專利名稱：吡啶酮類化合物在制備治療糖尿病腎病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及吡啶酮類化合物的新醫(yī)藥用途，具體地是涉及制備治療糖尿病腎病藥 物中的用途。
背景技術(shù)：
糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病導(dǎo)致的腎臟損害，是糖尿病常 見和嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，是糖尿病全身微血管病變的一部分。糖尿病腎病目前已成為慢性 腎功能不全病因的最重要病因。在歐美國家糖尿病腎病是終末期腎衰竭的首位原因。據(jù)我 國1999年的初步統(tǒng)計(jì)，糖尿病腎病在血液透析患者中為第二位，約占13.5% ；在腹膜透析 患者中為第三位，約占12.0%。糖尿病具有兩個(gè)類型即胰島素依賴型(I型糖尿病)和非胰島素依賴型(II型糖 尿病)。其中，I型糖尿病是指由于胰島B細(xì)胞破壞導(dǎo)致胰島素絕對(duì)缺乏所引起的糖尿??； II型糖尿病是指從胰島素抵抗為主伴胰島素相對(duì)不足到胰島素分泌不足為主伴胰島素抵 抗所致的糖尿病。以上兩種類型糖尿病均應(yīng)除外一些已知因素所致的各種糖尿病。不同類型糖尿病的病因和發(fā)病機(jī)制均不同，其確切機(jī)理至今尚未完全明了。目前 認(rèn)為1型糖尿病是一種由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的、以免疫性胰島炎和選擇性胰島B細(xì)胞操作為特 征的自身免疫性疾病，特異性抗原_組織相容性抗原-T淋巴細(xì)胞受體三者構(gòu)成三元復(fù)合體 共同參與免疫反應(yīng)、啟動(dòng)特異性識(shí)別、激活T淋巴細(xì)胞，再啟動(dòng)胰島B細(xì)胞破壞；另外，與其 發(fā)病有關(guān)的因素中還包括病毒感染、化學(xué)物質(zhì)、飲食因素以及遺傳等。II型糖尿病被認(rèn)為是 多個(gè)基因及環(huán)境因素共同參與并相互作用的多基因多環(huán)境因素復(fù)雜病，其中最主要的環(huán)境 因素包括肥胖、高熱量飲食、體力活動(dòng)不足及增齡，而高血壓、血脂紊亂、igt或ire者也能 增加患病風(fēng)險(xiǎn)。而遺傳因素在II糖尿病的病因中較I型糖尿病更為重要。不同類型的糖 尿病其糖尿病腎病的發(fā)病率不同，約有15% -25%的I型糖尿病患者以及30% -40%的II 型糖尿病患者最終會(huì)發(fā)展成為糖尿病腎病。目前臨床上根據(jù)糖尿病腎病的自然病程將其分為I-VI期。糖尿病腎病I期，為腎小球高濾過期，主要表現(xiàn)為腎小球肥厚增大、腎臟體積增 大、腎血流量增加、腎小球高濾過。糖尿病腎病II期，為無臨床癥狀的腎臟損害期，大約出現(xiàn)在糖尿病2-5年后，主要 表現(xiàn)為腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，常有腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張；此期雖然有輕度腎臟病理 改變，但無臨床征象，腎臟以功能性改變?yōu)橹?，表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率的增加，腎血漿流量和 濾過分?jǐn)?shù)的增加。多數(shù)患者病變長期處于這一階段，不發(fā)展到III期。糖尿病腎病III期，也稱為微量白蛋白尿期，以微量白蛋白尿的出現(xiàn)為標(biāo)志，常出 現(xiàn)在糖尿病10-15年后，可以出現(xiàn)高血壓。此期的病理表現(xiàn)仍然是腎小球毛細(xì)血管基底膜 增厚和腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張，但較II期為重。微量白蛋白尿是各種血管疾病包括心血管以及 糖尿病腎病IV期的危險(xiǎn)因素，多數(shù)患者在若干年后進(jìn)展至大量白蛋白尿階段。目前認(rèn)為微 量白蛋白尿的發(fā)生機(jī)制主要與內(nèi)皮功能障礙、炎癥以及胰島素抵抗有關(guān)，而腎小球基底膜的改變僅對(duì)其有輕微的作用。