IO6 cfu /mL的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)也起到較好的抑制效果。
權(quán)利要求
1.人￠-防御素3在酵母菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)目的基因hBD-3的擴(kuò)增；(2)雙酶切hBD-3基因與載體pPIC9k，連接構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化宿主菌巴斯德畢赤酵母 (.Pichia pas toris )；(3)篩選后的轉(zhuǎn)化子再用甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心所得上清液中即為人P防御素3。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的表達(dá)方法，其特征在于，所述甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)是挑取轉(zhuǎn)化子接種于50 mL BMGY液體培養(yǎng)基，300C >200 r/min振蕩培養(yǎng)18h至OD600為2 6，5000 r/min 離心5 min收集菌體，菌體用滅菌水水洗兩次，將菌體用BMMY液體培養(yǎng)基重懸至OD6tltl值為 0. 8 I. 2，每24h補(bǔ)加甲醇至終濃度為0. 5%v/v，28°C，200r/min連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5天。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的表達(dá)方法，其特征在于，所述BMGY液體培養(yǎng)基為l%wt酵母提取物，2°/(^蛋白胨，1.34°/(^￥他，0.0004%。被生物素，100 mM pH 6. 0磷酸鹽緩沖液，l%wt 甘油。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的表達(dá)方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化宿主菌前先將重組質(zhì)粒用 Sac I酶進(jìn)行線(xiàn)性化。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的表達(dá)方法，其特征在于，所述目的基因hBD-3的獲取方法是設(shè)計(jì)上游引物為5’ -ATCGAATTCATGGGAATCATAAACACATTACAGA-3，,下游引物為5’ -TATAGCGGCCGCCTATTTCTTTCTTCGGCAGCAT-3 ;以含 hBD_3 序列的 T 載體為模板，PCR擴(kuò)增出末端帶有I和I酶切位點(diǎn)的目的基因，PCR擴(kuò)增條件如下 94°C變性2 min進(jìn)入循環(huán)，94°C變性30 S，68°C退火50 S，72°C延伸I min，35個(gè)循環(huán)后于 72°C繼續(xù)延伸10 min。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的表達(dá)方法，其特征在于，所述雙酶切所用限制性?xún)?nèi)切酶為 EcoR I 和I。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的表達(dá)方法，其特征在于，所用的宿主為巴斯德畢赤酵母 {Pi chi a pas tori s ) GS115。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了人β-防御素3在酵母菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)方法，載體質(zhì)粒為pPIC9k，目的蛋白為45個(gè)氨基酸，導(dǎo)入前采用SacI酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行線(xiàn)性化。該生產(chǎn)工藝可使人β-防御素3基因在甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下獲得高水平表達(dá)，并將人β-防御素3表達(dá)產(chǎn)物分泌到發(fā)酵液培養(yǎng)基中，為人β-防御素3更大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102586256SQ20121001201
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者余以剛, 劉冬梅, 吳暉, 唐語(yǔ)謙, 李曉鳳, 汪芳, 肖俊梅, 肖性龍, 袁琨 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)