專利名稱：與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合的抗體和用于動(dòng)物的基于抗體的藥物遞送系統(tǒng)的制作方法
與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合的抗體和用于動(dòng)物的基于抗體的藥
物遞送系統(tǒng)本發(fā)明提供與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合的抗體和其中可將特定制劑引導(dǎo)(directed to)至動(dòng)物毛發(fā)的基于抗體的藥物遞送系統(tǒng)。這是由以下需求驅(qū)動(dòng)的增加動(dòng)物的外寄生 物治療的有效治療時(shí)期、降低這些藥物的毒性并改進(jìn)其釋放概況(profile)。選擇兩種單克隆抗體，其對(duì)犬的毛發(fā)表面顯示出高度結(jié)合性。重要的是，沒(méi)有檢測(cè) 到對(duì)人、馬或貓的毛發(fā)的結(jié)合。本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)證明，所選的抗體適合于設(shè)計(jì)將藥物引導(dǎo)至 動(dòng)物毛發(fā)的遞送系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
在很久以前本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)知道抗體與毛發(fā)結(jié)構(gòu)的附著(attachment)或連 接以及那些抗體在與毛發(fā)治療活性物質(zhì)或含有毛發(fā)治療活性物質(zhì)的顆粒連接中的有益用 途。Widder (美國(guó)專利3，987，161)描述了包含抗體的毛發(fā)護(hù)理產(chǎn)品，所述抗體含有從動(dòng)物 獲得的血清，所述動(dòng)物在其身體被注射哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)毛發(fā)的水性懸浮液時(shí)能夠在血 液中形成抗體。Igarashi等人(美國(guó)專利5，597，386)描述了攜帶毛發(fā)染料或含有著色物 質(zhì)的聚合物顆粒(例如聚苯乙烯顆粒)的抗毛發(fā)抗體，因此使著色活性物質(zhì)與人的毛發(fā)結(jié) 合，以便獲得毛發(fā)治療中的益處。該抗體被描述為抗角蛋白抗體，其是通過(guò)向哺乳動(dòng)物肌肉 內(nèi)注射角蛋白聚合物并通過(guò)牛初乳收獲抗體而獲得的，其中通過(guò)人毛發(fā)結(jié)構(gòu)的水解和分解 而獲得角蛋白。攜帶染料的顆粒被描述為大分子載體。Koyama等人(美國(guó)專利6，123，934) 描述了含有與毛發(fā)結(jié)合的抗體的化妝品組合物以及使用該抗體將乙烯基單體的聚合物或 共聚物的膠乳顆粒與毛發(fā)結(jié)構(gòu)連接。制劑可以含有陽(yáng)離子聚合物或其它成分，以改善或修 復(fù)毛發(fā)結(jié)構(gòu)。在該發(fā)明中，通過(guò)注射水解的人毛發(fā)或人毛發(fā)顆粒(通過(guò)將完整的毛發(fā)纖維 結(jié)構(gòu)磨碎而得到)來(lái)免疫家禽，從而獲得抗體。在所有這些發(fā)明中，使用人的毛發(fā)結(jié)構(gòu)進(jìn)行 免疫，并獲得與角蛋白結(jié)合的多克隆抗體。一般來(lái)講，已經(jīng)知道可以通過(guò)用生物抗原結(jié)構(gòu)來(lái) 免疫哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類以產(chǎn)生抗體，然后可將抗體用于將與那些抗體直接或間接連接的有益 活性物質(zhì)引導(dǎo)至需要的區(qū)域，例如癌細(xì)胞。Paluzzi和合作者(2004)已經(jīng)使用來(lái)自羊絨(cashmere)的II型角蛋白作為抗原 來(lái)產(chǎn)生物種特異性的單克隆抗體。通過(guò)二維免疫印跡測(cè)試所選擇抗體與分離自羊絨和羊毛 的角蛋白的免疫反應(yīng)性。檢測(cè)到幾個(gè)定量和定性差異，這使得在與其它動(dòng)物纖維比較時(shí)，能 夠特異性地鑒別羊絨。但是，所選則的單克隆抗體與所有樣品結(jié)合，在所測(cè)試物種之間僅觀 察到信號(hào)強(qiáng)度和蛋白模式上的微小差異。重要的是，抗體與所提取的角蛋白I型和II型蛋 白結(jié)合一沒(méi)有證明其與毛發(fā)表面結(jié)合。在獸醫(yī)領(lǐng)域，人們可以通過(guò)使用含有有益試劑的顆粒而從那些發(fā)明中獲益，并且 通過(guò)使用與動(dòng)物毛發(fā)或動(dòng)物皮膚結(jié)合的抗體將那些試劑靶向毛發(fā)角蛋白結(jié)構(gòu)或皮膚結(jié)構(gòu)。 當(dāng)人們考慮選擇使用這些顆粒作為在延長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)(即幾周、一個(gè)月甚至一年)釋放那些 藥物的物體，這是特別有用的，從而保護(hù)動(dòng)物抵抗有害動(dòng)物(即，昆蟲例如蚤和蜱)，或者 利用其它有益效應(yīng)，例如抵制有害昆蟲或在這個(gè)長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)治療皮膚疾病。按一次性施用制
3備為此目的而設(shè)計(jì)的典型制劑，其顯示出幾個(gè)小時(shí)至大約四周的有益效應(yīng)。使用載體系統(tǒng) (例如聚合物顆粒)可以提供顯著延長(zhǎng)這個(gè)時(shí)期的選擇。使用抗體將那些顆粒與毛發(fā)連接 可以提供一個(gè)選擇，以提供活性物質(zhì)與毛發(fā)的連接，該連接持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間以允許藥物 載體在需要的時(shí)期內(nèi)與毛發(fā)或皮膚結(jié)合(stick)。需要合適的制劑。可用于將那些制劑應(yīng) 用至動(dòng)物的應(yīng)用系統(tǒng)是例如，噴霧劑或所謂的點(diǎn)式(spot-on)或擦式(wipe-on)制劑，其 使制劑與動(dòng)物皮膚或毛皮接觸。感興趣的活性物質(zhì)可以是例如擬除蟲菊酯或一般性殺蟲 劑，以及全身性藥物或行為調(diào)節(jié)藥劑。以上專利中描述的方法可提供獲得此類藥物遞送系統(tǒng)的途徑。但是，由于那些發(fā) 明中描述的抗體以及通過(guò)所描述的方法所獲得的抗體與毛發(fā)角蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合，因此出現(xiàn)一 個(gè)主要的缺點(diǎn)不論是何種物種，經(jīng)由噴霧劑或點(diǎn)式制劑將制劑施用于動(dòng)物時(shí)，會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈 且持久的與哺乳動(dòng)物毛發(fā)(即角蛋白結(jié)構(gòu))的結(jié)合。因此，人類施用者也可能由于那些攜 帶藥物的系統(tǒng)與體毛或頭發(fā)偶然結(jié)合而接受活性物質(zhì)的劑量。同樣，有可能由于撫摸動(dòng)物 而使那些攜帶藥物的活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移至人體，這有時(shí)可能會(huì)使寵物主人暴露于有侵襲性的活 性物質(zhì)，例如擬除蟲菊酯。為了施用安全原因，如果人們可以獲得允許選擇性靶向某些動(dòng)物 物種的毛發(fā)或皮膚的抗體，則將是一個(gè)大的優(yōu)點(diǎn)。如果獸醫(yī)必需在畜舍(多個(gè)物種飼養(yǎng)于 其中，并且只有一個(gè)物種表現(xiàn)待治療的疾病，或者僅必需保護(hù)一個(gè)物種免遭物種特異性害 蟲(侵害))中使用那些制劑，則獲得此類抗體制劑也具有相當(dāng)大的優(yōu)點(diǎn)。如果人們使用以上描述的現(xiàn)有技術(shù)方法，以獲得針對(duì)動(dòng)物毛發(fā)的抗體，則本領(lǐng)域 技術(shù)人員將會(huì)預(yù)期獲得與角蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合的抗體。