專利名稱：一種奧曲肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種奧曲肽的制備方法，特別涉及一種固相合成奧曲肽的方法。
背景技術(shù)：
奧曲肽，其化學(xué)名稱為D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰-L-苯丙氨酰-D-色氨酰-L-賴 氨酰-L-蘇氨酰-L-半胱氨酰-L-蘇氨醇環(huán)2 — 7) 二硫化物，其結(jié)構(gòu)式如式(I)所示。
式(I )奧曲肽的合成方法有液相片段縮合法和固相合成法，其中以固相合成法為主?，F(xiàn) 有技術(shù)中，固相合成法一般包括如下步驟(1)、將N-芴甲氧羰基-0-叔丁基蘇氨醇接到作為載體的樹脂上獲得N-芴甲氧羰 基-ο-叔丁基蘇氨醇樹脂；(2)、按照Fmoc/tBu固相多肽合成的方法，根據(jù)奧曲肽的序列，將保護(hù)氨基酸按C 端至N端的順序逐個偶聯(lián)到步驟(1)所得樹脂上獲得側(cè)鏈全保護(hù)的奧曲肽八肽樹脂，其中 Fmoc/tBu固相多肽合成法中，參與縮合反應(yīng)的氨基酸為Fmoc保護(hù)的氨基酸(通常標(biāo)記為 Fmoc-ΑΑ-ΟΗ)；(3)、將八肽從所述奧曲肽八肽樹脂上切下，得到線性粗肽；(4)、步驟(3)所得線性粗肽采用空氣氧化法形成二硫鍵，經(jīng)制備HPLC純化獲得所 述奧曲肽。中國發(fā)明專利ZL 200410010833. 2公開了一種醋酸奧曲肽的固相合成方法，其首 先將芴甲氧羰基蘇胺醇與對羧基苯甲醛反應(yīng)生成芴甲氧羰基蘇胺醇對羧基苯縮醛，然后將 其鍵合在氨基AM樹脂或氨基MBHA樹脂，該方法的不足之處在樹脂成本高，工藝復(fù)雜，并且 由于其是將八肽制成水溶液后，使其在空氣中自然氧化獲得奧曲肽，氧化所需時間長(至 少2天)，且在長時間的氧化過程中，奧曲肽在水中易發(fā)生水解，使得奧曲肽的總體收率僅能達(dá)到23%左右。另外，該方法在多肽合成中，使用DCC作為縮合劑，DCC易使人皮膚過敏、 副反應(yīng)較多、生成的N-酰脲類物質(zhì)更易堵塞固相反應(yīng)器，因此，該方法不能用于大規(guī)模固 相合成奧曲肽。中國發(fā)明ZL200510024502.9公開了一種醋酸奧曲肽的固相合成方法，其使用氯 甲基樹脂作載體，采用2-羥基3，4- 二氫吡喃做為肽鏈和氯甲基樹脂之間的連接臂，該方法 在小試過程的八肽合成中，線性粗肽的收率91.7%，純度57. 1%。然而，在線性粗肽制備奧 曲肽時，該方法亦采用與ZL200410010833.2相同的空氣氧化法，使得最終成品奧曲肽的產(chǎn) 率較低；另外，該方法在八肽合成中采用BOP作為縮合劑，該縮合劑在使用過程中會產(chǎn)生致 癌性的副產(chǎn)物
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改進(jìn)的奧曲肽的制 備方法。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案一種采用固相合成法制備奧曲肽的方法，包括如下步驟(1)、將N-芴甲氧羰基-0-叔丁基蘇氨醇接到作為載體的樹脂上獲得N-芴甲氧羰 基-0-叔丁基蘇氨醇樹脂；(2)、按照Fmoc/tBu固相多肽合成的方法，根據(jù)奧曲肽的序列，將保護(hù)氨基酸按C 端至N端的順序逐個偶聯(lián)到步驟(1)所得樹脂上獲得奧曲肽八肽樹脂；(3)、使用裂解劑將八肽從所述奧曲肽八肽樹脂上切下，得到線性粗肽；(4)、步驟(3)所得線性粗肽經(jīng)氧化反應(yīng)形成二硫鍵，純化，獲得所述奧曲肽，其中步驟(4)中，所述氧化反應(yīng)在pH 7.0 7. 