專利名稱：：一種腔上囊活性多肽提取物、其提取方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)是一種活性多肽及其提取方法和用途。
背景技術(shù)：
：腔上嚢是鳥(niǎo)綱類(lèi)動(dòng)物體液免疫系統(tǒng)B淋巴細(xì)胞分化成熟的中樞器官，位于泄殖腔背側(cè)的嚢狀結(jié)構(gòu)，由于被意大利解剖學(xué)家H.法布里奇烏斯發(fā)現(xiàn)，又稱法氏嚢，是鳥(niǎo)類(lèi)特有的結(jié)構(gòu)。腔上嚢是鳥(niǎo)類(lèi)最早發(fā)生并提供B淋巴細(xì)胞的器官。遷入的淋巴干細(xì)胞在其中向抗體生成細(xì)胞分化，包括由淋巴干細(xì)胞分化為前B淋巴細(xì)胞、進(jìn)而分化出現(xiàn)IgM生成細(xì)胞、再分化出現(xiàn)IgG生成細(xì)胞等，尤其是從IgM生成細(xì)胞向IgG生成細(xì)胞的轉(zhuǎn)化必須依賴腔上嚢的微環(huán)境，一旦腔上嚢淋巴細(xì)胞遷出，外周體液免疫功能建立，腔上嚢切除對(duì)體液免疫反應(yīng)的影響就會(huì)減弱乃至消失；另一方面，腔上嚢連濾泡上皮具有內(nèi)吞功能，并且通過(guò)腔上嚢途徑給予抗原，可以使鳥(niǎo)類(lèi)獲得對(duì)特異抗原的免疫能力，這表明腔上嚢同時(shí)具有外周淋巴器官的功能；此外，腔上嚢還產(chǎn)生促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化為成熟的激素物質(zhì)腔上嚢因子或腔上嚢素。雞腔上嚢是雞的一個(gè)泄殖腔的淋巴樣器官，對(duì)B淋巴細(xì)胞性免疫球蛋白形成的成熟方面起重要作用，有人認(rèn)為在哺乳動(dòng)物胃腸道中豐富的淋巴組織可能具有腔上嚢的同樣功能。雞腔上嚢提供的B淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生抵制微生物(如肺炎球菌、腦膜炎球菌，雙球菌、鏈球菌、淋球菌等)抗體，以防御霉菌、寄生蟲(chóng)，病毒、分支桿菌和癌轉(zhuǎn)移等作用，這一器官伴隨著雞的生長(zhǎng)發(fā)育而增大，到雞成熟后慢慢萎縮變小，可見(jiàn)它直接與雞的免疫功能有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外研究人員利用牛、豬、兔、鴨等動(dòng)物的脾細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、周血淋巴細(xì)胞制備轉(zhuǎn)移因子，起到了特異性及非特異性地增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)免疫功能的作用，也有利用胸腺制備胸腺肽，均收到了滿意的結(jié)果，但是從古到今雞腔上囊都被人們作為廢物丟棄。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種腔上嚢活性多肽提取物。該產(chǎn)品抗病毒活性高，水溶性好，生產(chǎn)成本低。本發(fā)明的另一目的在于提供一種腔上嚢活性多肽提取物的提取方法。本發(fā)明的再一目的在于提供腔上嚢活性多肽提取物在制備增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能、防病抗病和抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的腔上嚢活性多肽提取物從雞腔上嚢中提取，含9個(gè)肽段，分子量小于10000道爾頓。其中優(yōu)選的活性多肽分子量小于6000道爾頓。本發(fā)明所述的腔上嚢活性多肽的提取方法，包括下述步驟雞腔上嚢的采集選取青年期健康雞的腔上嚢；將雞腔上嚢用pH為7~7.5的PBS洗凈，切除外層脂肪及其它雜質(zhì)；將經(jīng)過(guò)上述處理的雞腔上嚢置于勻漿器中，加入生理鹽水勻漿成漿液；將漿液裝于無(wú)菌瓶中，置-17-23€冰箱中冷凍，待完全凍結(jié)后，取出置室溫中融化后，再重新置-17-23。C冰箱中冷凍，然后取出置室溫中融化，反復(fù)凍融；將凍融后的腔上嚢漿液置離心才幾中離心，取上清液，過(guò)濾；在過(guò)濾后得到的物質(zhì)中加入透析用水，再加入分析純的氯化鈉，搖勻，采用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，得雞腔上嚢活性多肽提取物，裝入無(wú)菌的安瓶中。作為本發(fā)明一種優(yōu)選方案，將勻漿液反復(fù)凍融7~12次。作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選方案，將勻漿液反復(fù)凍融10次。作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案，所述離心過(guò)程中離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為30004000rpm。