由于腎小球?yàn)V過膜(基底膜與足細(xì)胞)正常的患者也能出現(xiàn) 微量白蛋白尿，提示腎小球?yàn)V過膜結(jié)構(gòu)與微量白蛋白尿之間無明顯相關(guān)性。糖尿病腎病IV期，為臨床糖尿病腎病期，當(dāng)微量白蛋白尿進(jìn)展為大量蛋白尿時(shí)， 即表示進(jìn)入糖尿病腎病IV期。該期的主要表現(xiàn)為中、大量蛋白尿、高血壓，此期的病理表現(xiàn) 出現(xiàn)腎小球硬化。糖尿病腎病V期，為腎功能不全期，表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率進(jìn)行性下降，最終進(jìn)入終 末期腎衰，出現(xiàn)腎功能不全的表現(xiàn)。該期的病理表現(xiàn)為普遍的腎小球硬化。糖尿病腎病腎組織病理上早期(糖尿病腎病I期或糖尿病腎病II期或糖尿病腎 病III期)改變主要為腎小球肥大，基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生，因此增加的細(xì)胞外基質(zhì)主 要為基底膜成分，如纖維連接蛋白(FN)、IV型膠原蛋白；晚期出現(xiàn)彌漫性腎小球硬化，間質(zhì) 纖維化，各類細(xì)胞外基質(zhì)成分包括I型、IV型膠原蛋白、纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白都 將顯著增多。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前認(rèn)為，其機(jī)制主要與腎血流動(dòng)力學(xué)異 常、代謝紊亂、細(xì)胞因子作用、遺傳因素等相關(guān)。其中，腎血流動(dòng)力學(xué)異常在此起著關(guān)鍵作 用，腎小球?yàn)V過率增高時(shí)跨壁毛細(xì)血管靜水壓增加，從而可促使上皮細(xì)胞產(chǎn)生基底膜增多， 蛋白濾過也增多，并可沉積在系膜區(qū)和腎小球基底膜。沉積于系膜區(qū)的大分子物質(zhì)又可刺 激系膜細(xì)胞的增生，促使基質(zhì)增加，形成惡性循環(huán)。而高血糖作為糖尿病腎病重要的代謝因 素，可通過多元醇途徑使細(xì)胞內(nèi)山梨醇濃度升高，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙；還可使體內(nèi)各種蛋白 糖基化，導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物的生成與蓄積，從而通過直接作用或蛋白激酶C等途徑促使 糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。另外，各種細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子0 (TGF-日)、結(jié)締組織生長 因子(CTGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、血小板源性生長因子(PDGF)等，均可促進(jìn)細(xì)胞外基 質(zhì)的產(chǎn)生。其中，TGF-0是一個(gè)關(guān)鍵因子，它可以介導(dǎo)葡萄糖對(duì)系膜基質(zhì)代謝的影響。而 CTGF是目前公認(rèn)的TGF-0下游因子，TGF-0的生物學(xué)作用部分是由CTGF介導(dǎo)的。高糖 狀態(tài)也可誘導(dǎo)CTGF的表達(dá)，提示CTGF在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中可能起到的促進(jìn)作用。此 外，還有各種信號(hào)通路如Smads通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路等，均可參與各種靶基因的調(diào)控，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。其中， ERK1/2作為MAPK通路中的重要成員之一，可以使細(xì)胞外信號(hào)傳至細(xì)胞內(nèi)，影響細(xì)胞增殖和 蛋白質(zhì)的合成，在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中起重要的作用。