5以及氧化劑H2O2的存在下進(jìn)行， 其中H2O2與線性粗肽的投料摩爾比為7 9 1。根據(jù)本發(fā)明的一個具體方面，步驟(4)中，所述氧化反應(yīng)的過程如下將所述線性粗肽加水溶解至濃度為1 2mmol/L，加入3wt % IOwt %的稀氨水調(diào) 節(jié)溶液PH至7. 0 7. 5，然后在室溫攪拌下，滴加0. 5wt% 2wt%的雙氧水，于溫度20°C 40°C下反應(yīng)1 3h。根據(jù)本發(fā)明，步驟(1) (3)可采用已知的技術(shù)進(jìn)行。但優(yōu)選按照如下方案進(jìn)行步驟(1)中，作為載體的樹脂為2-氯三苯甲基氯樹脂。具體地，在反應(yīng)釜中，通過 使2-氯三苯甲基氯樹脂與N-芴甲氧羰基-0-叔丁基蘇氨醇在催化劑碳酸氫銫的存在下發(fā) 生反應(yīng)生成N-芴甲氧羰基-0-叔丁基蘇氨醇樹脂，其中，2-氯三苯甲基氯樹脂與N-芴甲 氧羰基-0-叔丁基蘇氨醇的投料摩爾比為1 2 4。優(yōu)選地，所述反應(yīng)在二氯甲烷與N， N- 二甲基甲酰胺的混合溶劑中以及pH 7 9下進(jìn)行，反應(yīng)溫度為30°C 70°C，反應(yīng)時間為 1. 5 3小時。所述pH可通過加入有機(jī)堿來調(diào)節(jié)，優(yōu)選通過添加入N，N- 二異丙基乙胺來 調(diào)節(jié)。更優(yōu)選地，在反應(yīng)結(jié)束后，從反應(yīng)釜中抽走反應(yīng)液，然后將二氯甲烷、甲醇及N，N-二 異丙基乙胺的混合溶劑加入到反應(yīng)釜中，保持30分鐘以上，以封閉2-氯三苯甲基氯樹脂上 未反應(yīng)的功能基，最后洗滌、干燥，獲得的N-芴甲氧羰基-0-叔丁基蘇氨醇樹脂用于下一步 反應(yīng)。步驟(2)中，所述偶聯(lián)在N，N- 二異丙基碳二亞胺、1-羥基苯并三唑以及N，N- 二甲基甲酰胺組成的縮合體系中進(jìn)行，其中，F(xiàn)moc保護(hù)的氨基酸、N，N-二異丙基碳二亞胺以 及1-羥基苯并三唑的投料摩爾比為1 1.1 1.3 1. 1 1.3，優(yōu)選1 1.2 1.2，且 Fmoc保護(hù)的氨基酸的投料量為與其進(jìn)行偶聯(lián)的樹脂的摩爾數(shù)的2 4倍，優(yōu)選3倍。優(yōu)選 地，通過Kaiser test檢測來判斷每一步所述的偶聯(lián)是否完成，如反應(yīng)3小時后檢測仍不合 格，則重復(fù)偶聯(lián)。步驟(3)中，使用三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇以及苯甲醚按體積比 90 5 3 2組成的混合液將八肽作為所述裂解劑將八肽從所述奧曲肽八肽樹脂上切 下。Ig奧曲肽八肽樹脂需 8 IOmL所述的混合液。根據(jù)本發(fā)明，由步驟(4)獲得的奧曲肽可進(jìn)一步被制備成它的各種鹽形式，奧曲 肽的鹽形式包括但不限于醋酸奧曲肽、三氟乙酸奧曲肽、硫酸奧曲肽、檸檬酸奧曲肽等。由于以上技術(shù)方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點本發(fā)明采用過氧化氫來氧化線性粗肽獲得奧曲肽，僅需1 3小時氧化反應(yīng)即完 全，與傳統(tǒng)的空氣氧化法相比，反應(yīng)時間大大縮短，且奧曲肽產(chǎn)品收率大幅提高，適于大規(guī) 模生產(chǎn)奧曲肽及其鹽。