角蛋白普遍存在于所有哺乳動(dòng)物中，不 同物種間的蛋白序列是十分保守的。因此，抗角蛋白抗體將普遍結(jié)合至哺乳動(dòng)物毛發(fā)。在本發(fā)明中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)可以獲得物種特異性的毛發(fā)結(jié)合抗體，其僅與物種 特異性動(dòng)物毛發(fā)表面結(jié)構(gòu)結(jié)合，而不與人的毛發(fā)表面或不同于用其毛發(fā)進(jìn)行免疫的那個(gè)物 種的物種的毛發(fā)表面結(jié)合。顯而易見(jiàn)地，存在可被那些抗體靶向的物種特異性抗原結(jié)構(gòu)。包 含那些抗體以及與那些抗體(作為分子實(shí)體或填充入含有藥物的顆粒中)連接的藥物的攜 帶藥物的制劑能夠避免以上描述的缺點(diǎn)。本發(fā)明實(shí)施方式的描述本發(fā)明提供了與動(dòng)物的毛發(fā)表面選擇性結(jié)合的抗體。此類抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體或重組抗體，例如全長(zhǎng)抗體(full-size antibody)、二聚體分泌性 IgA (dimeric secretory IgA)、多聚體 IgM(multimeric IgM)及 其片段，例如F(ab’ )2片段、Fab片段、Fv片段、單鏈Fv抗體(scFv)、雙特異性scFv、雙抗 體、三鏈抗體、四鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體(dingle domain antibody) (dAb)、minobody或分子 識(shí)別單元(MRU)，其源自雜交瘤細(xì)胞、合成的、半合成的、原態(tài)的(naive)和免疫活性的噬菌 體庫(kù)或核糖體展示庫(kù)，或通過(guò)產(chǎn)生全合成設(shè)計(jì)抗體。本發(fā)明的抗體與犬、貓、牛、綿羊、山羊、駱駝、羊駝(Iama)和/或馬的毛發(fā)表面結(jié) 構(gòu)選擇性結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步提供靶向單獨(dú)動(dòng)物物種的包含抗體的藥物遞送系統(tǒng)，所述抗體能夠 與所述單獨(dú)動(dòng)物物種的毛發(fā)表面選擇性結(jié)合。所述包含抗體的遞送系統(tǒng)結(jié)合或附著于固體顆粒的表面，從而使這些顆粒與動(dòng)物 的毛發(fā)表面結(jié)構(gòu)選擇性結(jié)合。
本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)按如下方式包含與單獨(dú)物種的動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合的抗 體的制劑和含有活性成分的顆粒在第一步中抗體與所述單獨(dú)動(dòng)物物種的毛發(fā)選擇性結(jié) 合，在第二步中顆粒與偶聯(lián)于動(dòng)物毛發(fā)的抗體結(jié)合。本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)一步按如下方式包含與合適的間隔體(spacer)/介 質(zhì)(mediator)/中間偶聯(lián)劑連接的或化學(xué)結(jié)合的動(dòng)物毛發(fā)結(jié)合性抗體(hair binding antibody)的制劑和顆粒的制劑在第一步中攜帶抗體的間隔體/介質(zhì)/偶聯(lián)劑通過(guò)所述 抗體與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合，在第二步中顆粒通過(guò)與所述間隔體/介質(zhì)/偶聯(lián)劑結(jié)合而連 接于動(dòng)物毛發(fā)。本發(fā)明進(jìn)一步提供藥物遞送系統(tǒng)，其按如下方式包含動(dòng)物毛發(fā)結(jié)合性抗體的制劑 和合適的間隔體/介質(zhì)/中間偶聯(lián)劑連接或附著于其表面的顆粒的制劑在第一步中抗體 與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合，在第二步中攜帶間隔體/介質(zhì)/偶聯(lián)劑的顆粒通過(guò)與所述抗體結(jié) 合而連接于動(dòng)物毛發(fā)。本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)按如下方式包含與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合的抗體以及顆粒 抗體和顆?？梢源嬖谟趯?duì)動(dòng)物施用的單一制劑中；或可以存在于兩種不同的制劑(I)和 (II)中，在緊鄰對(duì)動(dòng)物施用前將其混合；或者可以按如下方式存在于兩種不同的制劑(I) 和(II)中在第一步中對(duì)動(dòng)物施用制劑(I)，稍后在第二步中對(duì)動(dòng)物施用制劑(II)。藥物遞送系統(tǒng)包含顆粒，其可以含有或可以不含以下物質(zhì)對(duì)動(dòng)物有益的活性成 分或藥劑，即藥物；殺蟲劑；毛發(fā)或皮膚護(hù)理劑；保護(hù)經(jīng)處理的動(dòng)物免受有害害蟲動(dòng)物(例 如昆蟲)侵襲的驅(qū)除劑(Impellent agent)；氣味改變劑(smell modifying agents)；或改 變經(jīng)處理的動(dòng)物或其它未經(jīng)處理，但與被施用該處理的動(dòng)物相互作用的個(gè)體動(dòng)物的行為的 藥劑。顆?？珊袑?duì)動(dòng)物有益的活性成分或藥劑，其濃度適合于它的治療或有益目的， 即 0. 01% -99. 9%o本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)是這樣的系統(tǒng)其中顆粒本身含有對(duì)動(dòng)物有益的活性成分 或藥劑，即藥物；殺蟲劑；毛發(fā)或皮膚護(hù)理劑；保護(hù)經(jīng)處理的動(dòng)物免受有害害蟲動(dòng)物侵襲的 驅(qū)除劑；氣味改變劑；或改變經(jīng)處理的動(dòng)物或其它未經(jīng)處理，但與被施用該處理的動(dòng)物相 互作用的個(gè)體動(dòng)物的行為的藥劑。顆粒的直徑可以是0.001 μ 至10 μ m，優(yōu)選為0. 1 μ m至2 μ m。在對(duì)動(dòng)物施用單一治療后，本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)允許保護(hù)所述動(dòng)物抵抗疾病， 持續(xù)治療動(dòng)物疾病，或者允許動(dòng)物從持續(xù)延長(zhǎng)時(shí)期(即從幾個(gè)小時(shí)至365天)的所述活性 物質(zhì)效應(yīng)中受益。本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)一步按如下方式包含與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合的抗體的 制劑和對(duì)動(dòng)物有益的藥劑有益試劑按如下方式直接或通過(guò)間隔體/介質(zhì)/偶聯(lián)劑與所述 抗體連接/偶聯(lián)/結(jié)合所述活性物質(zhì)與所述抗體或間隔體/介質(zhì)/偶聯(lián)劑的連接被動(dòng)物 毛皮(fur)或皮膚的環(huán)境條件所中斷(broken)，從而釋放活性物質(zhì)或活性物質(zhì)的一部分或 活性物質(zhì)_抗體結(jié)構(gòu)的一部分，以實(shí)現(xiàn)其對(duì)動(dòng)物的有益效應(yīng)。藥物遞送系統(tǒng)按如下方式起作用在延長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)，活性物質(zhì)與抗體或間隔體/ 介質(zhì)/偶聯(lián)試劑的結(jié)合被隨機(jī)中斷，從而允許保護(hù)所述動(dòng)物抵抗疾病，持續(xù)治療動(dòng)物疾病， 或者允許動(dòng)物從持續(xù)延長(zhǎng)時(shí)期(即從幾個(gè)小時(shí)至365天)的所述活性物質(zhì)效應(yīng)中受益。