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病腎病 的主要致病因素，在正常情況下，腎臟的抗氧化系統(tǒng)和氧化能力之間保持著相對(duì)的動(dòng)態(tài)平 衡。在糖尿病早期患者體內(nèi)，常伴有葡萄糖及糖化蛋白的自動(dòng)氧化，使體內(nèi)自由基產(chǎn)生明顯 增加，機(jī)體抗氧化能力降低，引起糖尿病早期腎損害。此外，遺傳、高血脂等因素也對(duì)糖尿病 腎病的發(fā)病起著非常重要的作用。目前認(rèn)為I型糖尿病和II型糖尿病引起腎臟損害的機(jī)理不同。I型糖尿病患者在 發(fā)病的前10年血糖水平較II型高(16. 3 vs 11.4mmol/l)，而血壓水平低于II型糖尿病 (148vS157mmHg)，發(fā)展為終末期腎衰的時(shí)間明顯長于II型糖尿病(22vs 17years) 0另外， II型糖尿病中常見的高脂血癥和肥胖在糖尿病腎病中起重要作用，而在I型糖尿病中血糖 的控制水平對(duì)糖尿病腎病的發(fā)展更為重要。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，高膽固醇血癥可以 誘發(fā)或加重腎小球硬化和小管間質(zhì)損傷。高膽固醇血癥可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化因子MCP-1 的表達(dá)，促進(jìn)腎臟炎性細(xì)胞的浸潤。高膽固醇血癥也引起大血管內(nèi)皮損傷和動(dòng)脈粥樣硬化。實(shí)驗(yàn)證明與高血糖相比，高脂血癥更能促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)展。胰島素抵抗在II型糖尿病 腎病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用，胰島素抵抗發(fā)生后，己糖胺通路活化，后者可引起TGF-B 產(chǎn)生增加，從而參與細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，改善胰島素抵抗可減輕腎損傷。由I型糖尿病和II型糖尿病導(dǎo)致的糖尿病腎病的機(jī)理不同，I型糖尿病和II型 糖尿病引起的糖尿病腎病的病理改變和后果也不盡相同。II型糖尿病腎病和I型糖尿病腎 病的主要組織學(xué)改變基本相似，但I(xiàn)I型糖尿病腎病的形態(tài)學(xué)改變表現(xiàn)更為多樣性，而非特 異性的血管損傷和間質(zhì)損傷更為常見。糖尿病患者一旦發(fā)現(xiàn)腎臟損害，出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿則病情不可逆轉(zhuǎn)，目前臨床上 尚無有效的方法能夠防止其發(fā)生和惡化。糖尿病腎病的藥物治療目前主張多途徑綜合治 療，包括限制蛋白攝入，控制血糖、血壓、血脂等促進(jìn)腎功能惡化的危險(xiǎn)因素。近期動(dòng)物研究 顯示，糖基化終末產(chǎn)物抑制劑如氨基胍對(duì)糖尿病腎病有一定療效，但是尚未進(jìn)入臨床使用。 而目前廣泛應(yīng)用的ACEI及ARB類藥物如卡托普利、依那普利及絡(luò)沙坦等有一定作用，但其 療效有限。因此，目前尚無有效治療糖尿病腎病的藥物。db/db 小鼠(C57BLKs/J Leprdb/db 小鼠)1966 年發(fā)現(xiàn)于美國的 Jackson Laboratory，是來自C57BLKs/J小鼠的一株突變系，為位于4號(hào)染色體的瘦素受體(1印tin receptor)基因突變所致的自發(fā)性II型糖尿病模型，也是很好的II型糖尿病腎病動(dòng)物模 型。db/db小鼠表現(xiàn)為下丘腦瘦素受體缺陷，對(duì)飽感物質(zhì)(瘦素)缺乏反應(yīng)，它不能產(chǎn)生飽 感，因而過度采食，從而合成代謝大于分解代謝，引起脂肪的堆積而肥胖，逐漸發(fā)展為嚴(yán)重 的高血糖、高胰島素血癥。db/db小鼠在4周齡時(shí)血糖即有輕度增高，此后高血糖進(jìn)行性加 重，16周時(shí)達(dá)到頂峰，平均28. 6士 13. 2mmol/L。隨著高血糖的發(fā)生，腎小球出現(xiàn)肥大和高濾 過，在7周齡時(shí)出現(xiàn)微量白蛋白尿，8周齡以后尿白蛋白可達(dá)68-600 u g/24h，為正常對(duì)照的 8 62倍。