具體實施例方式本發(fā)明所用的縮寫具有下面的含義Boc 叔丁氧羰基；tBu 叔丁基；BOP 苯并三氮唑基氧基三(二甲基氨基)磷 鐺六氟磷酸鹽；Bzl 芐基；2-CTC 2-氯三苯甲基；DCM 二氯甲烷；DIC :N, N- 二異丙基碳 二亞胺；DIPEA :N, N- 二異丙基乙胺；DMF :N, N- 二甲基甲酰胺；EDT 1,2~乙二硫醇；Fmoc 9_芴甲氧羰酰；HOBt 羥基苯并三唑；TFA 三氟乙酸；Trt 三苯甲基；Z 芐氧羰基；Fmoc-AA-OH =N-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸； Fmoc-Cys (Trt) -OH =N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基半胱氨酸；Fmoc-Lys (Boc) -OH =N- α -芴甲氧羰基_Ν_ ε -叔丁氧羰基賴氨酸；Fmoc-Phe-OH =N-芴甲氧羰基-苯丙氨酸；Fmoc-D-Phe-OH :Ν_芴甲氧羰基-D苯丙氨酸；Fmoc-Thr (tBu) -OL =N-芴甲氧羰基_0_叔丁基蘇氨醇；Fmoc-Thr (tBu) -OH =N-芴甲氧羰基_0_叔丁基蘇氨酸；Fmoc-D-Trp (Boc) -OH =N-芴甲氧羰基-N-叔丁氧羰基_D_色氨酸；A/B:A與B的混合物。本發(fā)明中，Kaiser test主要采用的試劑為茚三酮，反應(yīng)呈紫色或深藍(lán)色，說明游 離氨基酸的存在，即偶聯(lián)未完全。根據(jù)本發(fā)明，如無特殊說明，所述的氨基酸的構(gòu)型均為L-型。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施 例。一種醋酸奧曲肽的制備方法，包括如下步驟(1)、Fmoc-Thr (tBu) -O-CTC 樹脂制備將1350g 2-CTC樹脂(100 200目，替代度為1. OmmoΙ/g)加入到20L固相反應(yīng)釜 中，加入適量DMF洗滌一次，抽干；再用適量二氯甲烷常溫溶脹，抽干；DMF洗滌一次，抽干。加入 1612g Fmoc-Thr (tBu)-OL (4mol)、778g 碳酸氫銫的 DCM/DMF 溶液(8L，V/V = 1 1)， 反應(yīng)約15分鐘，加入700mL DIPEA，60°C下反應(yīng)2小時，抽干，加DMF洗滌2次，抽干。加入 5L封閉試劑DCM/CH3OH/DIPEA(體積比17 2 1)，反應(yīng)30min，抽干，再封閉1次，DMF洗 滌2次；無水乙醚洗滌2次，每次約lOmin，真空減壓干燥過夜。稱重，得1789g，測得替代度 為 0.67mmol/g0(2)、奧曲肽八肽樹脂的制備 a、制備 Fmoc-Cys (Trt)-Thr (tBu)-O-CTC 樹脂稱取步驟(1)制備的 Fmoc-Thr (tBu) -O-CTC樹脂1492g (Imol)，放入20L固相反釜中，加入適量DMF溶脹30min， 抽干。加入20%哌啶/DMF溶液(IOL)，室溫反應(yīng)30min，然后用DMF洗滌4次，加入溶解過 濾好的 1757g Fmoc-Cys (Trt)-OH (3mol)、445g HOBt 禾口 5 IOmL DIC 的 DMF(IOL)溶液，室溫 攪拌反應(yīng)2小時后，用玻璃棒粘取少許樹脂于小試管中，用DMF洗滌樹脂，加入茚三酮檢測 試劑(5%茚三酮無水乙醇溶液(W/V)；新蒸苯酚的無水乙醇溶液(4 1，W/V)；取2mL0.01M 的KCN水溶液，用新蒸的吡啶稀釋至IOOmL)各2滴，放置于微量恒溫器中，100°C放置5min。 觀察到樹脂淺黃，溶液淺黃，表明反應(yīng)已經(jīng)完全，可抽掉反應(yīng)液，進(jìn)入下一個氨基酸的偶聯(lián) 反應(yīng)。若反應(yīng)3小時后，茚檢仍不合格，則需重復(fù)偶聯(lián)。