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本文描述的藥物遞送系統(tǒng)包含與動(dòng)物毛發(fā)特異性結(jié)合的抗體或所述抗體的制劑， 其中所述抗體以合適的結(jié)合強(qiáng)度，按如下方式與動(dòng)物毛發(fā)結(jié)合與動(dòng)物毛發(fā)結(jié)合的抗體量 以及附著于所述抗體的活性成分的量保持足夠大，以在延長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)，甚至在動(dòng)物毛皮與 水接觸幾次之后(例如通過(guò)洗澡或淋雨)或在用含有表面活性劑的溶液洗滌動(dòng)物之后，維 持所需的有益效應(yīng)。即使將其于4°C保存在含有水和至多50%的與水混溶的有機(jī)溶劑的溶液之中，持 續(xù)長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)的時(shí)期，本發(fā)明的抗體能夠保持其與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合的能力和特異性。即使將其配制或保存在含有其它毛發(fā)處理化合物(即，表面活性劑，非離子、陰離 子或陽(yáng)離子聚合物和與水混溶的醇，其濃度為毛發(fā)護(hù)理制劑中通常所施用的濃度)的水溶 液中，抗體仍能夠保持其與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合的能力和特異性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，藥物遞送系統(tǒng)包含本發(fā)明抗體，所述抗體另外直接或通過(guò) 合適的間隔體/介質(zhì)/中間體偶聯(lián)試劑結(jié)合或附著于固體顆粒表面，從而使這些顆粒與動(dòng) 物毛發(fā)選擇性結(jié)合。


圖1顯示了抗體B7. 3和B18-4. 3在人和犬的毛發(fā)上的結(jié)合。使用微量滴定板過(guò) 濾ELISA使單克隆抗體與各種犬的品種的毛發(fā)和人的毛發(fā)結(jié)合(5ng抗體在Img毛發(fā)/孔 上)。使用與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠Fc和ABTS底物進(jìn)行檢測(cè)。所有樣品重復(fù) 分析三次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。WHT=西高地梗犬(Westhighland terrier) 圖2是兩種抗體B7. 3和B18-4. 3的SDS-PAGE的免疫印跡?？贵wB7. 3顯示預(yù)期 的重鏈和輕鏈尺寸，而抗體B18-4. 3具有兩個(gè)較短的重鏈片段，這是由B18-4. 3的重鏈基因 中的突變所引起的。圖3顯示了加載至具有抗生物素蛋白表面的珠粒(beads)上的生物素化的 B18-4.3的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)圖像。紅線(第二個(gè)峰)顯示了由與B18-4.3結(jié)合的山羊抗小 鼠藻紅蛋白所引起的位移(shift)，這表明抗體與珠粒結(jié)合。圖4顯示了熒光珠粒通過(guò)抗體B18-4. 3與犬的毛發(fā)結(jié)合。a :0. 8 μ m鏈霉抗生物 素蛋白表面修飾的珠粒(與FITC偶聯(lián))通過(guò)生物素化的B18-4. 3與西高地梗犬的毛發(fā)結(jié) 合。b =Iym偶聯(lián)了中性抗生物素蛋白(neutravidin)的熒光球(fluosphere)通過(guò)生物素 化的B18-4.3與比格犬(Beagle)的毛發(fā)結(jié)合，所述毛發(fā)經(jīng)過(guò)以下預(yù)處理在60°C下，用含 有300mM KBr的Tris-緩沖液(pH 8. 8)進(jìn)行洗滌。圖5顯示了毛發(fā)的共焦顯微鏡分析?？贵wB18-4.3主要與毛發(fā)薄片(hairflakes) 的邊緣結(jié)合。通過(guò)山羊抗小鼠Alexa488進(jìn)行檢測(cè)。圖6顯示了通過(guò)抗體B7. 3和B18-4. 3識(shí)別的抗原結(jié)構(gòu)的分析。用含有300mM KBr的Tris-緩沖液(pH 8.8)洗滌西高地梗犬的毛發(fā)，通過(guò)丙酮沉淀將該洗滌級(jí)分(wash fraction)濃縮。通過(guò)免疫印跡分析經(jīng)富集的毛發(fā)表面蛋白(eHSP)。通過(guò)一抗B7. 3或 B18-4. 3，然后通過(guò)山羊抗小鼠AP標(biāo)記的二抗并用NBT/BCIP染色來(lái)檢測(cè)抗原。圖7a和b顯示了毛發(fā)特異性抗體B7. 3和B18-4. 3與犬、貓、馬和人的毛發(fā)的結(jié)合。圖8證明了具備(equipped)抗體的微粒與犬毛發(fā)的充分結(jié)合，與之對(duì)比的是與人 毛發(fā)的差的結(jié)合。
圖9顯示了表面連接了犬毛發(fā)特異性抗體B18-4. 3和B7. 3的混合物且含有熒光 染料的聚苯乙烯微粒，其與比格犬毛發(fā)結(jié)合。含有染料的微粒用作結(jié)合指示劑，其與相同類 型的含有殺螨劑的微粒一起施用。進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，以便顯示物種特異性的毛發(fā)結(jié)合抗體以及 具備抗體的微粒作為控釋藥物載體，以保護(hù)犬抵抗蜱的示例性應(yīng)用。施用之后立刻獲取圖 像，圖像顯示了對(duì)應(yīng)于用蜱侵?jǐn)_犬以后2天，微粒在一些毛發(fā)樣品上的結(jié)合。圖10顯示了施用制劑7天以后微粒與犬毛發(fā)的結(jié)合。圖Ila和b顯示了施用制劑14天以后微粒與犬毛發(fā)的結(jié)合。圖12a、b和c顯示了即使在施用42天以后，仍然可以在犬毛發(fā)上見(jiàn)到微粒，這證 明了抗體介導(dǎo)的微粒與犬毛發(fā)的結(jié)合的持續(xù)性。圖13顯示了即使在對(duì)犬毛發(fā)施用制劑63天以后，仍然可以在毛發(fā)表面見(jiàn)到微粒。I·秘盼·_種禾_華通過(guò)將小鼠免疫然后使用雜交瘤技術(shù)來(lái)產(chǎn)生動(dòng)物毛發(fā)特異性抗體。使用勻漿器將 切自比格犬的毛發(fā)切碎。切碎的(shredded)毛發(fā)長(zhǎng)度大約為200 μ m。用切碎的比格犬毛發(fā)將兩只小鼠免疫。將最多80 μ g毛發(fā)樣品(=20 μ L切碎的 毛發(fā))與40 μ L GERBU佐劑和50 μ L Ix PBS混合，并用于免疫。在10月11日、10月25 日、11月3日和11月28日將小鼠免疫四次，在12月2日將小鼠殺死。分離脾細(xì)胞并與骨 髓瘤細(xì)胞融合，以產(chǎn)生雜交瘤。將遞增稀釋液中的細(xì)胞吸移(pipetting)至96孔微量滴定 板中以進(jìn)行有限稀釋。為了篩選產(chǎn)生毛發(fā)特異性抗體的雜交瘤克隆，建立新的ELISA方案 (setup)。將部分裂解的毛發(fā)(在室溫下置于Shindai反應(yīng)劑中10分鐘，然后進(jìn)行勻漿并 重懸浮于碳酸鹽緩沖液中)包被至低結(jié)合性96孔微量滴定板上。加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上 清液之后，使用與辣根過(guò)氧化物酶(HPRO)偶聯(lián)的山羊抗小鼠(GAM) 二抗檢測(cè)特異性抗體的 結(jié)合。鑒定出總共23個(gè)與毛發(fā)樣品結(jié)合的多克隆雜交瘤克隆(B1-23)。但是，由于包被的 是部分裂解的毛發(fā)，所以選擇與存在于毛發(fā)內(nèi)部的抗原結(jié)合的抗體以及與毛發(fā)表面上的抗 原結(jié)合的抗體兩者。為了鑒定識(shí)別毛發(fā)表面上的結(jié)構(gòu)的結(jié)合者，使用基于Eppendorf的ELISA測(cè)試來(lái) 自單克隆雜交瘤系的抗體。用1滴膠水(glue)將20-50根人或動(dòng)物毛發(fā)固定于Eppendorf 管的底部，用PBS中的2% (w/v)BSA將非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉。將雜交瘤上清液或IOyg 純化的單克隆抗體轉(zhuǎn)移至管中并在室溫下孵育30分鐘。洗滌之后，使用山羊抗小鼠二抗 (以HRPO標(biāo)記)檢測(cè)特異性結(jié)合，并在室溫下孵育20分鐘。最后，使用2，2’-連氮基-雙 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)反應(yīng)劑(作為HRPO的底物)顯現(xiàn)結(jié)合。30秒后在OD 405處測(cè)定顯色。通過(guò)基于Eppendorf的ELISA鑒定出兩種單克隆抗體。將這些抗體(命名為B7. 3 和B18-4. 3，其顯示出對(duì)動(dòng)物毛發(fā)表面的特異性結(jié)合)純化并關(guān)于其對(duì)不同毛發(fā)樣品的特 異性進(jìn)行表征。單克隆抗體的純化通過(guò)蛋白G或者通過(guò)超濾沉淀從雜交瘤培養(yǎng)上清液中純化單克隆抗體B7. 3和 B18-4.3。純化蛋白的產(chǎn)率為0. 1至1. lmg/mL。純化的抗體用于后續(xù)分析。單克隆抗體的表征抗體結(jié)合~基于Eppendorf的ELISA