12周齡開始出現(xiàn)腎組織形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為腎小球肥大，系膜區(qū)增寬，基底膜增 厚；12周齡時(shí)系膜基質(zhì)較正常對(duì)照增加2倍，16周齡時(shí)增加3倍；20周齡后，PAS染色下可 見腎小球毛細(xì)血管基底膜顯著增厚，系膜區(qū)顯著增寬，毛細(xì)血管袢塌陷，明顯的細(xì)胞外基質(zhì) 成分過量積聚。鏈脲佐菌素(str印tozotocin，STZ)是一種廣譜的抗生素，具有抗菌、抗腫瘤作用 和致糖尿病的作用，其誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的模型是目前國內(nèi)外最為常用的I型糖尿病動(dòng)物 模型。STZ對(duì)動(dòng)物胰島0細(xì)胞有很強(qiáng)的選擇性殺傷作用，大劑量或小劑量多次注射可完全 破壞胰島3細(xì)胞功能，使胰島素分泌缺失，形成胰島素依賴性(1型)糖尿病，隨病程延長 可進(jìn)展為DN。目前多用STZ，一般多采用大鼠作為研究對(duì)象，品系以Wistar和SD為主，STZ 給藥劑量在50 75mg kg-1之間，給藥方式多采用腹腔注射。Wistar大鼠在STZ注射后 72h血糖即有增高，一般認(rèn)為超過16. 7mmol/L,連續(xù)三天即可確定DM造模成功，此后血糖比 較平穩(wěn)。隨著高血糖的發(fā)生，在造模4周時(shí)出現(xiàn)尿蛋白排泄率升高，腎小球基底膜增厚，系 膜基質(zhì)增加，腎小球肥大。6周時(shí)可見腎小球毛細(xì)血管壁的增厚。8周時(shí)尿蛋白排泄率繼續(xù) 升高，病理表現(xiàn)為系膜基質(zhì)的增加，腎小球肥大，鮑曼氏囊體積減小，炎癥細(xì)胞浸潤，膠原沉 積，細(xì)胞外基質(zhì)增加。12周后上述表現(xiàn)加重，尿蛋白排泄率約為正常組的14倍，部分腎小球 硬化呈分葉狀，大量腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡樣變性，管腔變窄，部分腎小管上皮細(xì)胞壞 死、脫落。吡啶酮類化合物是一個(gè)龐大的家族。
美國專利 US3839346A，US4052509A，US4042699 公開了 29 個(gè)具有下列結(jié)構(gòu)式 VIII 的吡啶酮類化合物。 并公開了此類吡啶酮具有抗炎、解熱、降低血清尿酸水平、止痛等作用。其中，1-苯 基-5-甲基-2_(1H)吡啶酮(5-methyl-l-phenyl-2(lH)-pyridone)具有最好的活性和較 低的毒性.美國專利US 5，310，562在1994年第一次公布了 1-苯基-5-甲基-2_(1H)吡啶 酮，[5-methyl-l-phenyl-2 (1H) -pyridone]又稱吡非尼酮(Pirfenidone, PFD)具有抗纖 維化的生物活性 隨后美國專利US5, 518，729和US5, 716，632宣稱N-取代-2(1H)-吡啶 酮[N-substituted2-(lH)pyridone]，和 N-取代-3(1H)-吡啶酮[N-substituted 3_(1H) pyridone]也具有吡非尼酮(Pirfenidone) —樣的抗纖維化作用。并列舉了 44個(gè)化合物， 其中的大部分都是引自美國專利US4052509的已知化合物，在這些化合物中，隊(duì)、R2、R3、R4 都限定在甲基或乙基。除了以前在美國專利US 5，310，562中提供的有關(guān)1-苯基-5-甲 基-2_(1H)吡啶酮(pirfenidone)的實(shí)驗(yàn)資料外，這兩個(gè)專利沒有提供其它化合物的任何 實(shí)驗(yàn)資料(包括化學(xué)資料和生物學(xué)資料)證明兩個(gè)母核結(jié)構(gòu)即N-取代-2(1H)_吡啶酮和 N-取代-3 (1H)-吡啶酮具有抗纖維化作用。吡非尼酮，(pirfenidone，PFD)，在抗纖維化方面的有效性得到了更多體外和動(dòng) 物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。實(shí)驗(yàn)表明，在腎纖維化、肺纖維化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和特異性肺纖維化病人的 臨床治療中，吡非尼酮均具有阻止甚至逆轉(zhuǎn)ECM聚積的作用和防止甚至逆轉(zhuǎn)纖維化發(fā)生和
