專利名稱：用于經(jīng)典豬瘟的標(biāo)記疫苗的制作方法
用于經(jīng)典豬瘟的標(biāo)記疫苗描述本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防性治療經(jīng)典豬瘟的標(biāo)記疫苗，其包含修飾的減毒活經(jīng)典豬瘟病毒。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，這種標(biāo)記疫苗的特征在于，編碼TAV-表位的病毒核苷酸序列和/或TAV-表位的氨基酸序列包含與疾病相關(guān)性豬瘟病毒不同的序列，從而可以通過血清學(xué)和/或基因組分析方法，將顯示疾病相關(guān)性豬瘟病毒感染的受試者與用本發(fā)明標(biāo)記疫苗接種的受試者區(qū)分。發(fā)明背景
經(jīng)典豬瘟(CSF)是在世界范圍發(fā)生并且具有重大政治及經(jīng)濟(jì)意義的一種流行性動物疾病(Vand印utte和ChappuiS，1999)。經(jīng)典豬瘟，也稱作豬霍亂或豬瘟疫(pigplague)，是一旦在任何成員國中出現(xiàn)必須在歐盟層面以及向世界動物衛(wèi)生組織(OIE)作出國際通報的疾病之一。經(jīng)典豬瘟由黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的一種小的包膜RNA病毒引起。豬瘟病毒的天然宿主僅是家養(yǎng)和野生的豬物種(例如，歐洲野豬)。已經(jīng)在歐盟內(nèi)部嘗試在不預(yù)防性接種情況下通過嚴(yán)厲措施根除CSF，自1990以來已經(jīng)禁用預(yù)防性接種。盡管禁用，然而作為緊急接種，在豬瘟出現(xiàn)的情況下，接種仍代表法律批準(zhǔn)的選項。在這種情況下中，接種應(yīng)當(dāng)通過緊急接種計劃之一進(jìn)行，這些計劃已經(jīng)由歐盟批準(zhǔn)(見理事會指令第19號，2001/89/EC)。直至現(xiàn)在，羅馬尼亞是已經(jīng)實(shí)施過緊急接種的唯一國家。這種有限應(yīng)用的原因在于當(dāng)前可獲得的標(biāo)記疫苗的技術(shù)性約束，如疫苗效力限制，此外還有涉及常規(guī)接種動物的貿(mào)易壁壘(對國際銷售的限制)。許可的標(biāo)記疫苗的效率不能與顯示明顯優(yōu)點(diǎn)的修飾的活疫苗相比，并且這些滅活疫苗或亞單位疫苗無論如何不適合用于緊急接種，原因在于免疫力發(fā)動較晚和需要再接種?？紤]歐盟向東歐國家擴(kuò)大和日益增加的全球化，已經(jīng)討論了用于潛在緊急接種的新策略，其將在避免大規(guī)模剔除動物和相關(guān)經(jīng)濟(jì)損失方面發(fā)揮重要作用的(Leifer等人，2009)。因此對于高度有效的疫苗存在迫切需要，這種疫苗允許在接種和未接種的動物之間進(jìn)行血清學(xué)區(qū)分并且還顯示傳統(tǒng)修飾的活疫苗的全部優(yōu)點(diǎn)。因為基于CSF病毒E2糖蛋白的第一代標(biāo)記疫苗僅具有受限制的可獲得性和嚴(yán)重缺點(diǎn)，如儲存條件、成本、效力，所以對新的標(biāo)記疫苗存在巨大需求。已經(jīng)研究了這類疫苗的多種候選物，如DNA疫苗、免疫原性肽、載體疫苗、缺失突變體和嵌合豬瘟病毒(Beer等人，2007 ；Dong和Chen, 2007)。這些標(biāo)記疫苗候選物的大部分顯示以下缺點(diǎn)它們通過現(xiàn)代基因修飾方法產(chǎn)生。除復(fù)雜的準(zhǔn)許程序之外，還由于顧客明顯懼怕基因修飾的產(chǎn)品，基因修飾的疫苗顯示明顯的缺點(diǎn)。針對CSFV的傳統(tǒng)疫苗包括修飾的活疫苗。這類疫苗在單次應(yīng)用后是高度有效的，但是不允許基于血清學(xué)譜區(qū)分接種動物和感染動物。這些疫苗中的多種基于經(jīng)典毒株“C”或其衍生物(所謂“C-株疫苗”)。另外，存在基于日本毒株“豚鼠興奮陰性(GPE-)”、“Thiverval”株和“墨西哥PAV”株的疫苗，這些疫苗均已經(jīng)在地區(qū)和國際環(huán)境下使用(Blome 等人，2006 ;Greiser_Wilke 和 Moennig, 2004 ；van Oirschot, 2003)。的確存在關(guān)于使用C-株疫苗的廣泛數(shù)據(jù)。