為了定性確認(rèn)純化的單克隆抗體B7. 3和B18-4. 3與毛發(fā)表面的結(jié)合，使用了基于 Eppendorf 的 ELISA。抗體 B7. 3 和 B18-4. 3 與約克夏梗犬(Yorkshire terrier)的毛發(fā)特 異性結(jié)合。重要的是，沒(méi)有檢測(cè)到與人毛發(fā)的結(jié)合。使用以下毛發(fā)樣品進(jìn)行了另外幾個(gè)基于Eppendorf的ELISA 人、馬、貓、雪納瑞犬 /拉布拉多犬混種(Schnauzer/Labrador mix)、澳大利亞牧羊犬、洗滌前和洗滌后的貴賓犬 (Poodle) (3個(gè)樣品)、洗滌前和洗滌后的約克夏梗犬(4個(gè)樣品)、洗滌前和洗滌后的西高地 梗犬(2個(gè)樣品)。表1中列出了基于Eppendorf的ELISA的總結(jié)。數(shù)據(jù)顯示，兩種單克隆抗體均與來(lái) 自五個(gè)犬物種的毛發(fā)表面特異性結(jié)合。當(dāng)使用人、馬或貓的毛發(fā)時(shí)，沒(méi)有觀察到結(jié)合，這證 明所選則的抗體對(duì)于犬毛發(fā)具有強(qiáng)烈的特異性。似乎單克隆抗體B18-4.3比B7.3具有更 強(qiáng)的針對(duì)犬毛發(fā)的結(jié)合活性。在不同的毛發(fā)樣品之間存在一些微小的變化。在進(jìn)行ELISA 之前對(duì)毛發(fā)的處理降低了所有測(cè)試抗體的結(jié)合活性，但是仍然存在結(jié)合的抗體。表1 基于Eppendorf的ELISA測(cè)試結(jié)果。-=無(wú)結(jié)合，+ =低結(jié)合(0D < 1)，++ =中等結(jié)合(0D > 1 < 3)，+++ =高度結(jié)合(0D > 3)，* =洗滌后。
抗體人馬貓雪納瑞/ 拉布拉 多大澳大利 亞牧羊 犬責(zé)賓犬約克夏梗犬西高地 梗犬123123412B7.3++++ *++ +*++ A*+ *++ *+ *+ *++++ + **B18-4.3++++++-H- +*-H-+ **++ + **-H-++ + ■k*+ + *++ *++ + **++ + **抗體結(jié)合和功能件(functionality)建立了另一種ELISA，以能夠定量比較兩種抗體B7. 3和B18-4. 3與毛發(fā)的結(jié)合。 將犬的毛發(fā)切成2-5mm長(zhǎng)的小段并溶于PBS(5mg/ml)中。將200 μ 1的這種懸浮液吸移入 96孔微量滴定過(guò)濾板(Multiscreen HTS，膜孔徑1. 2 μ m，Millipore)的每個(gè)孔中。通過(guò)離 心將緩沖液和底物進(jìn)行交換，以致在這些程序中微量滴定過(guò)濾板中的毛發(fā)不會(huì)減少。在預(yù)備實(shí)驗(yàn)中將與Img毛發(fā)(=孔)結(jié)合的最大抗體量確定為5-lOng (取決于犬 的品種和抗體)。因此，多數(shù)實(shí)驗(yàn)以2. 5或5ng/孔進(jìn)行。為了檢查兩種抗體與各種犬品種的毛發(fā)的結(jié)合，用以下犬的的毛發(fā)進(jìn)行了微量滴 定過(guò)濾板ELISA 西高地梗犬、德國(guó)牧羊犬(來(lái)自腹部的毛發(fā))、約克夏梗犬混種、愛(ài)爾蘭塞 特犬(Irish setter)、德國(guó)硬毛梗犬(Germanwired-hair terrier)、豐公獅犬(Chow-chow) > 貴賓犬、小明斯特蘭德犬(smallMimsterlander)、比格犬、德國(guó)牧羊犬(來(lái)自背部區(qū)域的 毛發(fā))、霍夫瓦爾特犬(Hovawart)、西施犬(Shih_tzu)、狐貍?cè)?Spitz)、邊境柯利牧羊犬 (Border collie)、拉布拉多犬、Mongrel (來(lái)自背部的毛發(fā))> Mongrel (來(lái)自腹部的毛發(fā))、 伯瑞犬(Briard)、澳大利亞牧羊犬。在該測(cè)試中還包括人的毛發(fā)。獲得的所有數(shù)值相對(duì)于
8西高地梗犬進(jìn)行校正(圖1)。還使用共焦顯微鏡，通過(guò)免疫熒光成像來(lái)證明純化的抗體與毛發(fā)表面的結(jié)合。例 如，抗體B7. 3顯示出與約克夏梗犬毛發(fā)的強(qiáng)烈結(jié)合。當(dāng)僅應(yīng)用ALEXA564標(biāo)記的山羊抗小 鼠二抗時(shí)，沒(méi)有觀察到熒光，這證明了 B7. 3對(duì)于毛發(fā)表面的特異性。在應(yīng)用抗體前，用丙酮 處理毛發(fā)，導(dǎo)致熒光信號(hào)減少。當(dāng)用溫和的去污劑洗滌毛發(fā)樣品時(shí)也觀察到相似的結(jié)果?？贵w的完整件、穩(wěn)定件和功能件為了證實(shí)抗體重鏈和輕鏈的完整性，通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)純化的蛋白 進(jìn)行分析?？贵wB7. 3具有預(yù)期大小的完整的重鏈和輕鏈，而抗體B18-4. 3的兩條重鏈帶均 比全長(zhǎng)重鏈小(大約44和47kDa，而不是55kDa)(圖2)。這些突變的重鏈之一是C2結(jié)構(gòu) 域末端處的移碼突變的結(jié)果，移碼突變產(chǎn)生早熟的終止密碼子(premature stop codon) 0 另一條突變的重鏈的起源仍然未知。沒(méi)有觀察到B7. 3和B18-4. 3重鏈的降解產(chǎn)物，這證明 了純化抗體的完整性。為了分析穩(wěn)定性，使用基于Eppendorf的ELISA在異丙醇的存在下進(jìn)行單克隆抗 體的結(jié)合試驗(yàn)。在30% (ν/ν)異丙醇的存在下，經(jīng)4個(gè)月的時(shí)期，在4°C下，單克隆抗體Β7. 3 顯示出穩(wěn)定的結(jié)合。于4°C將抗體保存在40%或50% (ν/ν)異丙醇中時(shí)，仍然存在與犬毛 發(fā)的結(jié)合，這證明了該蛋白的高度穩(wěn)定性。此外，在22°C下，在20% (ν/ν)異丙醇的存在下， 抗體Β7. 3是穩(wěn)定的。Β18-4. 3的穩(wěn)定性更佳。在40% (ν/ν)異丙醇的存在下，該單克隆抗體在4°C下儲(chǔ) 存4個(gè)月時(shí)間后，顯示出與毛發(fā)的穩(wěn)定結(jié)合。另夕卜，在含有6 % (v/v)Luviskol VA 64W(BASF)、5 % (v/v)LuviquatPQ IlPN (BASF) ,0. 3 % (v/v) Pluracare E400 PEG-8 (BASF) ,0. 2 % (v/v) Q2-5220 樹(shù)月旨(Dow Corning)和15% (v/v)異丙醇的制劑溶液中測(cè)試了單克隆抗體的穩(wěn)定性和功能性。在4°C 下，在制劑中儲(chǔ)存3天之后，使用基于Eppendorf的ELISA測(cè)試了抗體的結(jié)合，其表明，B7. 3 和B18-4. 3在制劑中具有高度穩(wěn)定性。抗體結(jié)合能力(capacity)為了確定最大結(jié)合能力，使用確定數(shù)目的約克夏梗犬毛發(fā)(20根，每根長(zhǎng)20mm)， 以基于Eppendorf的ELISA對(duì)B18-4. 3的稀釋液進(jìn)行測(cè)試。每個(gè)Eppendorf管中的毛發(fā)表 面積對(duì)應(yīng)于3. 15mm2。根據(jù)ELISA，2. 5-5. Ong的抗體B18-4. 3與3. 15mm2的毛發(fā)表面結(jié)合?？贵w的生物素化為了分析結(jié)合伴侶(binding partners)對(duì)抗體功能性的影響，使純化的單克隆 抗體生物素化，然后與抗生物素蛋白珠粒結(jié)合，通過(guò)FACS分析進(jìn)行證實(shí)(圖3)。使用基于 Eppendorf的ELISA分析與犬毛發(fā)的結(jié)合。通過(guò)與HRPO偶聯(lián)的抗生物素蛋白檢測(cè)生物素化 的抗體B7. 3和B18-4. 3的結(jié)合，其證明生物素化和結(jié)合伴侶不影響抗體的功能性?？贵w與珠粒的融合為了分析與珠粒偶聯(lián)的單克隆抗體的結(jié)合，用含有0. 5% (v/v)吐溫20的Ix PBS 預(yù)處理來(lái)自西高地梗犬的毛發(fā)，以除去污染物和非緊密固定的抗原結(jié)構(gòu)。然后，施用生物素 化的抗體B18-4. 3(0. 8mg/mL)，并使用鏈霉抗生物素蛋白包被的FITC熒光珠粒(Kisker)檢 測(cè)結(jié)合的抗體。珠粒尺寸為0.8 μ m。此外，將生物素化的抗體B18-4. 3偶聯(lián)至鏈霉抗生物 素蛋白包被的FITC熒光珠粒，將復(fù)合物施用到毛發(fā)樣品，以分析結(jié)合(圖4a)。