疲痕形成(Shimizu T, Fukagawa M, Kuroda T, et al. Pirfenidone prevents collagen accumulation in the remnant kidney in rats with partial nephrectomy. Kidney Int, 1997,52 (Suppl 63) :S239_243 ；Raghu G, Johnson WC, Lockhart D, et al. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis with a new antifibrotic agent, pirfenidone. Am J
Respir Crit Care Med，1999，159 :1061_1069)。吡非尼酮抗纖維化作用的機(jī)制尚處于研究 之中，但大量的研究已經(jīng)證明吡非尼酮是一種有效的細(xì)胞因子抑制劑，能夠通過參與調(diào)節(jié) 某些因子，抑制成纖維細(xì)胞的生物學(xué)活性，導(dǎo)致細(xì)胞增殖受抑，基質(zhì)膠原合成減少。
本申請(qǐng)發(fā)明人申請(qǐng)了中國專利ZL02114190.8，提供了一類吡啶酮化合物，(簡稱 氟非尼酮)具有如下的結(jié)構(gòu)I。 當(dāng)n = 1時(shí)，所述的取代基R表示F、Br、I。當(dāng)n = 2時(shí)，所述的取代基R表示F、Cl、Br、I，飽和直鏈烴基、氧代飽和直鏈烴基、 鹵代飽和直鏈烴基。
所述的取代基團(tuán)R在苯環(huán)上的位置具有鄰位、間位、對(duì)位等方式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通式(X)化合物的一種新的醫(yī)藥用途。即通式⑴化合物在制備治療早期糖尿病腎病藥物中的用途。 當(dāng)n = 1時(shí)，所述的取代基R表示F、Br、I ；當(dāng)n = 2時(shí)，所述的取代基R表示F、Cl、Br、I，飽和直鏈烴基、氧代飽和直鏈烴基、 鹵代飽和直鏈烴基；所述的取代基團(tuán)R在苯環(huán)上的位置具有鄰位、間位或?qū)ξ环绞健?yōu)選的化合物是n = 1時(shí)，1-鹵素取代苯基-5-甲基_2 (1H)-吡啶酮，更優(yōu)選的是 1-(3-氟苯基)-5-甲基-2 (1H)-吡啶酮(以下簡稱AKF-PD)。本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)通式(X)表示的化合物中具有可抑制高糖對(duì)腎小球系膜細(xì)胞CTGF 的誘導(dǎo)作用，從而治療糖尿病腎病；和/或可通過ERK1/2MAPK途徑抑制高糖誘導(dǎo)小鼠系膜 細(xì)胞CTGF表達(dá)。動(dòng)物試驗(yàn)也表明，該類化合物可顯著減少糖尿病腎病db/db小鼠24小時(shí)尿白蛋白 排泄量；可顯著減少糖尿病腎病db/db小鼠高甘油三酯血癥；可顯著減輕糖尿病腎病db/db 小鼠腎組織病理學(xué)改變；因此對(duì)db/db小鼠的糖尿病腎病有治療作用。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所說的糖尿病尤其是II型糖尿病。因此，本發(fā)明提供了 一種已知的吡啶酮化合物的新醫(yī)藥用途。本發(fā)明公開的 1-(取代苯基)-5_甲基_2 (1H)-吡啶酮化合物能針對(duì)早期的糖尿病腎病進(jìn)行治療，找到了 有效治療糖尿病腎病的最佳時(shí)期，取得了很好的效果。


圖1高糖刺激MMC 48h后各組p-ERKl/2蛋白表達(dá)；
圖2高糖刺激MMC 72h后各組CTGF蛋白表達(dá)；圖3腎組織病理(PAS染色400倍)；圖4糖尿病腎病大鼠腎臟病理(PAS染色400倍)，其中A正常組；B模型組； CAKF-PD組；D氯沙坦組