b、制備 Fmoc-Thr (tBu) -Cys (Trt) -Thr (tBu) -O-CTC 樹脂向步驟 a 茚檢合格后的 反應(yīng)釜中加入IOL 20%哌啶/DMF溶液，室溫反應(yīng)30min。然后用DMF洗滌4次，加入溶解 過濾好的 Fmoc-Thr (tBu)-OH 1704g (3mol)、445gH0Bt 和 510mL DIC 的 DMF (IOL)溶液，室溫 攪拌反應(yīng)2. 5小時后，用玻璃棒粘取少許樹脂于小試管中，用DMF洗滌樹脂，加入茚三酮檢 測試劑各2滴，放置于微量恒溫器中，100°C放置5min。觀察到樹脂淺黃，溶液淺黃，表明反 應(yīng)已經(jīng)完全，可抽掉反應(yīng)液，進(jìn)入下一個氨基酸的偶聯(lián)反應(yīng)。若反應(yīng)3小時后，茚檢仍不合 格，則需重復(fù)偶聯(lián)。c、制備 Fmoc-Lys (Boc) -Thr (tBu) -Cys (Trt) -Thr (tBu) -O-CTC 樹脂向步驟 b 茚檢 合格后的反應(yīng)釜中加入20%哌啶/DMF溶液(IOL)，室溫反應(yīng)30min，然后用DMF洗滌4次， 加入溶解過濾好的Fmoc-Lys (Boc)-0H1405g(3mol)、445g HOBt禾口 510mL DIC 的DMF(IOL)溶 液，室溫攪拌反應(yīng)2. 5小時后，用玻璃棒粘取少許樹脂于小試管中，用DMF洗滌樹脂，加入茚 三酮檢測試劑各2滴，放置于微量恒溫器中，100°C放置5min。觀察到樹脂淺黃，溶液淺黃， 表明反應(yīng)已經(jīng)完全，可抽掉反應(yīng)液，進(jìn)入下一個氨基酸的偶聯(lián)反應(yīng)。若反應(yīng)3小時后，茚檢 仍不合格，則需重復(fù)偶聯(lián)。d、制備 Fmoc-D-Trp (Boc) -Lys (Boc) -Thr (tBu) -Cys (Trt) -Thr (tBu) -O-CTC 樹脂 向步驟c茚檢合格后的反應(yīng)釜中加入20%哌啶/DMF溶液(IOL)，室溫反應(yīng)30min，然后用 DMF 洗滌 4 次，加入溶解過濾好的 Fmoc-D-Trp (Boc) -OH 1580g (3mol)、445g HOBt 和 510mL DIC的DMF溶液(IOL)，室溫攪拌反應(yīng)2. 5小時后，用玻璃棒粘取少許樹脂于小試管中，用 DMF洗滌樹脂，加入茚三酮檢測試劑各2滴，放置于微量恒溫器中，100°C放置5min。觀察到 樹脂淺黃，溶液淺黃，表明反應(yīng)已經(jīng)完全，可抽掉反應(yīng)液，進(jìn)入下一個氨基酸的偶聯(lián)反應(yīng)。若 反應(yīng)3小時后，茚檢仍不合格，則需重復(fù)偶聯(lián)。e、制備 Fmoc-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-O-C TC樹脂在步驟d茚檢合成后的反應(yīng)釜中，加入20 %哌啶/DMF溶液(1OL)，室溫反應(yīng) 30min。然后用DMF洗滌4次，加入溶解過濾好的Fmoc-Phe-OH 1162g(3mol)、445g HOBt和DIC(510mL)的DMF(IOL)溶液，室溫攪拌反應(yīng)2. 5小時后，用玻璃棒粘取少許樹脂于小試管 中，用DMF洗滌樹脂，加入茚三酮檢測試劑各2滴，放置于微量恒溫器中，100°C放置5min。 觀察到樹脂淺黃，溶液淺黃，表明反應(yīng)已經(jīng)完全，可抽掉反應(yīng)液，進(jìn)入下一個氨基酸的偶聯(lián) 反應(yīng)。若反應(yīng)3小時后，茚檢仍不合格，則需重復(fù)偶聯(lián)。 