已知在應(yīng)用這種疫苗4日后，可以顯示動物受到抗強(qiáng)毒CSFV攻毒感染的完全保護(hù)。另外，接種后7日，在攜帶動物中提供免于攻毒病毒垂直傳播的完全保護(hù)(de Smit 等人，2001)。已知的修飾活疫苗的明顯缺點(diǎn)是完全不能血清學(xué)地區(qū)分接種動物和感染動物。有鑒于此，本發(fā)明的一項任務(wù)是提供一種能夠區(qū)分接種動物和感染動物的修飾活疫苗。在標(biāo)記疫苗領(lǐng)域，所謂的亞單位疫苗是現(xiàn)有技術(shù)已知的，這些亞單位疫苗基于CSFV的重組E2糖蛋白。這類疫苗的區(qū)分試驗是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，其中針對Ems糖蛋白的抗體用來間接地檢測CSF病毒感染。在目前，僅一種E2-亞單位疫苗是市場上可獲得的，然而，許可證延遲了幾個月(見EMA (歐洲藥品管理局)關(guān)于E2亞單位疫苗的報道)。姑且不論不能銷售這類產(chǎn)產(chǎn)品，這些系統(tǒng)顯示嚴(yán)重的生物學(xué)缺點(diǎn)。一個這樣的缺點(diǎn)是，在傳遞完全保護(hù)之前需要至少兩次腸胃外免疫，這導(dǎo)致此類疫苗與以單次劑量用疫
苗餌料飼喂動物的“餌料接種法”完全不匹配。此外，緊急接種計劃僅在多個實(shí)驗中使用針對野生型CSFV的E2亞單位疫苗保護(hù)時，沒有實(shí)現(xiàn)免遭垂直傳播的完全保護(hù)的情況下才是合理的。這類系統(tǒng)的另一個缺點(diǎn)是，針對糖蛋白Ems的抗體用于血清學(xué)區(qū)分并且這類檢驗體系的靈敏度和特異性僅是略微中等的(Floegel-Niesmann，2003)?；畹臏p毒CSF疫苗是本領(lǐng)域已知的，但是至今受困于多種缺點(diǎn)。現(xiàn)有技術(shù)中公開的大部分疫苗包含外來DNA并且使用基因工程方法(也稱作重組DNA技術(shù))產(chǎn)生，因此嚴(yán)重的環(huán)境風(fēng)險評估問題伴隨這種產(chǎn)品。已知其中從野生型TAV表位中置換或缺失氨基酸的其他CSFV變體(WO 2010/074575A2)。然而，在本發(fā)明中修飾的氨基酸殘基和/或核苷酸在現(xiàn)有技術(shù)中既沒有公開，有沒有提示。多次傳代也已經(jīng)被用來產(chǎn)生可以用作疫苗的病毒變體，不過先前沒有應(yīng)用抗體壓力。如現(xiàn)有技術(shù)中公開的旨在產(chǎn)生變體的病毒感染培養(yǎng)物的多次傳代因此受到以下限制不得不實(shí)施大量培養(yǎng)物傳代并且還無法控制將要修飾哪個表位(Hulst等人)。Kortekaas等人描述一種遺傳穩(wěn)定的、活的減毒CSF疫苗，所述疫苗能夠血清學(xué)地將感染動物與接種動物區(qū)分。將突變的C-株使用定向方法進(jìn)行基因修飾，由此使用重組DNA技術(shù)來將缺失引入CSFV的E2蛋白中。通過多次傳代在病毒基因組內(nèi)部的多個位置隨后獲得其他突變，以產(chǎn)生顯示增殖增強(qiáng)的毒株。在Kortekaas等人中公開的毒株是基因修飾的病毒，考慮到用于釋放基因修飾產(chǎn)物至環(huán)境中的復(fù)雜準(zhǔn)許過程，這是一個明顯缺點(diǎn)。Holinka等人公開了一種減毒的雙抗原標(biāo)記活CSFV毒株“FlagT4vn”，其中通過組合兩個減毒遺傳定子獲得所述毒株。FlagT4v攜帶通過在El糖蛋白中19聚物插入所導(dǎo)入的陽性抗原標(biāo)記(合成性Flag表位)和因突變E2糖蛋白中的單克隆抗體WH303(mAbWH303)表位的結(jié)合位點(diǎn)所產(chǎn)生的陰性標(biāo)記。鼻內(nèi)或肌內(nèi)施用FlagT4v保護(hù)豬在接種后早期(2或3H )和晚期(28 H )時間免遭強(qiáng)毒CSFV Brescia株影響。FlagT4v在豬中誘導(dǎo)針對Flag表位強(qiáng)烈反應(yīng)的抗體應(yīng)答，但是不能抑制mAb WH303與代表WH303表位的合成肽結(jié)合。在Holinka中公開的疫苗涉及一種基因工程病毒，所述病毒在其基因組內(nèi)顯示外來DNA(除相關(guān)的載體序列和標(biāo)記之外還有FLAG-標(biāo)簽序列)。