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.實(shí)驗(yàn)名稱AKF-PD通過ERK1/2MAPK途徑抑制高糖誘導(dǎo)小鼠系膜細(xì)胞CTGF表達(dá)方法體外培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細(xì)胞株(MMC)，將細(xì)胞分為低糖組(5.6mM葡 萄糖)，山梨醇組(5.6mM葡萄糖+19.4mM山梨醇)，高糖組(25mM葡萄糖)，AKF-PD組(25mM葡萄糖+2mM AKF-PD)以及ERK抑制劑組(25mM葡萄糖+25 u M PD98059)，48h后采 用westernblot方法檢測磷酸化ERKl/2(p-ERKl/2)的蛋白表達(dá)量(見圖l)，72h后采用 westernblot分別檢測CTGF的蛋白表達(dá)量(見圖2)。每個(gè)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)學(xué)方 法組間差異比較采用方差分析，P < 0. 05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果與低糖組、山梨醇組相比，高糖組磷酸化ERKl/2(p_ERKl/2)的表達(dá)以及 CTGF的表達(dá)明顯增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。與高糖組相比，AKF-PD組以及ERK抑制 劑組CTGF以及磷酸化ERKl/2(p-ERKl/2)的表達(dá)均明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。表1高糖刺激MMC 48h后各組p-ERKl/2蛋白表達(dá)結(jié)果(均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差) 與高糖組相比*P < 0. 05 ；與低糖組相比^ < 0. 05
表2高糖刺激MMC 72h后各組CTGF表達(dá)結(jié)果(均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差)
與高糖組相比*P < 0. 05 ；與低糖組相比^ < 0. 05結(jié)論1.高糖可誘導(dǎo)CTGF的表達(dá)；2. AKF-PD可抑制高糖對(duì)腎小球系膜細(xì)胞CTGF的誘導(dǎo)作用，從而治療糖尿病腎??；3. AKF-PD可通過ERK1/2MAPK途徑抑制高糖誘導(dǎo)小鼠系膜細(xì)胞CTGF表達(dá)。實(shí)施例2.實(shí)驗(yàn)名稱AKF-PD對(duì)db/db小鼠糖尿病腎病的治療效果1、實(shí)驗(yàn)材料及方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性C57BL/KSJ(db/db)小鼠10只，6周齡，體重29_36g ；C57BL/ KSJ(db/m)小鼠5只，6周齡，體重16-19g ；db/db小鼠和db/m小鼠均購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物有限公司。db/db小鼠10只隨機(jī)分為2組病理模型對(duì)照組，AKF-PD500mg/kg. d給藥 組，每組5只；db/m小鼠5只作為正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)藥物及試劑AKF_PD(中南大學(xué)藥學(xué)院提供)、小鼠尿白蛋白ELISA檢測試劑 盒(美國Assaypro公司)。實(shí)驗(yàn)過程于db/db小鼠10周齡開始，AKF-PD各治療組分別給予AKF-PD灌胃，病理模型對(duì) 照組和正常對(duì)照組給予等量CMCNa溶液灌胃；共給藥12周。結(jié)束給藥前-周用代謝籠收集24h尿液，用于ELISA法24h尿白蛋白定量測定。于 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前由框后靜脈取血，留取血清做生化分析；留取腎組織分別做常規(guī)脫水石蠟包埋、切片，做PAS染色。留取腎組織置于液氮中，每組隨機(jī)選5個(gè)標(biāo)本用Real Time-PCR方法做 I型膠原、IV型膠原的mRNA分析。