作為本發(fā)明的再一種優(yōu)選方案，在所述抽濾后的物質(zhì)中加入透析用水，再加入0.85%的分析純氯化鈉。對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾時(shí)，可采用截留分子量為10000道爾頓的濾膜進(jìn)行抽濾，實(shí)現(xiàn)對(duì)腔上嚢活性多肽分子量的控制，當(dāng)然，為了進(jìn)一步獲取所需分子量的腔上嚢活性多肽提取物，可選用不同的濾膜進(jìn)行抽濾；進(jìn)行第二次過(guò)濾時(shí)可采用細(xì)胞濾膜進(jìn)行抽濾，將活性多肽提取物進(jìn)一步凈化。本發(fā)明研究人員經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所述的腔上嚢活性多肽提取物對(duì)B淋巴細(xì)胞性免疫球蛋白的形成起重要作用，而且對(duì)T細(xì)胞也有一定的激發(fā)作用，使T細(xì)胞缺損的棵小鼠的細(xì)胞免疫有所增強(qiáng)；具有提高整個(gè)免疫系統(tǒng)的免疫功能，包括細(xì)胞免疫、體液免疫、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞吞噬功能，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，從整體上促使機(jī)體免疫反應(yīng)向有利的方向轉(zhuǎn)化。本發(fā)明所述腔上嚢活性提取物可以經(jīng)過(guò)后處理制成各種劑型，如口服液、注射劑、膠嚢劑等、片劑、干粉針劑等，優(yōu)選為口服液和注射劑。優(yōu)選20ml口服液和5ml注射劑，所述口服液每毫升中含多肽不少于1.8mg，所述注射劑每毫升中含多肽0.9mg。本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成熟穩(wěn)定，通過(guò)凍融、離心、抽濾等手段來(lái)提取雞腔上嚢中存在的具有活性的多肽，活性多肽成分分子量在10000以下，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可用于制備增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能、防病抗病和抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物。具體實(shí)施方式下面將以具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，在此本發(fā)明的示意性實(shí)施例以及說(shuō)明用來(lái)解釋本發(fā)明，但并不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1:本實(shí)施例提供的腔上嚢活性多肽提取物，其提取方法如下所述雞腔上嚢的采集選取青年期健康雞的腔上嚢；將雞腔上嚢用pH為77.5的PBS洗凈，切除外層脂肪及其它雜質(zhì)；將經(jīng)過(guò)上述處理的雞腔上嚢置于勻漿器中，加入生理鹽水勻漿成漿液；將漿液裝于無(wú)菌瓶中，置-17-23。C冰箱中冷凍，待完全凍結(jié)后，取出置室溫中融化后，再重新置-17-23。C冰箱中冷凍，然后取出置室溫中融化，反復(fù)凍融12次；將凍融后的腔上嚢漿液置于離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速為3000rpm,取上清液，采用截留分子量為10000道爾頓的濾膜進(jìn)行抽濾；在過(guò)濾后得到的物質(zhì)中加入透析用水，再加入0.85%分析純的氯化鈉，搖勻，釆用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，得雞腔上嚢活性多肽提取物，裝入無(wú)菌的安瓶中。將上述腔上嚢多肽提取物加注射用水稀釋，無(wú)菌過(guò)濾后裝瓶，制成5ml注射劑，每毫升含多肽0.9mg,滅菌處理。實(shí)施例2:本實(shí)施例提供的腔上嚢活性多肽提取物，其提取方法如下所述雞腔上嚢的采集選^^青年期健康雞的腔上嚢；將雞腔上嚢用pH為77.5的PBS洗凈，切除外層脂肪及其它雜質(zhì)；將經(jīng)過(guò)上述處理的雞腔上嚢置于勻漿器中，加入生理鹽水勻漿成漿液；將漿液裝于無(wú)菌瓶中，置-17-23。C冰箱中冷凍，待完全凍結(jié)后，取出置室溫中融化后，再重新置-17-23。