與不顯示外來或重組DNA的本發(fā)明相比，這表示一個明顯缺點(diǎn)。文獻(xiàn)WO 2007/143442A2描述了在CSFV E2的WH303表位內(nèi)部突變的效果，所述突變將強(qiáng)毒Brescia CSFV的氨基酸序列逐步向BVDV毒株NADL的同源性氨基酸序列改變。在接種后第3日和21日用強(qiáng)毒Brescia病毒攻毒時，被病毒突變體感染的動物受到保護(hù)。在WH303表位內(nèi)部這個位點(diǎn)處的修飾還導(dǎo)致開發(fā)區(qū)分接種動物與感染動物的診斷試驗。即便存在這些效果，然而使用基因工程引入這些突變，因此將外來遺傳物質(zhì)導(dǎo)入病毒疫苗中。上述的現(xiàn)有技術(shù)公開了通過重組遺傳技術(shù)被轉(zhuǎn)基因而產(chǎn)生病毒毒株的疫苗。如上文所述，遺傳學(xué)上轉(zhuǎn)基因的疫苗遭遇環(huán)境安全性顧慮并且受困于復(fù)雜的準(zhǔn)許方案和一般公眾當(dāng)中的恐懼，因此為它們的使用帶來明顯缺點(diǎn)。發(fā)明簡述鑒于現(xiàn)有技術(shù)，作為本發(fā)明基礎(chǔ)的技術(shù)問題是為家養(yǎng)豬和野生豬提供一種標(biāo)記疫苗，所述標(biāo)記疫苗提供免遭經(jīng)典豬痕病毒影響的保護(hù)，能夠區(qū)分接種動物和感染動物，優(yōu)選地通過常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，這種標(biāo)記疫苗不通過重組基因修飾技術(shù)產(chǎn)生。這個問題由獨(dú)立權(quán)利要求的特征解決。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案由從屬權(quán)利要求提 供。本發(fā)明因此涉及一種用于預(yù)防性治療經(jīng)典豬瘟的標(biāo)記疫苗，其包含修飾的減毒活經(jīng)典豬瘟病毒。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及一種用于預(yù)防性治療經(jīng)典豬瘟的標(biāo)記疫苗，其包含修飾的減毒活經(jīng)典豬瘟病毒，特征在于E2蛋白的TAV-表位的病毒氨基酸序列包含與野生型經(jīng)典豬瘟病毒不同的序列，由此所述病毒氨基酸序列顯示以下置換的至少一種-氨基酸830的置換；丙氨酸至纈氨酸，-氨基酸833的置換；脯氨酸至絲氨酸，-氨基酸839的置換；谷氨酸至甘氨酸。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)記疫苗的特征在于修飾的病毒不通過重組DNA方法產(chǎn)生。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)記疫苗的特征在于病毒的核苷酸序列顯示一種或多種以下置換-在核苷酸位置2862處的置換；T至C，-在核苷酸位置2870處的置換；G至A，-在核苷酸位置2889處的置換；G至A。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)記疫苗的特征在于病毒的氨基酸序列顯示一種或多種以下置換-在蛋白質(zhì)Eens中氨基酸426的置換；異亮氨酸至纈氨酸，-在蛋白質(zhì)El中氨基酸576的置換；酪氨酸至組氨酸，-在蛋白質(zhì)El中氨基酸583的置換；天冬氨酸至谷氨酸，-在蛋白質(zhì)E2中氨基酸951的置換；蘇氨酸至異亮氨酸。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)記疫苗的特征在于病毒的核苷酸序列顯示一種或多種以下置換-在核苷酸位置1649處的置換；A至G，-在核苷酸位置2099處的置換；T至C，