f、制備 Fmoc-Cys (Trt) -Phe-D-Trp (Boc) -Lys (Boc) -Thr (tBu) -Cys (Trt) -Thr (tB u)-O-CTC樹脂向步驟e茚檢合成后的反應(yīng)釜中加入20%哌啶/DMF溶液(IOL)，室溫反 應(yīng)30min，然后用DMF洗滌4次，加入溶解過濾好的Fmoc-Cys(Trt)-OH 1757g(3mol)、445g HOBt和DIC(510mL)的DMF (IOL)溶液，室溫攪拌反應(yīng)2. 5小時后，用玻璃棒粘取少許樹脂于 小試管中，用DMF洗滌樹脂，加入茚三酮檢測試劑各2滴，放置于微量恒溫器中，100°C放置 5min。觀察到樹脂淺黃，溶液淺黃，表明反應(yīng)已經(jīng)完全，可抽掉反應(yīng)液，進(jìn)入下一個氨基酸的 偶 聯(lián)反應(yīng)。若反應(yīng)3小時后，茚檢仍不合格，則需重復(fù)偶聯(lián)。g、制備 D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys (Trt)-Thr ( tBu)-0-CTC樹脂(側(cè)鏈全保護(hù)的奧曲肽八肽樹脂)向步驟f茚檢合成后的反應(yīng)釜中加 入20%哌啶/DMF溶液(IOL)，室溫反應(yīng)30min。然后用DMF洗滌4次，加入溶解過濾好的 Fmoc-D-Phe-OH 1162g(3mol)、HOBt 445g 和 DIC(510mL)的 DMF(IOL)溶液，室溫攪拌反應(yīng) 2. 5小時后，用玻璃棒粘取少許樹脂于小試管中，用DMF洗滌樹脂，加入茚三酮檢測試劑各2 滴，放置于微量恒溫器中，100°C放置5min。觀察到樹脂淺黃，溶液淺黃，表明反應(yīng)已經(jīng)完全， 可抽掉反應(yīng)液，進(jìn)入下一步反應(yīng)。若反應(yīng)3小時后，茚檢仍不合格，則需重復(fù)偶聯(lián)。加入20%哌啶/DMF溶液10L，室溫反應(yīng)30min。用DMF各洗滌4次，再分別用無水 甲醇，收縮2次，抽干，轉(zhuǎn)移出樹脂，真空干燥，直至樹脂恒重，得側(cè)鏈全保護(hù)的奧曲肽八肽 樹脂2965g。(3)、制備線性粗肽取干燥的步驟(2)所得奧曲肽八肽樹脂296. 5g，加入25L預(yù)冷的裂解試劑(TFA/ 苯甲硫醚/EDT/苯甲醚=90 5 3 2，體積比)，在室溫下裂解2. 5小時，然后過濾并 在冷凍的無水乙醚中沉降，半個小時后，離心，得到線性粗肽，將這些線性粗肽在真空干燥 箱里干燥4至5個小時后，得到干燥的線性粗肽。2965g奧曲肽八肽樹脂均分為10次裂解，共得到干燥的線性粗肽1215g。(4)、步驟(3)所得線性粗肽經(jīng)氧化、純化、轉(zhuǎn)鹽和凍干后得到成品醋酸奧曲肽將線性粗肽加水溶解至濃度約為1 2mmol/L，充分?jǐn)嚢柚寥埽孟“彼?取濃 氨水適量稀釋5倍的溶液)調(diào)整粗肽溶液pH值至7. 1 7.2。在室溫攪拌下，將1.5wt% 的雙氧水滴加到粗肽溶液中(雙氧水與粗肽的摩爾比為8 1)，反應(yīng)1 2小時即可完成 氧化(HPLC監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)程)。氧化完成后，加入醋酸，調(diào)節(jié)溶液pH值調(diào)至4左右，使用 0. 45 μ m的濾膜過濾溶液，濾液經(jīng)直徑15cm的硅膠C18 (粒徑10微米、孔徑100埃)反相高 效液相制備柱純化(流動相A 取1. IL磷酸加入95L純水中，使用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至2. 