專利名稱：一種連續(xù)模擬移動床色譜分離制備高純度低聚半乳糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及功能糖制備領(lǐng)域，特別涉及一種高純度低聚半乳糖的制備方法。
背景技術(shù)：
低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharides,簡稱G0S)是ー種具有天然屬性的非消化性低聚糖，在人類母乳中含量較多，嬰兒體內(nèi)雙岐桿菌菌群的建立很大程度上依賴于母乳中的低聚半乳糖成分。同其他非消化性低聚糖相比，低聚半乳糖具有專ー性促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌增值、安全性高、對食品加工熱處理穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，同時由于其生產(chǎn)用原料來源廣泛，在食品、保健品等方面具有廣泛的應(yīng)用，生產(chǎn)和應(yīng)用低聚半乳糖在食品エ業(yè)領(lǐng)域具有巨大潛力。目前，全球生產(chǎn)低聚半乳糖的廠家主要在日本，我國對低聚半乳糖的生產(chǎn)還未規(guī)?；幱谘芯侩A段。低聚半乳糖中所含單糖組分如葡萄糖、半乳糖等直接影響其應(yīng)用價值。葡萄糖組分的存在會妨礙低聚半乳糖促進(jìn)雙歧桿菌的増殖效果；而且，由于葡萄糖不適于糖尿病人、肥胖病人等忌糖人士的食用，也降低了低聚半乳糖在食品、保健品及藥品中的應(yīng)用價值。因此，除去低聚半乳糖中葡萄糖等單糖組分，提高純度，不但能夠促進(jìn)產(chǎn)品的生理功能的發(fā)揮，還可以大大促進(jìn)其在醫(yī)藥級產(chǎn)品中的應(yīng)用。因此，提高低聚半乳糖產(chǎn)品純度、增加產(chǎn)品品質(zhì)成為當(dāng)前低聚半乳糖產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用的迫切需求?，F(xiàn)有技術(shù)中，有專利文獻(xiàn)提到制備含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的方法。其制備了 β -半乳糖苷酶粗酶液來處理乳清粉，在降低乳清粉中乳糖的同時得到了高含量的低聚半乳糖。但是對于高含量低聚半乳糖溶液中其他組分如單糖、乳糖等的分離并未提及，要實(shí)現(xiàn)エ業(yè)生產(chǎn)高純度低聚半乳糖產(chǎn)品，還需要對高含量低聚半乳糖進(jìn)行進(jìn)一步分離純化處理。另有專利文獻(xiàn)中公開了利用固定化酵母去除低聚半乳糖中單糖組分的方法。其應(yīng)用固定化酵母去除低聚半乳糖溶液中的單糖，除去了葡萄糖，從而提高低聚半乳糖含量。此報導(dǎo)較好的去除了部分單糖組分，但是半乳糖卻無法去除，同時雙糖組分乳糖并未得到很好的分離。也有文獻(xiàn)提及納濾純化低聚糖的方法。但實(shí)際生產(chǎn)中，納濾分離低聚糖，僅適用于單糖與三糖或多糖分離，也就是說納濾分離低聚糖適用于分子量小于200與大于500之間組分的分離，此報導(dǎo)用以單糖和ニ糖(分子量分別為180與342)之間的分離效果差、需用較多純水，同時透析廢水濃度極低，回收困難、主產(chǎn)品回收率大大下降，不適于エ業(yè)化生產(chǎn)。納濾分離產(chǎn)品純度為80%時效率較高，性價比合適，隨著純度的進(jìn)ー步提高，分離效率迅速下降，成本升高，因此要得到更高純度產(chǎn)品還需要采用其他分離方法。本專利采用十床式連續(xù)模擬移動床色譜分離技術(shù)，對離子交換處理后的50 65%原料液進(jìn)行有效制備分離，總柱效高，實(shí)現(xiàn)了連續(xù)化操作，成功實(shí)現(xiàn)了低聚半乳糖和葡萄糖、半乳糖、乳糖組分的分離，低聚半乳糖產(chǎn)品純度達(dá)95%以上。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有低聚半乳糖終產(chǎn)品純度不高等生產(chǎn)問題，本發(fā)明提供了十床式連續(xù)模擬移動床色譜分離制備95%純度以上低聚半乳糖產(chǎn)品的方法，提高低聚半乳糖生產(chǎn)轉(zhuǎn)化產(chǎn)率、提高終產(chǎn)品純度。本發(fā)明具體是通過以下措施實(shí)現(xiàn)的(I)高產(chǎn)菌株米曲霉Aspeigillus oryzaeBLB-21 (已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，保藏時間為2009年3月17日，保藏號CGMCC No. 2951)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后ニ級種子以10% (V/V)的量接入到40%乳糖溶液中發(fā)酵，發(fā)酵罐體積150L，裝液量為60%，調(diào)節(jié)pH5. 