-在核苷酸位置2122處的置換；T至G，-在核苷酸位置3225處的置換；C至T。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)記疫苗的特征在于TAV-表位的病毒氨基酸序列包含根據(jù)SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4的序列。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)記疫苗的特征在于病毒的核苷酸序列包含根據(jù)SEQ ID NO. I的序列。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)記疫苗的特征在于，用如本文所述的疫苗治療的受試者與被疾病相關(guān)性豬瘟病毒感染受試者，可以通過使用血清學(xué)和/或基因組分析方法分析從所述受試者獲得的生物學(xué)樣品來將區(qū)分。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)記疫苗的特征在于基因組分析方法基于聚合酶 鏈反應(yīng)(PCR)、優(yōu)選地基于實(shí)時PCR，由此使用識別修飾的和/或疾病相關(guān)的病毒核苷酸序列的引物和/或探針。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)記疫苗的特征在于血清學(xué)分析方法基于酶免疫測定(EIA)、優(yōu)選地基于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，由此使用與修飾的和/或疾病相關(guān)的TAV-表位特異性結(jié)合的抗體。本發(fā)明的又一個方面涉及一種標(biāo)記疫苗，優(yōu)選地如本文所述的標(biāo)記疫苗，其可通過施加抗體壓力而生成疾病相關(guān)性或其他已知的豬瘟病毒株的病毒逃逸突變體來獲得。本發(fā)明的又一個方面涉及一種制造修飾的減毒活經(jīng)典豬瘟病毒疫苗株、優(yōu)選地如本文所述的疫苗株的方法，所述方法包括通過施加抗體壓力而生成疾病相關(guān)性或其他已知的豬瘟病毒株的逃逸突變體。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，如本文所述的制造方法特征在于所述方法包括-在細(xì)胞培養(yǎng)下多次傳代被疾病相關(guān)性豬瘟病毒感染的細(xì)胞，優(yōu)選仔豬胚腎細(xì)胞，和-同時施加針對疾病相關(guān)性豬瘟病毒E2蛋白的TAV-表位的抗體和/或CTAVSPTTLRTEVVK-肽免疫的兔的多克隆血清。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含如本文所述的標(biāo)記疫苗連同可藥用載體。本發(fā)明的又一個方面涉及如本文所述的標(biāo)記疫苗，作為藥物用于經(jīng)典豬瘟的預(yù)防性治療(接種)中，優(yōu)選地通過肌內(nèi)注射或口服施加。本發(fā)明的又一個方面涉及一種用于預(yù)防性治療(接種)經(jīng)典豬瘟的方法，所述方法包括將如本文所述的標(biāo)記疫苗施用至、優(yōu)選地通過肌內(nèi)注射或口服施加至受試者，優(yōu)選地是豬。經(jīng)典豬瘟需要接種疫苗的另一個常見情況對應(yīng)于在豬群中檢測野毒感染。當(dāng)豬的感染發(fā)生，以至于經(jīng)典豬瘟病毒在野生豬或家養(yǎng)豬中存在時，需要對周圍和/或相鄰豬群緊急接種。隨后在周圍區(qū)域內(nèi)對直至I歲至2歲全部豬(無論野生或家養(yǎng))實(shí)施接種，目的是避免豬瘟病毒的暴發(fā)或大規(guī)模感染。本發(fā)明的標(biāo)記疫苗理想地適用于豬瘟檢測或暴發(fā)情況下的緊急接種。除注射之外，這種標(biāo)記疫苗還便于通過口服途徑快速和有效施用，并且允許區(qū)分被野毒(發(fā)熱相關(guān)性)和疫苗感染的動物。發(fā)明詳述本發(fā)明疫苗的開發(fā)不基于基因修飾方法，反而基于以下原理當(dāng)置于選擇性抗體壓力下之時，病毒將以適應(yīng)性方式自我修飾。本發(fā)明因此涉及非基因修飾的活疫苗，所述活疫苗提供對抗強(qiáng)毒CSFV的保護(hù)，顯示全部標(biāo)記疫苗的要求(血清學(xué)上和遺傳上不同)。這種標(biāo)記疫苗是通過施加選擇性抗體壓力至細(xì)胞培養(yǎng)下的不同C-株進(jìn)行工程化制造。產(chǎn)生的變體優(yōu)選地?fù)碛性贓2TAV表位中的3個氨基酸交換和在El蛋白中的兩個補(bǔ)償性交換。這些變體的穩(wěn)定性通過在轉(zhuǎn)瓶中多于10次細(xì)胞培養(yǎng)傳代而得到證明，并且例如，肌內(nèi)接種豬導(dǎo)致針對高度毒力的攻毒株的完全保護(hù)。