實(shí)驗(yàn)顯示，即使在60°C下，用含有300mM KBr的Tris-緩沖液(pH 8. 8)將毛發(fā)洗 滌預(yù)處理，加載于Iym偶聯(lián)了中性抗生物素蛋白的熒光球(fluosphere) (Invitrogen)上 的生物素化的B18-4. 3仍然顯示出對(duì)比格犬毛發(fā)的高度結(jié)合。這表明了毛發(fā)表面上抗原的 高度穩(wěn)定性(圖4b)。在2 μ m珠粒的情況下，這種效應(yīng)較不顯著，這可能表明加入的珠粒被毛發(fā)表面上 存在的幾種抗體結(jié)合。重要的是，用ΙΟμπι珠粒進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)是陰性的。由于在洗滌程序過(guò) 程中損失珠粒，所以沒(méi)有觀察到染色。通過(guò)共焦顯微鏡進(jìn)行的毛發(fā)樣品分析表明，抗體主要與毛發(fā)薄片的邊緣結(jié)合(圖 5)?？贵w結(jié)合位點(diǎn)的鑒定表1中顯示的結(jié)果表明，通過(guò)使用溫和去污劑洗滌毛發(fā)樣品可以去除至少一部分 表面抗原?？乖Y(jié)構(gòu)的去除導(dǎo)致抗體結(jié)合減少。但是，仍然可以檢測(cè)到抗體結(jié)合，這證明相 當(dāng)大部分的抗原保持與毛發(fā)表面連接。用含有300mM KBr的Tris-緩沖液(pH 8. 8)洗滌西高地梗犬的毛發(fā)并將此洗滌級(jí) 分濃縮時(shí)，結(jié)果得到富集毛發(fā)表面蛋白(eHSP)的制劑。使用兩種抗體B7. 3或B18-4. 3中的 任一種，通過(guò)SDS-PAGE和免疫印跡對(duì)這些eHSP進(jìn)行分析。結(jié)果顯示B7. 3與大小為32KDa 和38KDa的結(jié)構(gòu)結(jié)合，而B(niǎo)18-4. 3在21KDa、28KDa和40KDa處檢測(cè)三條帶(圖6)。因此，兩 種抗體具有不同的特異性?？勺兛贵w鏈的克隆為了得到單克隆抗體的遺傳信息，克隆了決定抗體結(jié)合特異性的可變抗體結(jié)構(gòu) 域。進(jìn)行了以下步驟·從雜交瘤克隆中分離RNA·逆轉(zhuǎn)錄為cDNA·通過(guò)PCR從抗體重鏈和輕鏈擴(kuò)增可變區(qū)·使用剪接重疊延伸(SOE) PCR，通過(guò)短的接頭片段將兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域融合·將單鏈抗體(scFv)片段克隆進(jìn)入細(xì)菌載體·轉(zhuǎn)化細(xì)菌·分離質(zhì)粒并測(cè)序通過(guò)測(cè)序證實(shí)scFvB7. 3和scFVB18_4基因的完整性。對(duì)ScFvB18_4測(cè)試其與犬毛發(fā)的結(jié)合。通過(guò)ELISA證明單獨(dú)的scFvB18-4或通過(guò) 生物素_抗生物素蛋白與珠粒偶聯(lián)的scFvB18-4與毛發(fā)樣品的結(jié)合。毛發(fā)特異性抗體B7. 3和B18-4. 3與犬、貓、馬和人毛發(fā)的結(jié)合通過(guò)ELISA將每個(gè)毛發(fā)樣品測(cè)量三次。圖表給出樣品的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。平行地 進(jìn)行兩個(gè)ELISA，每個(gè)圖表是一個(gè)ELISA的結(jié)果。當(dāng)相同的樣品同時(shí)出現(xiàn)在兩個(gè)圖表(西高 地梗犬、歐洲家貓)中時(shí)，使用一個(gè)毛發(fā)樣品吸移入兩個(gè)ELISA板。每孔吸移入Img毛發(fā)。用PBS中的2% (w/v)奶粉進(jìn)行封閉1個(gè)小時(shí)。使用PBS 中的濃度為50ng/ml的B7. 3或B18-4. 3作為一抗，其中每個(gè)孔使用100 μ 1抗體溶液。在 室溫下孵育1個(gè)小時(shí)。二抗是與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠(抗IgG、IgM和IgA)；將抗 體在PBS中進(jìn)行1 5000稀釋，每個(gè)孔使用100 μ 1。在室溫下孵育1個(gè)小時(shí)。最后每個(gè)孔
10以100 μ 1底物ABTS孵育42分鐘。在405nm處讀取所得的顏色反應(yīng)。在各個(gè)步驟之間用 200μ1的PBS-T將板洗滌兩次。作為對(duì)照，將每種毛發(fā)樣品的三個(gè)孔用非特異性小鼠抗體 孵育，其它處理如上所述。對(duì)于相同的毛發(fā)樣品，從以Β7. 3和Β18-4. 3獲得的結(jié)果中減去 每個(gè)對(duì)照的平均值(圖7)。馬毛發(fā)特異件抗體的產(chǎn)牛通過(guò)將小鼠免疫然后使用雜交瘤技術(shù)來(lái)產(chǎn)生馬毛發(fā)特異性抗體。將來(lái)自馬的毛 發(fā)用PBS-T洗滌(1計(jì)83，吐溫20，0.05%)并使用勻漿器切碎。切碎的毛發(fā)長(zhǎng)度大約為 200 μ Hio用洗滌的、切碎的馬毛發(fā)將兩只小鼠免疫。將最多SOyg毛發(fā)樣品(=20yL切 碎的毛發(fā))與40 μ L GERBU佐劑和50 μ L Ix PBS混合，并用于免疫。在7月8日、7月22 日、8月5日、8月18日、8月26日和9月8日將小鼠免疫六次，在9月10日將小鼠殺死。 分離脾細(xì)胞并與骨髓瘤融合，以產(chǎn)生雜交瘤。用如上所述的ELISA方案篩選產(chǎn)生馬毛發(fā)特 異性抗體的多克隆雜交瘤克隆。將Ix PBS中的切碎的馬毛發(fā)包被至低結(jié)合性96孔微量滴 定板上。加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液之后，使用與辣根過(guò)氧化物酶(HPRO)偶聯(lián)的山羊抗小 鼠(GAM) 二抗檢測(cè)特異性抗體的結(jié)合。為了檢測(cè)抗體與毛發(fā)的結(jié)合，使用ABST底物，孵育 30分鐘后在405nm處測(cè)定吸光度。鑒定出總共21個(gè)與毛發(fā)樣品結(jié)合的多克隆雜交瘤克隆 (HF 1-21)。但是，由于包被的是切碎的毛發(fā)，所以選擇與存在于毛發(fā)內(nèi)部的抗原結(jié)合的抗 體和與毛發(fā)表面上的抗原結(jié)合的抗體兩者；培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞，以進(jìn)一步產(chǎn)生單克隆。為了鑒定識(shí)別毛發(fā)表面上的結(jié)構(gòu)的結(jié)合者，使用微量滴定過(guò)濾板ELISA(參見(jiàn)抗 體結(jié)合和功能性，第10頁(yè))測(cè)試來(lái)自單克隆雜交瘤系的抗體。將0.3mg馬、犬、貓和人的毛 發(fā)加入到微量滴定過(guò)濾板上的單獨(dú)的孔中，與每個(gè)待測(cè)試單克隆的100 μ L雜交瘤上清液 平行孵育。如上所述進(jìn)行測(cè)試。通過(guò)使用經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)標(biāo)記的二抗和2，2’_連 氮基-雙3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)反應(yīng)劑(作為HRPO的底物)來(lái)顯現(xiàn)結(jié)合的 抗體。在室溫下孵育30分鐘后在405nm處測(cè)量顯色。可以看到抗體HF 17. 6與馬毛發(fā)的 清晰的特異性結(jié)合(相比于犬、貓和人的毛發(fā))；低信號(hào)可能是由于制劑中抗體較少，因?yàn)?僅在選擇單克隆2天之后就進(jìn)行測(cè)試，存在很少的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。表2:單克隆抗馬毛發(fā)抗體HF 17. 6與四個(gè)不同物種毛發(fā)的結(jié)合。如上所述進(jìn)行 ELISA。評(píng)價(jià)抗體HF17. 6與馬、犬、貓和人的毛發(fā)的結(jié)合。給出的數(shù)值是用ABTS孵育30分 鐘后在405nm處的吸光度(減去背景)。