腎組織PAS染色評(píng)分石蠟包埋組織塊2 ii m切片，PAS染色觀察，結(jié)果見圖3，半 定量評(píng)分法評(píng)價(jià)組織學(xué)改變嚴(yán)重程度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)每片隨機(jī)選取20個(gè)正切的腎小球，觀察 系膜基質(zhì)增生程度，正常腎小球計(jì)分為0分，系膜基質(zhì)輕度增生(腎小球毛細(xì)血管叢面積的 <25%)計(jì)1分，系膜基質(zhì)中度增生(腎小球毛細(xì)血管叢面積的25%-50%)計(jì)2分，系膜 基質(zhì)中重度增生(腎小球毛細(xì)血管叢面積的50%-75% )計(jì)3分，系膜基質(zhì)重度增生(腎小 球毛細(xì)血管叢面積的> 75% )計(jì)4分。統(tǒng)計(jì)方法組間差異比較采用方差分析，p < 0. 05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)治療前血糖見表3表3各組治療前血糖(mmol/L)結(jié)果比較(I士 s) 與db/m 小鼠相比，A p < 0. 05(2)治療后血糖、血脂見表4表4各組治療后血糖、血脂結(jié)果比較(I土 s) 注與正常組相比，AAp < 0. 01 ；與模型組相比，**p < 0. 01(3)治療后24h尿白蛋白定量見表5表5各組治療后24h尿白蛋白定量結(jié)果比較(I士 s) 注與正常組相比，ΔΔρ < 0. 01 ；與模型組相比，**ρ < 0. 01(4)腎組織病理評(píng)分(PAS染色)見表6。病理切片圖見圖3。表6各組治療后腎組織病理評(píng)分(PAS染色)結(jié)果比較(叉±5) 注與正常組相比，ΔΔρ < 0. 01 ；與模型組相比，**ρ < 0. 01(5)腎組織I型膠原、IV型膠原mRNA含量(real-time PCR)見表7。表7各組腎組織I型膠原、IV型膠原mRNA含量比較(I土 s) 注與正常組相比，Δρ< 0. 05，ΔΔρ < 0. 01 ；與模型組相比，*ρ < 0. 05，**ρ < 0. 01結(jié)論1. AKF-PD可顯著減少糖尿病腎病db/db小鼠24小時(shí)尿白蛋白排泄量；2. AKF-PD可顯著減少糖尿病腎病db/db小鼠高甘油三酯血癥；3. AKF-PD可顯著減輕糖尿病腎病db/db小鼠腎組織病理學(xué)改變；4. AKF-PD對(duì)db/db小鼠的早期糖尿病腎病有治療作用。實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)名稱=AKF-PD對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大鼠糖尿病腎病的治療效果1.實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組=Wistar清潔級(jí)大鼠(8周齡、雄性、體重180g_220g) 105只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，隨機(jī)分正常對(duì)照組15只、糖尿病組90只。將90只糖 尿病組大鼠隨機(jī)分成3組，病理模型對(duì)照組，AKF-PD500mg/kg. d給藥組，科索亞20mg/kg. d 組，每組30只。實(shí)驗(yàn)過程糖尿病大鼠模型制備采用鏈脲佐菌素(STZ) 55mg/kg 一次性腹腔注射法。72小時(shí) 后測定大鼠隨機(jī)血糖，如大鼠隨機(jī)血糖> 16.7mmol/L，認(rèn)為糖尿病大鼠模型制備成功。糖 尿病大鼠模型成功3周后給與藥物干預(yù)16周，16周后將大鼠全部處死取腎臟，留取血清做 BUN、Cr分析；留取腎組織分別做常規(guī)脫水石蠟包埋、切片，HE染色、PAS染色觀察腎臟病理 改變。留取腎組織置于液氮中，每組隨機(jī)選5個(gè)標(biāo)本用Real Time-PCR方法做IV型膠原、 TGF- 3 ” CTGF 的 mRNA 分析。PAS染色腎小球系膜基質(zhì)指數(shù)評(píng)分方法每片隨機(jī)選取20個(gè)正切的腎小球，觀察 系膜基質(zhì)增生程度，正常腎小球計(jì)分為0分，系膜基質(zhì)輕度增生(腎小球毛細(xì)血管叢面積的 <25%)計(jì)1分，系膜基質(zhì)中度增生(腎小球毛細(xì)血管叢面積的25%-50%)計(jì)2分，系膜 基質(zhì)中重度增生(腎小球毛細(xì)血管叢面積的50% -75% )計(jì)3分，系膜基質(zhì)重度增生(腎 小球毛細(xì)血管叢面積的> 75% )計(jì)4分。統(tǒng)計(jì)方法組間差異比較采用方差分析，p < 0. 05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)各組處死前腎重、體重、體重/腎重結(jié)果比較見表8。表8各組處死前腎重、體重、體重/腎重結(jié)果比較(無± S) 與模型組比較*P < 0. 05 ；與正常組比較AP < 0. 05(2)治療后血BUN、Cr見表9。表9各組血BUN、Cr結(jié)果比較(叉土 s) 與模型組比較，*P < 0. 05 ；**P < 0. 01