5，25 40°C發(fā)酵30-40h，攪拌轉(zhuǎn)速250rpm，通氣量200L/h ；種子培養(yǎng)基葡萄糖300-500g/L，酵母膏15g/L，瓊脂粉15g/L，pH自然(約5. 5)，磷酸ニ氫鉀lg/し，硫酸鎂O. 5g/L,尿素5g/L ；(2)超濾采用陶瓷膜超濾，去除菌體及發(fā)酵液中酶、蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)，初歩得到糖組分混合液；(3)活性炭脫色對超濾后的糖溶液按2%加入活性炭，80°C反應(yīng)60min，脫色過濾；(4)離子交換采用強(qiáng)酸性陽離子-弱堿性陰離子-強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，溫度30-50°C，進(jìn)樣量10L/h，樹脂高度Im進(jìn)行分離脫鹽，經(jīng)HPLC檢測可得低聚半乳糖含量為55%的糖溶液。此時糖組分為葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖；(5)色譜分離采用連續(xù)模擬移動床色譜分離法，以鈣型離子樹脂為載體，通過研究樹脂層高度、電磁閥控制模擬移動床切換周期、控制流量、流速等參數(shù)，采用10床式連續(xù)法色譜分離裝置(圖I)，參數(shù)為樹脂柱裝填高度為O. 65m，分配盤轉(zhuǎn)速為3° /min，進(jìn)料濃度55-65%，進(jìn)料溫度60-70°C，進(jìn)料流速I. 2-1. 8L/h，進(jìn)水流速2_3L/h，流出液流速I. 4-2. OL/h，洗脫液流速I. 8-2. 8L/h可分離得到95%以上高純度低聚半乳糖產(chǎn)品。(6)蒸發(fā)濃縮經(jīng)色譜分離的產(chǎn)品通過六效降膜式蒸發(fā)濃縮器得高純度低聚半乳糖漿；(7)噴霧干燥采用壓力式噴霧干燥塔干燥得高純度低聚半乳糖固體。高純度低聚半乳糖制備生產(chǎn)エ藝流程斜面種子一一級種子一ニ級種子一發(fā)酵(20-40%乳糖溶液)一超濾一脫色(活性炭)一離子交換一色譜分離(90% )—蒸發(fā)濃縮一高純度低聚半乳糖漿一噴霧干燥一高純度低聚半乳糖固體本發(fā)明發(fā)酵法生產(chǎn)低聚半乳糖エ藝與現(xiàn)有技術(shù)相比，有如下優(yōu)點(diǎn)(I)本專利所得95%以上高純度低聚半乳糖產(chǎn)品，去除了葡萄糖等單糖和乳糖組分，不僅利于低聚半乳糖產(chǎn)品雙歧桿菌増殖等優(yōu)良生理效用的發(fā)揮，而且適用于忌糖人士， 具有更加廣泛的保健和藥用價值；(2)陶瓷膜超濾，去除菌體效率較傳統(tǒng)壓濾高；(3)采用十床式連續(xù)模擬移動床色譜分離，分離效果好，產(chǎn)品低聚半乳糖純度可達(dá)95%以上，很好的實(shí)現(xiàn)了低聚半乳糖溶液中單糖、乳糖的完全分離，分離效率高，產(chǎn)品品質(zhì)好。


附圖I為本發(fā)明10床式連續(xù)法色譜分離裝置結(jié)構(gòu)示意圖。圖中A_J為10根填料柱，ト10依次為10根填料柱的進(jìn)料ロ、出料ロ，a為進(jìn)料55%低聚半乳糖糖液，b為出料95%低聚半乳糖糖液，c為流出液葡萄糖、半乳糖及乳糖副產(chǎn)品，d為水。圖中，箭頭表示液體流動方向。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :
菌株BLB-21接入葡萄糖濃度為300g/L的種子液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。ニ級種子液(濃度菌絲濕重O. 52%)以10% (V/V)的量接入到20%乳糖溶液中發(fā)酵，調(diào)節(jié)ρΗ5· 5，25 30°C發(fā)酵40h。經(jīng)超濾初歩得到糖組分混合液，活性炭脫色后采用強(qiáng)酸性陽離子-弱堿性陰離子-強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，溫度30 35°C，進(jìn)樣量10L/h，樹脂高度Im進(jìn)行分離脫鹽，經(jīng)HPLC檢測得低聚半乳糖含量為55. 24%的糖溶液。此時糖組分為葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖。色譜分離參數(shù)為樹脂柱裝填高度為O. 65m，分配盤轉(zhuǎn)速為3° /min，進(jìn)料濃度60%,進(jìn)料溫度63°C，進(jìn)料流速I. 4L/h，進(jìn)水流速2. 3L/h，流出液流速I. 5L/h，洗脫液流速
I.8L/h可分離得到96. 74%的高純度低聚半乳糖產(chǎn)品。表I應(yīng)用10床式模擬移動床色譜分離低聚半乳糖
原料液原料組分低聚半乳糖(流出)葡萄糖、半乳糖、乳糖(洗脫)回收率
糖+半IiS 34.53% 0%65.93%100%~
乳糖10.23% 3.26%16.56%87.10%
低聚半乳糖 [55.24% 96.74%Γ 17.51%| "80.60%