貓毛發(fā)特異件抗體的產(chǎn)牛 通過(guò)將小鼠免疫然后使用雜交瘤技術(shù)來(lái)產(chǎn)生貓毛發(fā)特異性抗體。使用勻漿器將切自歐洲短毛貓的毛發(fā)切碎。切碎的毛發(fā)長(zhǎng)度大約為200 μ m。用切碎的貓毛發(fā)將兩只小鼠免疫。將最多80 μ g毛發(fā)樣品(=20 μ L切碎的毛發(fā)) 與40 μ L GERBU佐劑和50 μ L Ix PBS混合，并用于免疫。在7月1日、7月15日、7月29 日、8月12日、8月26日和9月1日將小鼠免疫六次，在9月3日將小鼠殺死。分離脾細(xì)胞 并與骨髓瘤融合，以產(chǎn)生雜交瘤。用如上所述的ELISA方案篩選產(chǎn)生貓毛發(fā)特異性抗體的 多克隆雜交瘤克隆。將Ix PBS中的切碎的貓毛發(fā)包被至低結(jié)合性96孔微量滴定板上。加 入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液之后，使用與辣根過(guò)氧化物酶(HPRO)偶聯(lián)的山羊抗小鼠(GAM) 二 抗檢測(cè)特異性抗體的結(jié)合。為了檢測(cè)抗體與毛發(fā)的結(jié)合，使用ABST底物，孵育30分鐘后在 405nm處測(cè)定吸光度。鑒定出總共73個(gè)與毛發(fā)樣品結(jié)合的多克隆雜交瘤克隆(C2 1-73) 0 但是，由于包被的是切碎的毛發(fā)，所以選擇與存在于毛發(fā)內(nèi)部的抗原結(jié)合的抗體，以及與毛 發(fā)表面上的抗原結(jié)合的抗體兩者。為了選擇與貓毛發(fā)特異性結(jié)合的抗體，6天之后在人毛發(fā) 上進(jìn)行相同類型的ELISA。下表中給出的吸光度證明相比于人毛發(fā)，與貓毛發(fā)的優(yōu)異結(jié)合， 這表明在多克隆雜交瘤克隆中產(chǎn)生了貓毛發(fā)特異性抗體。表3 通過(guò)ELISA分析多克隆抗貓毛發(fā)的抗體與貓或人的毛發(fā)的結(jié)合。如上所述 進(jìn)行ELISA。孵育30分鐘后測(cè)定ABTS的吸光度(未減去背景)。Abs =吸光度。
實(shí)施例在下面的部分中，提供了本發(fā)明的有用實(shí)施方式的例子。其證明通過(guò)與犬毛發(fā)選 擇性結(jié)合的抗體附著至犬毛皮的含有藥物的微粒如何能夠在延長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)保護(hù)動(dòng)物抵抗 有害昆蟲(在本例子中為蜱)而沒(méi)有刺激皮膚的副作用。將市售的局部用寄生蟲殺蟲劑制劑施用到動(dòng)物毛發(fā)的一種常見(jiàn)方法是使用所謂 的“點(diǎn)式”制劑，其中將小體積的含有藥物的溶液鋪展(deployed)至動(dòng)物的頸部皮膚上，其 具有經(jīng)常引起對(duì)皮膚的嚴(yán)重刺激的缺點(diǎn)。抗有害昆蟲的保護(hù)時(shí)期受到限制，例如在蜱的情況中通常為4周。其它類型的具有分子分散的殺螨劑的制劑存在同樣的問(wèn)題。顯示當(dāng)抗體與微粒的表面偶聯(lián)時(shí)，保留了抗體的獨(dú)特性質(zhì)——與毛發(fā)發(fā)生物種特 異性結(jié)合。證明抵抗蜱的效力(殺螨劑效力>90%)持續(xù)至少3至4周?？娠@示降至> 70%的效力持續(xù)另外4周，這可能是由顆粒的持續(xù)釋放特性造成的。同樣描述了將抗體與 微粒表面上的官能團(tuán)連接的有用方法和對(duì)動(dòng)物毛皮的合適的施用方法。A)含有藥物的微粒的組成及制備顆粒由聚合物制成。由于它們的尺寸介于1-10 μ m，它們?cè)诿ど喜豢梢?jiàn)。將活性 成分包膠囊(encapsulated)，并通過(guò)擴(kuò)散持續(xù)釋放?？梢酝ㄟ^(guò)顆粒設(shè)計(jì)(聚合物類型、分子 量、添加劑)在寬范圍內(nèi)控制釋放。用連接抗體必需的官能團(tuán)(例如胺或羧基)將顆粒表 面改性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)溶劑蒸發(fā)技術(shù)將顆粒復(fù)合(compounded)。因此，活性成 分(在本實(shí)施例的情況中為擬除蟲菊酯氯苯氟菊酯(3-[2-氯-2-(4-氯苯基)乙烯基]-2， 2-二甲基環(huán)丙烷羧酸氰(4-氟-3-苯氧基苯基)甲酯，CAS Nr. 69770-45-2))和聚合物 (在本例中為聚苯乙烯)溶解于二氯甲烷。將乳化劑(含有與聚苯乙烯相容(混溶)的聚 合物鏈段和用作親水乳化部分(moeity)的羧基基團(tuán)COOH的共聚物)分散在水中。然后在 Ultra Turrax攪拌器的幫助下將油相分散在水中，用Microfluidizer將混合物勻漿。通過(guò) 顯微鏡控制液滴的尺寸?？梢詫H設(shè)定為堿性范圍，以便促進(jìn)乳化。然后將乳液邊攪拌邊 加熱至60°C。在該溫度下蒸發(fā)二氯甲烷。乳液變成懸浮液，其中游離COOH提供親水表面。 可以通過(guò)粒度儀(mastersizer)控制粒度。通過(guò)HPLC分析活性成分的量。在本給定實(shí)施 例的情況下，固體聚苯乙烯微粒中氯苯氟菊酯的含量為18%m/m。將這種微粒的制劑編號(hào) 定為 7c_6+7_EE。用相同的方式制備加載有熒光染料(在本例中為Uvitex(2，5噻吩二基 (thiophenediyl)雙(5-叔丁基-1，3 苯并噁唑)，CAS No. 7128-64-5，435nm)的微粒。用 染料替換活性成分。這些顆粒的功能是使抗體介導(dǎo)的微粒與毛皮的結(jié)合顯現(xiàn)，因?yàn)榭梢匀?易地用熒光顯微鏡將它們檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)浸泡方法加載微粒。向IOml的15%聚苯乙烯微粒分散 體(用表面COOH基團(tuán)改性)中加入2.4ml含有適量氯苯氟菊酯的二氯甲烷相。然后在環(huán) 境室溫下振蕩24小時(shí)。然后在減壓(150-50mbar)下蒸發(fā)溶劑二氯甲烷。將分散體反復(fù)離 心，并用乙醇/水混合物洗滌沉淀，以去除未包膠囊的和表面結(jié)合的氯苯氟菊酯。重新離心 后，將沉淀重新分散于水中并凍干。編號(hào)為BU 163的微粒中含有9% m/m的藥物。B)抗體與微粒表面的連接通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)毛發(fā)特異性抗體與藥物遞送顆粒的偶聯(lián)通過(guò)加入特定量的N-乙基-N’ -(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC ；2mM)將羧 酸根改性顆粒(carboxylate modified particles)活化。然后通過(guò)加入N-羥基琥珀酰亞 胺(NHS;5mM)使活化形式穩(wěn)定。該活化的酯復(fù)合物與來(lái)自抗體的伯胺和仲胺反應(yīng)，從而在 顆粒和抗體之間形成共價(jià)酰胺鍵合。在微粒類型7c_6+7_EE的情況下，將80ml 2. 18%m/V 溶液與29ml抗體溶液混合，所述抗體溶液中含有69. 6mg抗體混合物(B7. 3/B18-4. 3的比 率=1 1)。用相似的方式使BU 163具備抗體。該方法描述于文獻(xiàn)中(Hermanson, G. T. :Bioconjugate techniques. Academic