3， 純水定容至IOOL ；流動相B相乙腈。檢測波長230nm，洗脫流速400-500mL/min ；梯度B 由22%到25%，40分鐘)。純化出峰以后，根據(jù)峰形收集各組份，經(jīng)HPLC分析，按峰前、峰 頂和峰后分別并樣，其中峰前、峰后純度大于70%，峰頂為合格品(HPLC純度大于98%)。 對峰前、峰后段按以上純化步驟進(jìn)行多次純化得合格品。再用醋酸銨和醋酸轉(zhuǎn)鹽后、減壓濃 縮、凍干后得成品。
反相高效液相制備柱純化時，每次上樣量為約含50g目的肽的溶液。1215g線性粗肽經(jīng)氧化、純化、轉(zhuǎn)鹽和凍干后共得合格的醋酸奧曲肽880g(HPLC純度98. 4%，含水 4. 8%，含醋酸7.5% )，總收率74% (按ImolFmoc-Thr (tBu)-O-CTC樹脂為起始原料來計 算，包括固相偶聯(lián)、裂解和純化的所有步驟；最后產(chǎn)品的量按除去雜質(zhì)、水份和醋酸后的含 量計)。成品醋酸奧曲肽分析數(shù)據(jù)比旋度-21. 7° (C = 6. 25mg/mL，1 %醋酸)； ESI (M+H+) 1020. 4(理論值1019. 2)；氨基酸組成蘇氨酸1. 07 (1)；半胱氨酸1.84(2)；苯 丙氨酸1. 93 (2)；色氨酸0. 91 (1)；賴氨酸1. 07 (1)；蘇氨醇0. 94 (1)。綜上，本實施例的奧曲肽合成工藝路線有如下特點以2-CTC樹脂為載體，并采用 經(jīng)典的Fmoc/tBu固相多肽合成法以及結(jié)合雙氧水氧化工藝，工藝簡便，生產(chǎn)周期短，可實 現(xiàn)單批次幾百克到公斤級的生產(chǎn)規(guī)模；每步的氨基酸縮合率達(dá)到99. 5%以上，線性粗肽的 HPLC純度大于90%，成品醋酸奧曲肽總收率達(dá)到70%以上，且整個生產(chǎn)采用常規(guī)的原料和 試劑，沒有使用到劇毒的氟化氫等試劑，安全環(huán)保。以上對本發(fā)明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本 發(fā)明的內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明的精神實質(zhì)所 作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種采用固相合成法制備奧曲肽的方法，包括如下步驟(1)、將N-芴甲氧羰基-O-叔丁基蘇氨醇連接到作為載體的樹脂上獲得N-芴甲氧羰基-O-叔丁基蘇氨醇樹脂；(2)、按照Fmoc/tBu固相多肽合成的方法，根據(jù)奧曲肽的序列，將保護(hù)氨基酸按C端至N端的順序逐個偶聯(lián)到步驟(1)所得樹脂上獲得奧曲肽八肽樹脂；(3)、使用裂解劑將八肽從所述奧曲肽八肽樹脂上切下，得到線性粗肽；(4)、步驟(3)所得線性粗肽經(jīng)氧化反應(yīng)形成二硫鍵，經(jīng)制備高效液相色譜純化即得所述奧曲肽，其特征在于步驟(4)中，所述氧化反應(yīng)在pH 7.0～7.5以及氧化劑H2O2的存在下進(jìn)行，其中H2O2與線性粗肽的投料摩爾比為7～9∶1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中，所述氧化反應(yīng)的具體過程 為將所述線性粗肽加水溶解至濃度為1 2mmol/L，加入3wt% 10襯％的稀氨水調(diào)節(jié)溶 液PH至7. 0 7. 5，然后在室溫攪拌下，滴加0. 