另外，通過血清學(xué)和/或遺傳技術(shù)，例如通過區(qū)分性免疫熒光染色和實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rRT-PCR)系統(tǒng)，能夠進(jìn)行直接DIVA(differentiating infected from vaccinated animal,區(qū)分免疫和感染動物)。另外，通過優(yōu)化商業(yè)E2-ELISA(例如通過改變臨界值)或開發(fā)TAV特異性肽ELISA系統(tǒng)，間接DIVA可能是可實(shí)現(xiàn)的。因此，提出了一種針對CSFV的非基因修飾的活的標(biāo)記疫苗。
本發(fā)明疫苗的產(chǎn)生如下進(jìn)行。通過將C-株病毒在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(IFN仔豬胚腎細(xì)胞)中施加E2-TAV特異性抗體和CTAVSPTTLRTEVVK-肽免疫的兔的多克隆血清期間傳代，選擇天然存在的C-株“Riems”逃逸突變體。除肽處理的多克隆兔血清中所含有的抗體之外還施加的抗體特異性識別CSF病毒E2蛋白中的TAV-表位，并且通過與這個表位結(jié)合而中和CSF(C-株)病毒。CSFV因其RNA本質(zhì)而顯示高突變率。在提供中和抗體的選擇性壓力下，選出在與抗體結(jié)合的表位(在此情況下，TAV-表位)發(fā)生突變的病毒，由此未改變的野生型病毒被中和。通過在多種的抗體和兔血清的濃度以及混合物下多次傳代，可以選出多個突變的病毒分離株。首先選出帶有TAV-表位中置換的病毒。通過在多種類型的抗體壓力下這些病毒的進(jìn)一步傳代，選出一種分離株，其顯示在TAV-表位中的2個置換和El蛋白中的單個補(bǔ)償性置換(El和E2之間的相互作用對于病毒結(jié)構(gòu)是重要的)。將這些病毒置于其他抗體壓力下，這導(dǎo)致分離出除El蛋白中的兩個補(bǔ)償性置換還在TAV-表位中帶有3個置換的病毒。所得到的病毒(0株“虹61118，，07、(-株“1^61118”510和C-株“Riems，，011)還顯示在E2蛋白中位置2862、2870和2889、3225處的置換，此外還有在ERNS蛋白中位置1649處的置換，還有在El蛋白位置2099和2122處的變化。表I :TAV逃逸突變體的進(jìn)一步信息
權(quán)利要求
1.用于預(yù)防性治療經(jīng)典豬瘟的標(biāo)記疫苗，其包含修飾的減毒活經(jīng)典豬瘟病毒， 特征在于E2蛋白的TAV-表位的病毒氨基酸序列包含與野生型經(jīng)典豬瘟病毒不同的序列， 由此所述病毒氨基酸序列顯示以下置換的至少一種 -氨基酸830的置換；丙氨酸至纈氨酸， -氨基酸833的置換；脯氨酸至絲氨酸， -氨基酸839的置換；谷氨酸至甘氨酸。
2.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的標(biāo)記疫苗，其特征在于，修飾的病毒不通過重組DNA方法產(chǎn)生。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的標(biāo)記疫苗，其特征在于，病毒的核苷酸序列顯示一種或多種以下置換 -在核苷酸位置2862處的置換；T至C， -在核苷酸位置2870處的置換；G至A， -在核苷酸位置2889處的置換；G至A。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的標(biāo)記疫苗，其特征在于，病毒的氨基酸序列顯示一種或多種以下置換 -在蛋白質(zhì)Ekns中氨基酸426的置換；異亮氨酸至纈氨酸， -在蛋白質(zhì)El中氨基酸576的置換；酪氨酸至組氨酸， -在蛋白質(zhì)El中氨基酸583的置換；天冬氨酸至谷氨酸， -在蛋白質(zhì)E2中氨基酸951的置換；蘇氨酸至異亮氨酸。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的標(biāo)記疫苗，其特征在于，病毒的核苷酸序列顯示一種或多種以下置換 -在核苷酸位置1649處的置換；A至G, -在核苷酸位置2099處的置換；T至C， -在核苷酸位置2122處的置換；Τ至G， -在核苷酸位置3225處的置換；C至T。