C冰箱中冷凍，然后取出置室溫中融化，反復(fù)凍融7次；將凍融后的腔上嚢漿液置于離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速為4000rpm,取上清液，采用截留分子量為6000道爾頓的濾膜進(jìn)行抽濾；在過(guò)濾后得到的物質(zhì)中加入透析用水，再加入0.85%分析純的氯化鈉，搖勻，采用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，得雞腔上囊活性多肽提取物，裝入無(wú)菌的安瓶中。將上述腔上嚢多肽提取物按公知的方法將加入注射用水，過(guò)濾，再加入其他輔料，稀釋、冷藏、過(guò)濾、灌裝、滅菌，既得50ml口服液，每毫升中含多肽提取物1.8mg。實(shí)施例3:本實(shí)施例提供的腔上嚢活性多肽提取物，其提取方法如下所述雞腔上嚢的采集選取青年期健康雞的腔上嚢；將雞腔上嚢用pH為7~7.5的PBS洗凈，切除外層脂肪及其它雜質(zhì)；將經(jīng)過(guò)上述處理的雞腔上囊置于勻漿器中，加入生理鹽水勾漿成漿液；將漿液裝于無(wú)菌瓶中，置-17-23。C冰箱中冷凍，待完全凍結(jié)后，取出置室溫中融化后，再重新置-17-23。C水箱中冷凍，然后取出置室溫中融化，反復(fù)凍融10次；將凍融后的腔上嚢漿液置于離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速為3500rpm，取上清液，采用截留分子量為10000道爾頓的濾膜進(jìn)行抽濾；在過(guò)濾后得到的物質(zhì)中加入透析用水，再加入0.85%分析純的氯化鈉，搖勻，采用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，得雞腔上囊活性多肽拔Jf又物，裝入無(wú)菌的安^f瓦中。將上述腔上嚢多肽提取物按公知的方法將加入注射用水，過(guò)濾，再加入其他輔料，稀釋、冷藏、過(guò)濾、灌裝、滅菌，既得50ml口服液，每毫升中含多肽才是耳又物2.4mg。實(shí)驗(yàn)例1:本實(shí)驗(yàn)為雞腔上嚢活性多肽提取物對(duì)載人宮頸癌棵鼠模型的抑癌作用研咒。1、材料雞腔上嚢活性多肽提取物3mg/ml.,含九個(gè)肽段，分子量均小于10000道爾頓；Hela細(xì)胞；T細(xì)胞缺損BALB/c棵小鼠8只，15g左右，SPP級(jí)，湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；無(wú)菌生理鹽水。2、方法2.1:將棵小鼠分成A、B兩組，A組為抑制腫瘤形成實(shí)驗(yàn)組，B組為抑制肺瘤生長(zhǎng)實(shí)-險(xiǎn)組，A、B兩組又分為AI、A2、Bl、B2四個(gè)小組，兩組均為2只。2.2:接種瘤細(xì)胞各組棵小鼠在其背部皮下接種人宮頸癌傳代細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)0.2mL,含細(xì)胞數(shù)0.2xl09個(gè)。2.3:Al在接種Hela細(xì)胞后經(jīng)腹腔推注腔上嚢活性多肽提取物(0.5mL/只)，A2推注生理鹽水(0.5mL/只)，然后每隔兩天各推注一次，觀察成瘤時(shí)間，并用游標(biāo)卡尺量出腫瘤的大小(長(zhǎng)寬)，結(jié)果見(jiàn)表l。2.4:B組棵小鼠在腫瘤形成初期(約l-1.5mm)時(shí)再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Bl組小鼠腹腔推注腔上嚢活性多肽提取物(0.5mL/只)，B2組小鼠推注無(wú)菌生理鹽水(0.5mL/只)，然后每隔兩天各推注一次。待B2小鼠死亡時(shí)，將BI小鼠處死，分別取出各鼠所載肺瘤，稱出各腫瘤的重量。根據(jù)載瘤時(shí)間(天數(shù))，計(jì)算其生長(zhǎng)速度，結(jié)果見(jiàn)表2。3、結(jié)果表1:表示A組棵小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況；表2:表述B組棵小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>細(xì)胞缺損的棵小鼠，其細(xì)胞免疫的功能低下或缺損。如果要提高其細(xì)胞免疫的功能，以期達(dá)到對(duì)接種腫瘤的抑制作用，根據(jù)資料報(bào)道應(yīng)該采用由其它動(dòng)物的脾臟、胸腺制備的轉(zhuǎn)移因子加以介導(dǎo)，而我們應(yīng)用的是由產(chǎn)生體液免疫的腔上嚢B細(xì)胞所制備的多肽，利用所述多肽對(duì)供試棵鼠的免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，提高機(jī)體的免疫功能，包括細(xì)胞免疫、體液免疫、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞吞噬功能，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。這一點(diǎn)說(shuō)明了提高機(jī)體整體免疫功能對(duì)惡性腫瘤的治療是至關(guān)重要的。