(3)各組大鼠腎臟組織病理檢測結(jié)果(PAS染色) 經(jīng)PAS染色觀察大鼠腎臟病理改變，正常組大鼠腎臟未見明顯病理改變。模型組可見腎小球基底膜增厚、系膜區(qū)基質(zhì)增多，AKF-PD組和氯沙坦組腎小球基 底膜、系膜區(qū)基質(zhì)增生情況明顯減輕，且AKF-PD組減少更為明顯。見圖4對(duì)糖尿病腎病各組大鼠腎臟組織進(jìn)行腎小球系膜基質(zhì)指數(shù)評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正 常組相比，模型組的系膜基質(zhì)指數(shù)明顯增加(P <0.01)；與模型組相比，AKF-PD組和氯沙坦 組的系膜基質(zhì)指數(shù)明顯降低(P <0.01)，見表10。表10各組大鼠腎小球系膜基質(zhì)指數(shù)(〒士 S) 與模型組比較:*Ρ < 0. 01 ；與正常組比較:ΔΡ<0. 01(4)治療后腎組織IV型膠原、TGF- β 、CTGF mRNA見表11。表11各組腎組織IV型膠原、TGF- β 、CTGF mRNA比較 士 s) 與模型組比較，*P < 0. 05 **P < 0. 01 ；與氯沙坦組比較，flP < 0. 053.結(jié)論(1)氟非尼酮組大鼠體重較糖尿病腎病模型組重，腎重、腎重/體重比糖尿病腎病 模型組低；(2)氟非尼酮組大鼠血清BUN較糖尿病腎病模型組低；(3)氟非尼酮組大鼠腎臟的腎小球病變較糖尿病腎病模型組的大鼠腎臟病變明顯 減輕，氟非尼酮組大鼠腎臟的IV型膠原mRNA較糖尿病腎病模型組和氯沙坦組少；(4)氟非尼酮組大鼠腎臟的TGF-β i和CTGF mRNA較糖尿病腎病模型組少；(5)說明氟非尼酮能有效治療早期糖尿病腎病，且其治療效果優(yōu)于氯沙坦。
權(quán)利要求
通式(X)化合物在制備治療糖尿病腎病藥物中的用途。當(dāng)n＝1時(shí)，所述的取代基R表示F、Br、I；當(dāng)n＝2時(shí)，所述的取代基R表示F、Cl、Br、I，飽和直鏈烴基、氧代飽和直鏈烴基、鹵代飽和直鏈烴基；所述的取代基團(tuán)R在苯環(huán)上的位置具有鄰位、間位或?qū)ξ环绞?。F2009100432502C0000011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于該化合物是1-(3_氟苯基)-5_甲 基-2 (1H)-吡啶酮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所說的糖尿病是II型糖尿病。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所說的糖尿病腎病是出于早期，即糖尿 病腎病I期或糖尿病腎病II期或糖尿病腎病III期。
全文摘要
本發(fā)明涉及吡啶酮類化合物的新醫(yī)藥用途，具體地是涉及制備治療糖尿病腎病藥物中的用途。即通式(X)化合物在制備治療糖尿病腎病藥物中的用途，當(dāng)n＝1時(shí)，所述的取代基R表示F、Br、I；當(dāng)n＝2時(shí)，所述的取代基R表示F、Cl、Br、I，飽和直鏈烴基、氧代飽和直鏈烴基、鹵代飽和直鏈烴基；所述的取代基團(tuán)R在苯環(huán)上的位置具有鄰位、間位或?qū)ξ环绞健?br> 文檔編號(hào)C07D213/64GK101874801SQ200910043250
公開日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2009年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月29日
發(fā)明者胡高云, 陶立堅(jiān) 申請(qǐng)人:中南大學(xué)