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的標(biāo)記疫苗，其特征在于，TAV-表位的病毒氨基酸序列包含根據(jù)SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4的序列。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的標(biāo)記疫苗，其特征在于，病毒的氨基酸序列包含根據(jù)SEQ ID NO. I的序列。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的標(biāo)記疫苗，其特征在于，用所述疫苗治療的受試者與被疾病相關(guān)性豬瘟病毒感染受試者能夠通過使用血清學(xué)和/或基因組分析方法分析從所述受試者獲得的生物學(xué)樣品而被區(qū)分。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的標(biāo)記疫苗，其特征在于，所述基因組分析方法基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、優(yōu)選地基于實(shí)時PCR，由此使用識別修飾的和/或疾病相關(guān)的病毒核苷酸序列的引物和/或探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的標(biāo)記疫苗，其特征在于，所述血清學(xué)分析方法基于酶免疫測定(EIA)、優(yōu)選地基于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，由此使用與修飾的和/或疾病相關(guān)的TAV-表位特異性結(jié)合的抗體。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的標(biāo)記疫苗，通過施加抗體壓力而生成疾病相關(guān)性或其他已知的豬瘟病毒株的病毒逃逸突變體可獲得。
12.制造修飾的減毒活經(jīng)典豬瘟病毒疫苗株、優(yōu)選權(quán)利要求I至11中任一項所述的疫苗的方法，包括通過施加抗體壓力而生成疾病相關(guān)性或其他已知的豬瘟病毒株的逃逸突變體。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述方法包括 -在細(xì)胞培養(yǎng)下多次傳代被疾病相關(guān)性豬瘟病毒感染的細(xì)胞、優(yōu)選仔豬胚腎細(xì)胞，和 -同時施加針對疾病相關(guān)性豬瘟病毒E2蛋白的TAV-表位的抗體和/或CTAVSPTTLRTEVVK-肽免疫的兔的多克隆血清。
14.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求I至11中任一項所述的標(biāo)記疫苗和可藥用載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求I至11中任一項所述的標(biāo)記疫苗，作為藥物用于經(jīng)典豬瘟的預(yù)防性治療(接種)中，優(yōu)選地通過肌內(nèi)注射或口服施加。
16.用于預(yù)防性治療(接種)經(jīng)典豬瘟的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求I至11中任一項所述的標(biāo)記疫苗施用至、優(yōu)選地通過肌內(nèi)注射或口服施用至受試者、優(yōu)選地是豬。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防性治療經(jīng)典豬瘟的標(biāo)記疫苗，其包含修飾的減毒活經(jīng)典豬瘟病毒。E2蛋白的TAV-表位的病毒氨基酸序列包含與野生型經(jīng)典豬瘟病毒不同的序列。本發(fā)明涉及這種標(biāo)記疫苗的藥物組合物。本發(fā)明還涉及一種使用選擇性抗體壓力制造用于預(yù)防經(jīng)典豬瘟的標(biāo)記疫苗的方法。
文檔編號C07K14/18GK102905725SQ201180024834
公開日2013年1月30日 申請日期2011年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者馬丁·貝爾, 桑德拉·布洛梅, 伊曼紐爾·萊費(fèi)爾 申請人:里姆瑟藥物股份公司