13press, San Diego, 1996) 0通過(guò)活性成分的光譜檢測(cè)給出具備抗體的微粒與犬毛皮特異性結(jié)合的證據(jù)。將多 孔板部分填充等量(mg)的犬和人的毛發(fā)。孔的底部是孔徑為30-40 μ m的過(guò)濾器。然后在 那些含有毛發(fā)的孔中填充含有攜帶抗體的微粒7c_6+7_EE的懸浮液。然后將多孔板離心， 以便通過(guò)將上清分散體壓迫通過(guò)30-40 μ m孔而去除液體和所有未結(jié)合的顆粒。未與毛發(fā) 結(jié)合的顆粒因?yàn)榱６葍H為1-10 μ m而通過(guò)過(guò)濾器。結(jié)合于毛發(fā)上的顆粒保持附著在孔內(nèi)的 毛發(fā)上。用含有0.05%吐溫20的緩沖液將毛發(fā)洗滌5次。每次洗滌之后，通過(guò)離心再次去 除緩沖液。在這之后，向孔中加入乙腈(其溶解藥物，但不溶解毛發(fā)或多孔板的材料)。乙 腈將所有包膠囊的藥物從微顆粒中提取出來(lái)。先前通過(guò)HPLC證明了活性成分的定量去除。 然后將孔底沒(méi)有洞的透明多孔板置于含有毛發(fā)的多孔板下面。其由僅顯示很少UV吸光度 的聚合物制成。將乙腈離心進(jìn)入透明多孔板的孔中?？梢酝ㄟ^(guò)268nm處的UV光檢測(cè)乙腈 溶液中的活性成分。校準(zhǔn)后，UV讀數(shù)器能夠檢測(cè)存在于孔中的藥物的量，因此間接證明微 粒附著于犬或人的毛發(fā)。與毛發(fā)連接的微粒越多，UV信號(hào)越強(qiáng)。這個(gè)相關(guān)性是線性依賴的 (圖 8)。圖(圖8)證明相當(dāng)大量的具備抗體的微粒與犬毛發(fā)結(jié)合。犬毛發(fā)取自幾個(gè)不同 品種(德國(guó)牧羊犬、柯利牧羊犬、梗犬(terrier)、狐貍?cè)?spitz)、雪納瑞-拉布拉多犬混 種、柯利，n = 3)。相反，只有少量的微粒與人毛發(fā)結(jié)合(三位不同女性，未處理的未染色的 頭發(fā)，η = 3)，這證明當(dāng)抗體與微粒表面結(jié)合時(shí)，保持了抗體的活性毛發(fā)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的物種 選擇性。還證明抗體與動(dòng)物毛發(fā)的結(jié)合強(qiáng)度足夠強(qiáng)，以經(jīng)受至少5次緩沖液洗滌循環(huán)。儀器=ELISASynergy HT, BioTek ；顯微鏡Biozero BZ-8100E，KeyenceC)作為噴霧制劑，對(duì)動(dòng)物毛皮施用在制劑的一個(gè)有用實(shí)施方式中，將具備抗體的含有藥物的微粒作為噴霧制劑對(duì)動(dòng) 物毛皮施用。在給出的實(shí)施例中，對(duì)犬施用6mg包膠囊的氯苯氟菊酯/kg體重。比格犬平均重量 為11kg。由于微粒中藥物濃度為18% m/m，因此對(duì)動(dòng)物施用367mg具備抗體的微粒7c_6+7_ EE (含有66mg氯苯氟菊酯)。取決于顆粒的活性成分濃度和所需的藥物量，這個(gè)數(shù)值將變 化。對(duì)于顆粒BU 163來(lái)說(shuō)，使用733mg，因?yàn)樗幬锖繛?% m/m。將IOOmg熒光顆粒和計(jì) 算量的載有藥物的微粒分散于適量的水中。在本實(shí)施例情況中，使用30ml水。加入少量表 面活性劑(在本實(shí)施例中為0.01%吐溫20)，以促進(jìn)制劑在有時(shí)油膩(fatty)的犬毛發(fā)上 鋪展。將該分散體填充入配備泵式噴霧器頭的普通瓶子中，所述噴霧器頭適合于噴灑顆粒 懸浮液而不阻塞閥門，并且是現(xiàn)成的(ready to use)。在犬毛皮上到處均勻噴灑分散體，允許微粒均勻分布至犬毛發(fā)上。E)體內(nèi)研究抵抗犬上的蜱(褐犬蜱(Rhipicephalus sanRuineus))的功效本研究的目標(biāo)是評(píng)價(jià)兩種不同的噴霧制劑(含有通過(guò)抗體與犬毛皮結(jié)合的載有 氯苯氟菊酯的微粒)對(duì)經(jīng)褐犬蜱(Rhipicephalus sanguineus)實(shí)驗(yàn)性侵?jǐn)_的犬的抗蜱功 效(表4)。本研究中使用9只犬，每組三只犬，共三組。在整個(gè)研究時(shí)期，將每只犬圈養(yǎng)于單 獨(dú)的籠子中。
在研究日(SD)-1，肌內(nèi)注射大約0. lml/kg BW鹽酸氯胺酮 (Ketaminhydrochlorid) (Ketamin 10 % )與大約 0. lml/kg BW 鹽酸賽拉嗪 (Xylazinhydrochlorid) (Xylazin 2% )的組合，使所有的犬鎮(zhèn)靜。在鎮(zhèn)靜過(guò)程中所有犬 以胸骨或側(cè)面斜躺在地板上，將50只褐犬蜱(Rhipic印halussanguineus) (25早，25 $ )釋 放到犬的背上。犬睡覺(jué)1至1. 5小時(shí)，從而防止在蜱能夠附著之前將其除掉。在SD 0，通過(guò)對(duì)全身表面的充分adspection/觸診來(lái)測(cè)定蜱侵?jǐn)_率(但不去除 蜱)頭、耳、頸、側(cè)區(qū)(lateral areas)、肩胛骨至尾基(base of tail)的背部長(zhǎng)條(dorsal strip)、尾和肛門區(qū)域、前腿和肩部、后腿、胸至后腿內(nèi)側(cè)的腹部區(qū)域、腳。對(duì)所有活的附著 的雌性蜱進(jìn)行計(jì)數(shù)，基于蜱的數(shù)目，將犬隨機(jī)分配為三個(gè)研究組。蜱計(jì)數(shù)后第O天進(jìn)行處理。對(duì)照組的犬不進(jìn)行處理，用作陰性對(duì)照組。對(duì)兩個(gè)處 理組的犬劑量給予IVP (Investigational Veterinary Product) —次。每個(gè)IVP體積為 30ml，含有66mg的氯苯氟菊酯作為活性成分。與體重?zé)o關(guān)，每只犬均接受總共30ml的量。 在犬站立條件下，將IVP均勻噴灑至每只犬的全身。表4 用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的微顆粒制劑綜述以及關(guān)于劑量的信息 n. a.不適用在進(jìn)行處理的當(dāng)天(研究日SD 0)，在處理之后2小時(shí)和4小時(shí)觀察犬的不良事 件(adverse events) 0所有的犬均對(duì)處理良好耐受。在SD 2，按照與SD O相同的方式對(duì) 蜱進(jìn)行計(jì)數(shù)，但是將蜱去除。將蜱鑒定為自由的或附著的、充血的(engorged)或非充血的 (unengorged)、活的或死的蜱。在有規(guī)律的間隔內(nèi)，以相同的方式對(duì)每只犬進(jìn)行重新侵?jǐn)_， 48小時(shí)后按所述方式進(jìn)行蜱的計(jì)數(shù)。所選的間隔為處理后1、3、7和9個(gè)周，例如在SD 5、 20、48、和61進(jìn)行蜱的侵?jǐn)_，兩天之后在SD 7,22,50和63進(jìn)行蜱的計(jì)數(shù)。除了每個(gè)蜱計(jì)數(shù)日(侵?jǐn)_后48小時(shí))之外，以有規(guī)律的間隔獲取每只犬的IOOmg 毛發(fā)。從犬的全身獲取毛皮樣品肩、背、從尾部開(kāi)始處、臀部，并通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行調(diào)查。 在施用制劑之后第2、7、14、42和63天獲取毛發(fā)樣品。在蜱計(jì)數(shù)程序的過(guò)程中對(duì)所有的犬進(jìn)行詳細(xì)的一般健康情況觀察。特別注意皮膚 刺激。在整個(gè)研究過(guò)程中沒(méi)有觀察到由于處理導(dǎo)致的皮膚刺激。蜱計(jì)數(shù)用于評(píng)價(jià)IVP的功效。用按照指南EMEA/CVMP/005/00-Final中描述的推 薦用于控制測(cè)試的修改的Abbott公式來(lái)計(jì)算百分比功效 Nl =用IVP處理的組的幾何平均蜱計(jì)數(shù)
