專利名稱：：苯丙素類衍生物,其制備方法和以該化合物為活性成分的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新穎的苯丙素類衍生物，其制備方法，以該化合物為活性成分的藥物組合物，以及它們在治療乳腺癌、鼻咽癌、宮頸癌、HepG-2肝癌和A54肺癌中的應(yīng)用。技術(shù)背景桔梗科植物黨參為常用中藥，味甘，性平，歸脾，肺經(jīng)。有補(bǔ)中益氣、健脾益肺、止渴生津之功效。用于治療脾肺虛弱、脾胃虛弱、肺氣不足、氣短心悸、食少便溏、虛喘咳嗽、內(nèi)熱消渴、體乏無力等病癥，并常作為人參的替代品。2005版《中國藥典》一部收載了黨參C。c/。/7。p67'sAz7os7v7a(Franch.)Nannf.、素花黨參6bofcv。p57'51jWas"JaNannf.var.modesta或川黨參Cbob/70A^'5ta"g5^e/7Oliv.3禾中。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，黨參中主要有三萜、甾類、聚乙炔醇、酚酸、木脂素、倍半萜、黃酮、黨參苷I-IV等多種化學(xué)成分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一類新的具有藥用價(jià)值的苯丙素類衍生物。本發(fā)明的另一目的是提供一種從黨參類植物中提取本發(fā)明化合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種治療乳腺癌、鼻咽癌、宮頸癌、HepG-2肝癌和A54肺癌的藥物組合物。本發(fā)明的另一目的是提供上述化合物和組合物在制備治療乳腺癌、鼻咽癌、宮頸癌、HepG-2肝癌和A54肺癌的藥物方面的用途。發(fā)明人由黨參類植物中分離出一種新的苯丙素類衍生物，該衍生物具有多種有價(jià)值的藥物活性，這些活性是現(xiàn)有黨參類植物所不具備的。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明新的苯丙素類衍生物用下述通式(I)表示R=H(I)其中R表示氫。本發(fā)明中另一新的苯丙素類衍生物用下述通式(II)表示:OOH(II)本發(fā)明的另一目的，即上述通式(I)中R為氫的本發(fā)明化合物的制備方法是由黨參類植物中提取而得到的，該方法包括以下步驟a.將黨參類植物用乙醇回流提取1次以上b.濃縮乙醇提取液成浸膏后用硅藻土吸附干燥；C.然后依次用石油醚、乙酸乙酯、甲醇進(jìn)行抽提；d.將甲醇抽提物濃縮后通過D101大孔樹脂；e.用濃度為30%的乙醇溶液對樹脂進(jìn)行洗脫至洗脫液為無色，收集洗脫物；f.將洗脫物用Q80DS反相柱層析、甲醇水溶液為洗脫溶劑洗脫，收集洗脫物；g.將洗脫物再用濃度50%的甲醇水溶液為溶劑，葡聚糖LH-20(SephadexLH-20)凝膠柱層析洗脫，收集并濃縮洗脫物，得到上述通式(I)中R為氫的本發(fā)明化合物。上述制備步驟中步驟a中的黨參類植物為川黨參；步驟a中的乙醇回流提取是用濃度為70X的乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，乙醇用量為黨參類植物的20倍；步驟f中的甲醇水溶液為洗脫溶劑洗脫是依次用濃度分別為10%的甲醇水溶液、30%的甲醇水溶液、50%的甲醇水溶液和100%的甲醇溶液為洗脫溶劑進(jìn)行洗脫。上述通式(I)中R為氫的本發(fā)明化合物為淺黃色油狀物；分子式C21H26012;紫外光譜UV(MeOH)入max(nm):311;紅外光譜IR(KBr)v腦x(cm"):3432，2924，1706，1634，1604，1174，835;高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MS顯示分子量470.1334;俗稱黨參苷V(tangshenosideV)。上述黨參苷V的碳譜13C-NMR、氫譜^-NMR(CD3OD)數(shù)據(jù)見表l。Atom表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述通式(II)的本發(fā)明化合物的制備方法，包括以下步驟步驟a步驟e同上述通式(I)中R為氫的本發(fā)明化合物的制備方法；f.再用濃度為50%的乙醇溶液對樹脂進(jìn)行洗脫至洗脫液為無色，收集洗脫物;g.將洗脫物用柱層析硅膠裝柱，然后用二氯甲烷和甲醇的混合溶液為洗脫劑洗脫，收集洗脫物；h.將洗脫物用甲醇水=1:2的甲醇水溶液為溶劑，C180DS反相柱層析洗脫，收集并濃縮洗脫液，得到上述結(jié)構(gòu)式為(II)的本發(fā)明化合物。上述制備步驟中步驟a中的黨參類植物為川黨參，步驟a中的乙醇回流提取是用濃度為70X的乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，乙醇用量為黨參類植物的20倍。步驟g中是將洗脫物用粒徑為200300目的柱層析硅膠濕法裝柱，干法上樣，并且上述用二氯甲烷和甲醇的混合溶液為洗脫劑洗脫，是指用二氯甲烷甲醇=80:1的混合溶液梯度洗脫至二氯甲烷甲醇=3:1。上述通式(II)的本發(fā)明化合物為淺黃色油狀物；分子式C38H4S02。