5wt% 2wt%的雙氧水，于溫度20°C 40°C 下反應(yīng)1 3h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述作為載體的樹脂為2-氯三苯甲基氯樹脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)中在反應(yīng)釜中，通過使2-氯三 苯甲基氯樹脂與N-芴甲氧羰基-0-叔丁基蘇氨醇在催化劑碳酸氫銫的存在下發(fā)生反應(yīng)生 成所述N-芴甲氧羰基-0-叔丁基蘇氨醇樹脂，其中，2-氯三苯甲基氯樹脂與N-芴甲氧羰 基-0-叔丁基蘇氨醇的投料量滿足2-氯三苯甲基與N-芴甲氧羰基-0-叔丁基蘇氨醇摩爾 比為1 2 4。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述反應(yīng)在二氯甲烷與N， N- 二甲基甲酰胺的混合溶劑中以及pH 7 9下進(jìn)行，反應(yīng)溫度為30°C 70°C，反應(yīng)時間為 1. 5 3小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(1)中，通過加入N，N-二異丙基乙 胺調(diào)節(jié)所述PH。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述反應(yīng)結(jié)束后，從反 應(yīng)釜中抽走反應(yīng)液，然后將二氯甲烷、甲醇及N，N- 二異丙基乙胺的混合溶劑加入到反應(yīng)釜 中，保持30分鐘以上，以封閉2-氯三苯甲基氯樹脂上未反應(yīng)的功能基，最后經(jīng)洗滌、干燥獲 得所述的N-芴甲氧羰基-0-叔丁基蘇氨醇樹脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述偶聯(lián)在N，N-二異丙基 碳二亞胺、1-羥基苯并三唑以及N，N- 二甲基甲酰胺組成的縮合體系中進(jìn)行，其中，F(xiàn)moc保 護(hù)的氨基酸、N，N-二異丙基碳二亞胺以及1-羥基苯并三唑的投料摩爾比為1 1. 1 1.3 1.1 1.3，且Fmoc保護(hù)的氨基酸的投料量為與其進(jìn)行偶聯(lián)的樹脂的摩爾數(shù)的2 4倍。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的方法，其特征在于步驟(2)中，通過Kaisertest來判 斷每一步所述的偶聯(lián)是否完成。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中，使用三氟乙酸、苯甲硫醚、 乙二硫醇以及苯甲醚按體積比90 5 3 2組成的混合液作為所述裂解劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種奧曲肽的制備方法，其包括通過Fmoc/tBu固相多肽合成法制備線性粗肽和由線性粗肽經(jīng)過氧化反應(yīng)制備奧曲肽的步驟，其中，所述氧化反應(yīng)在pH 7.0～7.5以及雙氧水的存在下進(jìn)行，其中雙氧水與線性粗肽的投料摩爾比為7～9∶1。本發(fā)明采用雙氧水來氧化線性粗肽獲得奧曲肽，僅需1～3小時氧化反應(yīng)即完全，與傳統(tǒng)的空氣氧化法相比，反應(yīng)時間大大縮短，且奧曲肽產(chǎn)品收率大幅提高，適于大規(guī)模生產(chǎn)奧曲肽及其鹽。
文檔編號C07K1/06GK101863961SQ201010165270
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者王寶利, 王良友, 陸冬冬, 陳逸民 申請人:蘇州中科天馬肽工程中心有限公司