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也進(jìn)一步證明了近代免疫學(xué)對(duì)控制肺瘤的免疫反應(yīng)機(jī)制的研究，這一研究指出機(jī)體識(shí)別肺瘤細(xì)胞為一異物，在這種情況下，即出現(xiàn)免疫反應(yīng)來(lái)控制惡變細(xì)胞的生長(zhǎng)與擴(kuò)散。只有當(dāng)免疫反應(yīng)有某些程度的缺損的情況下，癌才能擴(kuò)散到整個(gè)機(jī)體。通過(guò)應(yīng)用某些增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的物質(zhì)，可以加強(qiáng)機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)來(lái)控制惡變細(xì)胞的生長(zhǎng)與擴(kuò)散，使機(jī)體免疫反應(yīng)與惡變細(xì)胞之間的平衡向有利的方向轉(zhuǎn)化。據(jù)此，我們認(rèn)為腔上嚢活性多肽來(lái)源于雞的淋巴樣器官，雖然對(duì)B淋巴細(xì)胞性免疫球蛋白的形成起重要作用，而且對(duì)T細(xì)胞也有一定的激發(fā)作用，使T細(xì)胞缺損的棵小鼠的細(xì)胞免疫有所增強(qiáng)。對(duì)腫瘤的抑制作用，應(yīng)該是細(xì)胞免疫、體液免疫和巨噬細(xì)胞吞噬等協(xié)同作用，從整體上促使機(jī)體免疫反應(yīng)向有利的方向轉(zhuǎn)化。這再一次證明腔上嚢活性多肽提取物是具有這種功效的物質(zhì)，因此其應(yīng)用價(jià)值是十分明顯的。實(shí)-瞼例2:1、材料雞腔上嚢多肽提取物(3mg/mL);K.M小鼠，棵小鼠(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)；HeLa傳代細(xì)胞；大腸桿菌括毒菌(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；大腸桿菌疫苗(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；2,4—二硝基氟苯；印度墨汁；免抗鼠lgG酶標(biāo)記物。2、方法一、攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)1:取K,M小鼠30只(20g左右，雌性)分為二個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組，每組10只。2:第一實(shí)驗(yàn)組各鼠皮下推注腔上嚢活性多肽提取物0.5mL(3mg/mL)，同時(shí)用大腸桿菌活毒菌攻毒(皮下推注0.5ml,—個(gè)致死量)。3:第二實(shí)驗(yàn)組各鼠每二天皮下推注腔上嚢活性多肽提取物0.5mL，第三次推注后立即攻毒，攻毒方法同第一組。4:對(duì)照組各鼠皮下推注0.5mL生理鹽水，立即攻毒，攻毒方法同實(shí)-瞼組。每小時(shí)觀察供試小鼠的情況，記錄死亡的時(shí)間及數(shù)量。二、抗大腸桿菌抗體效〗介測(cè)定1:取K,M小鼠20只，分成二組，每組10只，第一組各鼠腹腔推注腔上嚢活性多肽提取物0.5mL(3mg/mL)，大腸桿菌疫苗0.5mL,然后每隔3天推注腔上嚢活性多肽提取物0.5mL，推注三次后再用大腸桿菌疫苗加強(qiáng)免疫一次。2:第二組各鼠單純用大腸桿菌疫苗免疫，方法同第一組。3:第二次免疫后十天，取各組小鼠的血測(cè)抗體效價(jià)(采用ELISA方法，包尋皮抗原系大腸桿菌培養(yǎng)液上清，1:50稀釋)。三、免疫調(diào)節(jié)功能的檢測(cè)取K.M小鼠60只(20g左右，雄性)，分成Z個(gè)組，每組30只，第一組為實(shí)驗(yàn)組，每隔一天腹腔推拄腔上嚢活性多肽提取物0.5mL/只，共15次。第二組為生理鹽水對(duì)照組。推注結(jié)束后，進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)作用的檢測(cè)。檢測(cè)內(nèi)容①2,4—二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠DTH(耳腫脹法)，②血清溶血素測(cè)定，③碳廓清試-驗(yàn)。3、結(jié)果表l為攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；表2為抗大大腸桿菌效價(jià)的測(cè)定結(jié)果；表3為2，4一二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠DTH(耳腫脹法)測(cè)定結(jié)果;表4為血清溶血素測(cè)定結(jié)果；表5為碳廓清試驗(yàn)結(jié)果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>將差值進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)，計(jì)算得F48.74,查表F0.01(1.18)=8.29，本例F>F0.01(1.18),故PO.Ol，有顯著差異性。