固形物60·00/ο 21.25%17.0%實(shí)施例2菌株BLB-21接入葡萄糖濃度為400g/L的種子液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。ニ級種子液(濃度菌絲濕重O. 45%)以10% (V/V)的量接入到30%乳糖溶液中發(fā)酵，調(diào)節(jié)ρΗ5· 5，30 35°C發(fā)酵30h。經(jīng)超濾初歩得到糖組分混合液，活性炭脫色后采用強(qiáng)酸性陽離子-弱堿性陰離子-強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，溫度35 40°C，進(jìn)樣量10L/h，樹脂高度Im進(jìn)行分離脫鹽，經(jīng)HPLC檢測得低聚半乳糖含量為56. 54%的糖溶液。此時糖組分為葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖。參數(shù)為樹脂柱裝填高度為O. 65m，分配盤轉(zhuǎn)速為3° /min，進(jìn)料濃度62%，進(jìn)料溫度65°C，進(jìn)料流速I. 6L/h，進(jìn)水流速2. 6L/h，流出液流速I. 7L/h，洗脫液流速2. 2L/h可分離得到96. 56%的高純度低聚半乳糖產(chǎn)品。表2應(yīng)用10床式模擬移動床色譜分離低聚半乳糖

權(quán)利要求
1.一種高純度低聚半乳糖制備方法，其特征在于以40%濃度乳糖溶液為原料，采用高產(chǎn)菌株米曲霉Aspeigillus oryzaeBLB-21直接發(fā)酵,發(fā)酵液經(jīng)超濾、連續(xù)模擬移動床色譜分離等得到95%以上純度低聚半乳糖產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于高純度低聚半乳糖產(chǎn)品的分離純化采用陶瓷膜過濾、離子交換、連續(xù)模擬移動床色譜分離(10床式回分法)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于陶瓷膜超濾，可以去除菌體及其中酶、蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)，初歩得到糖組分混合液。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于糖組分混合液采用強(qiáng)酸性陽離子-弱堿性陰離子-強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，溫度30-50°C，進(jìn)樣量10L/h，樹脂高度lm，進(jìn)行分離脫鹽，經(jīng)HPLC分析檢測可得低聚半乳糖含量為55%的糖溶液。此時，糖組分為葡萄糖、半乳糖、乳糖、低聚半乳糖。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于連續(xù)模擬移動床色譜分離法(10柱床回分法)分離糖溶液，參數(shù)為樹脂柱裝填高度為O. 65m，分配盤轉(zhuǎn)速為3° /min，進(jìn)料濃度55-65%，進(jìn)料溫度60-70°C，進(jìn)料流速I. 2-1. 8L/h，進(jìn)水流速2_3L/h，流出液流速I.4-2. OL/h，洗脫液流速I. 8-2. 8L/h?？梢缘玫降途郯肴樘羌兌葹?5%以上的產(chǎn)品。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所得產(chǎn)品通過六效降膜式蒸發(fā)濃縮器得高純度低聚半乳糖漿。
7.如對權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于高純度低聚半乳糖漿采用壓カ式噴霧干燥塔干燥得高純度低聚半乳糖固體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高純度低聚半乳糖的生產(chǎn)方法。低聚半乳糖發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜超濾、離子交換處理后，采用十床式連續(xù)模擬移動床色譜分離制備，產(chǎn)品純度可達(dá)95％以上，很好的實(shí)現(xiàn)了低聚半乳糖溶液中單糖、乳糖的完全分離，分離效率高，產(chǎn)品品質(zhì)得到進(jìn)一步提升。本發(fā)明生產(chǎn)過程所用菌株米曲霉Aspergillus oryzae BLB-21于2009年3月17日保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號CGMCC No.2951。
文檔編號C07H1/08GK102676604SQ20111005415
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者馮志臣, 劉宗利, 李雙茹, 李慶華, 欒慶民, 滕慧, 王乃強(qiáng), 袁衛(wèi)濤 申請人:保齡寶生物股份有限公司