N2 =對(duì)照組的幾何平均蜱計(jì)數(shù)“蜱計(jì)數(shù)”定義為“代表處理失敗的蜱”。在測(cè)定治療功效的情況下(SD 2)，只有活 蜱被認(rèn)為是處理失敗，而在測(cè)定預(yù)防功效的情況下(其余所有的計(jì)數(shù)時(shí)間點(diǎn))，活蜱和死的 充血的蜱被認(rèn)為是處理失敗。如果在處理和每周重新侵?jǐn)_48小時(shí)之后功效達(dá)到> 90%，則認(rèn)為活性成分是高 度有效的。應(yīng)該經(jīng)3-4周時(shí)期給出功效。表5 計(jì)算的功效] 實(shí)現(xiàn)了在3-4周時(shí)期中顯示超過(guò)90%的功效的最低目標(biāo)(表5)。鑒于顆粒中氯 苯氟菊酯的高濃度，這種施用形式顯然保護(hù)動(dòng)物免受皮膚刺激。處理后(post treatment) 50天以后，降低的功效仍然是顯著的。彡50天的研究 期以后從微粒釋放的氯苯氟菊酯可能不足以在動(dòng)物皮膚上保持活性水平的氯苯氟菊酯。試 驗(yàn)的最初幾周期間的更好保護(hù)可能是由于某一部分的游離氯苯氟菊酯和早期來(lái)自顆粒的 較高擴(kuò)散率(由于基質(zhì)內(nèi)高濃度的氯苯氟菊酯)造成的。通過(guò)熒光成像，可以檢測(cè)持久附著于犬毛皮的微粒?？娠@示，微粒通過(guò)抗體結(jié)合在 整個(gè)實(shí)驗(yàn)期中保持附著于毛發(fā)(圖9至13)。注意，熒光染料標(biāo)記的顆粒僅用作指示劑，其 僅代表制劑中微?？倲?shù)目的20%。隨著時(shí)間推移，能夠檢測(cè)到的顆粒減少，部分原因是它們 掉落下來(lái)，部分原因是熒光染料由于持續(xù)暴露于陽(yáng)光而被漂白。F)得自實(shí)施例的結(jié)論所描述的實(shí)施例證明了本發(fā)明的一個(gè)非常有用的實(shí)施方式適合于長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)控制 藥物釋放的含有藥物的微粒裝置，其中抗體與動(dòng)物毛發(fā)(在本例中為犬的毛發(fā))特異性結(jié) 合。本發(fā)明的此項(xiàng)應(yīng)用有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)——其允許將寄生蟲殺蟲劑靶向特定的哺乳動(dòng)物物種，因此當(dāng)施用制劑時(shí)或者當(dāng) 不同的物種相互作用時(shí)(例如玩耍或舔)，顯著降低交叉施用或藥物轉(zhuǎn)移至例如人或其它 哺乳動(dòng)物物種的危險(xiǎn)?！湓试S將藥物引導(dǎo)至動(dòng)物毛皮，因此避免與皮膚大量接觸，這降低了皮膚刺 激或嚴(yán)重皮膚損傷的可能性?！獙我晃锓N特異性抗體通過(guò)C00H、NH2或其它基團(tuán)與不同微粒表面連接并將 微粒鋪展至毛皮，該一般性原則允許為單一制劑選擇各種不同的微粒類型(包含具有不同 釋放概況的不同藥物的不同聚合物)。其允許在分散體中組合不同類型的微粒，因此將在其 它形式上可能化學(xué)不相容的藥物組合在單一制劑中?！线m微粒與適當(dāng)藥物釋放概況的使用允許將藥物功效延長(zhǎng)至幾周或幾個(gè)月 (取決于顆粒和藥物類型)，因此提供了將常見(jiàn)的局部施用液體殺蟲劑和其它藥物制劑的 功效期顯著延長(zhǎng)的可能性。
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——微粒附著于動(dòng)物毛發(fā)的強(qiáng)度足以克服與水的充分接觸甚至是溫和洗滌，例如 當(dāng)動(dòng)物在下雨天氣下閑逛或在池塘中游泳一段時(shí)間。在這種情況下，常規(guī)制劑通常需要重 新施用。
權(quán)利要求
與動(dòng)物的毛發(fā)表面選擇性結(jié)合的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其選自多克隆抗體、單克隆抗體或重組抗體，例如全 長(zhǎng)抗體、二聚體分泌性IgA、多聚體IgM及其片段，例如F (ab’)2片段、Fab片段、Fv片段、 單鏈Fv抗體(scFv)、雙特異性scFv、雙抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)、 minobody或分子識(shí)別單元(MRU)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體，其源自雜交瘤細(xì)胞；合成的、半合成的、原態(tài)的和免疫 活性的噬菌體庫(kù)或核糖體展示庫(kù)，或通過(guò)產(chǎn)生全合成設(shè)計(jì)抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗體，其與一種動(dòng)物物種的毛發(fā)選擇性結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗體，其與犬、貓、牛、綿羊、山羊、駱駝、羊駝和/ 或馬的毛發(fā)選擇性結(jié)合。
6.藥物遞送系統(tǒng)，其包含權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的抗體。
7.藥物遞送系統(tǒng)，其包含權(quán)利要求1-6所述的抗體，所述抗體另外結(jié)合或附著于固體 顆粒的表面，因此使這些顆粒與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物遞送系統(tǒng)，其按如下方式包含與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合的 抗體的制劑和含有活性成分的顆粒在第一步中抗體與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合，在第二步中 顆粒與偶聯(lián)于動(dòng)物毛發(fā)的抗體結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物遞送系統(tǒng)，其按如下方式包含與合適的間隔體/介質(zhì)/ 中間偶聯(lián)劑連接或化學(xué)結(jié)合的動(dòng)物毛發(fā)結(jié)合性抗體的制劑和顆粒在第一步中攜帶抗體的 間隔體/介質(zhì)/偶聯(lián)劑通過(guò)所述抗體與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合，在第二步中顆粒通過(guò)與所述 間隔體/介質(zhì)/偶聯(lián)劑結(jié)合而連接于動(dòng)物毛發(fā)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的藥物遞送系統(tǒng)，其中顆粒含有以下物質(zhì)對(duì)動(dòng)物 有益的活性成分或藥劑，即藥物；殺蟲劑；毛發(fā)或皮膚護(hù)理劑；保護(hù)經(jīng)處理的動(dòng)物免受有害 害蟲動(dòng)物例如昆蟲侵襲的驅(qū)除劑；氣味改變劑；或改變經(jīng)處理的動(dòng)物或其它未經(jīng)處理的但 與施加處理的動(dòng)物相互作用的個(gè)體動(dòng)物的行為的藥劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求4-10中任一項(xiàng)所述的藥物遞送系統(tǒng)，其中顆粒含有對(duì)動(dòng)物有益的活 性成分或藥劑，其濃度適合于它的治療或有益目的，即0. 01% -99. 9%。
12.根據(jù)權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)所述的藥物遞送系統(tǒng)，其中顆粒的直徑為0.001 μ m至 10 μ m, itizfe^J 0. 1 μ m 2 μ m。
13.權(quán)利要求4-12中任一項(xiàng)所述的藥物遞送系統(tǒng)，其中微粒含有擬除蟲菊酯類型的藥 物，將所述顆粒施用于動(dòng)物毛皮并且經(jīng)延長(zhǎng)的時(shí)期遞送擬除蟲菊酯而不引起副作用，即皮 膚刺激。
全文摘要
本發(fā)明提供了與動(dòng)物毛發(fā)選擇性結(jié)合的抗體和其中可將特定制劑引導(dǎo)至動(dòng)物毛發(fā)的基于抗體的藥物遞送系統(tǒng)。這是由以下需求驅(qū)動(dòng)的增加動(dòng)物的外寄生物治療的有效治療時(shí)期、降低這些藥物的毒性并改進(jìn)其釋放概況。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101910198SQ200880124208
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2008年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者H·欣克爾, H-J·哈曼, R·費(fèi)希爾, S·O·沃格爾, S·希爾伯格, S·霍夫曼 申請(qǐng)人:拜耳先靈制藥股份公司