表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>將抗體積數(shù)進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)，F(xiàn)二98.37,查表F0.01(1.18)=8.29,本例F>F0.01(1.18)，故PO.Ol,有顯著差異性。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>高機(jī)體的免疫功能是整個(gè)免疫系統(tǒng)。以上對(duì)本發(fā)明實(shí)施例所提供的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了明只適用于幫助理解本發(fā)明實(shí)施例的原理；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，在具體實(shí)施方式以及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說(shuō)明書(shū)內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。權(quán)利要求1、一種腔上囊活性多肽提取物，其特征在于所述活性多肽提取物從雞腔上囊中提取，含9個(gè)肽段，分子量小于10000道爾頓。2、如權(quán)利要求1所述的腔上嚢活性多肽提取物，其特征在于所述活性多肽分子量小于6000道爾頓。3、一種提取權(quán)利要求1所述的腔上嚢活性多肽的提取方法，其特征在于所述方法包括下述步驟雞腔上嚢的采集選取青年期健康雞的腔上嚢；將雞腔上嚢用pH為77.5的PBS洗凈，切除外層脂肪及其它雜質(zhì)；將經(jīng)過(guò)上述處理的雞腔上囊置于勻漿器中，加入生理鹽水勻漿成漿液；將漿液裝于無(wú)菌瓶中，置-17-23。C冰箱中冷凍，待完全凍結(jié)后，取出置室溫中融化后，再重新置-17-23。C冰箱中冷凍，然后取出置室溫中融化，反復(fù)凍融；將凍融后的腔上嚢漿液置離心機(jī)中離心，取上清液，過(guò)濾；在過(guò)濾后得到的物質(zhì)中加入透析用水，再加入分析純的氯化鈉，搖勻，采用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，得雞腔上嚢活性多肽提取物，裝入無(wú)菌的安瓶中。4、如權(quán)利要求3所述的腔上嚢活性多肽的提取方法，其特征在于將勻漿液反復(fù)凍融7~12次。5、如權(quán)利要求3或4所述的腔上嚢活性多肽的提取方法，其特征在于所述離心過(guò)程中離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為30004000rpm。6、如權(quán)利要求5所述的腔上嚢活性多肽的提取方法，其特征在于在所述抽濾后的物質(zhì)中加入透析用水，再加入0.85%的分析純氯化鈉。7、腔上嚢活性多肽提取物在制備增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能、防病抗病和抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，公開(kāi)了一種腔上囊活性多肽提取物、其提取方法及其用途。本發(fā)明所述的腔上囊活性多肽提取物含9個(gè)肽段，分子量小于10000道爾頓。所述的提取方法時(shí)將雞腔上囊經(jīng)勻漿、凍融、過(guò)濾從而制得腔上囊活性多肽提取物。本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成熟穩(wěn)定，通過(guò)凍融、離心、抽濾等手段來(lái)提取雞腔上囊中存在的具有活性的多肽，活性多肽成分分子量在10000以下，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可用于制備增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能、防病抗病和抑制腫瘤生長(zhǎng)藥物。文檔編號(hào)C07K2/00GK101445549SQ20081022029公開(kāi)日2009年6月3日申請(qǐng)日期2008年12月23日優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日發(fā)明者何運(yùn)平,喬林申請(qǐng)人:孝感天運(yùn)塑料包裝有限公司