；紫外光譜UV(MeOH)入_(咖):227，277，297，309;紅外光譜IR(KBr)v,(cm-1):3432，2927，1706，1633，1604，1172，1126，1072，833。高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MS顯示分子量824.26298;俗稱黨參苷VI(tangshenosideVI)。黨參苷VI的碳譜13C-NMR、氫譜'H-NMR(CD3OD)數(shù)據(jù)見表2。Atom表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發(fā)明人對上述黨參苷V和黨參苷VI的波譜數(shù)據(jù)(見)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析，經(jīng)過CA檢索，確定兩種化合物都為新化合物。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物可抑制細(xì)胞生長，具有細(xì)胞毒活性，對乳腺癌、鼻咽癌、宮頸癌、H印G-2肝癌和A54肺癌細(xì)胞具有治療作用。本發(fā)明人對上述黨參苷V和黨參苷VI進(jìn)行體外抗腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)表明，兩種化合物均可抑制細(xì)胞生長，具有細(xì)胞毒活性，如以下[試驗(yàn)一]所示。[試驗(yàn)一]:黨參苷V、黨參苷VI對多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用實(shí)驗(yàn)材料1、表3黨參苷V、黨參苷VI稱樣量及初始濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2、DMEM培養(yǎng)液:2007-9-7日配制;胰蛋白酶2007.9.7配制3、EP管等塑料器材包裝后126'C高壓蒸汽滅菌，40分鐘，65'C烤箱4小時(shí)烤干備用；移液管、培養(yǎng)瓶等玻璃制品25CTC高溫去熱源處理3小時(shí)，高壓滅菌后使用；96孔板CORNING公司，一次性使用；4、W-CJ-ZFD型醫(yī)用凈化工作臺蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；FormaSeriesII水套C02培養(yǎng)箱美國Thermo公司；SCS-1B型倒置顯微鏡重慶光學(xué)儀器廠；海爾CD-131H型冰箱海爾集團(tuán)。5、MCF-7乳腺癌細(xì)胞、CNE-2鼻咽癌細(xì)胞、Hela宮頸癌細(xì)胞、HepG-2肝癌細(xì)胞、A549肺癌細(xì)胞、RAW264.7巨噬細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟1.計(jì)算實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞數(shù)2種化合物，每種化合物設(shè)計(jì)五個(gè)劑量梯度，每個(gè)劑量設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔，每孔細(xì)胞數(shù)為104個(gè)，并設(shè)空白孔(不加細(xì)胞)和陰性對照孔(加細(xì)胞，不進(jìn)行藥物刺激)，計(jì)劃每孔加入100ul細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液濃度應(yīng)調(diào)整為105個(gè)/mL;2.取出培養(yǎng)瓶，吸去培養(yǎng)基，用冷PBS沖洗兩遍，3.加入0.25%的胰蛋白酶lml處理細(xì)胞，讓液體在細(xì)胞表面來回流動4-5次，以使胰蛋白酶包被所有瓶內(nèi)細(xì)胞，在37°C、5%C02飽和濕度條件下放置2分鐘，或室溫放置3-4min;4.檢查細(xì)胞脫落情況，吸出胰蛋白酶；5.加入4mlDMEM完全培養(yǎng)液(MCF-7、264.7細(xì)胞)或RPMI1640完全培養(yǎng)液(CNE-2、Hela、HepG-2、A549細(xì)胞)，沖洗瓶壁數(shù)次，使貼壁細(xì)胞分散，制成細(xì)胞懸液；6.取20^il細(xì)胞懸液，按體積比1:1進(jìn)行臺盼蘭染色，用加樣槍移取細(xì)胞懸液樣品，加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室中，光鏡下記活細(xì)胞數(shù)；7.共計(jì)數(shù)2次，調(diào)整濃度至105個(gè)/mL;8.將己調(diào)整濃度的各種細(xì)胞懸液分別接種至2個(gè)96孔板，每孔100ul，并設(shè)不加細(xì)胞的空白對照孔。加入藥物試驗(yàn)步驟1..取出接種細(xì)胞的2個(gè)96孔板，棄上清，每孔內(nèi)加入DMEM或RPMI1640完全培養(yǎng)基90ul;2.按照上表所設(shè)計(jì)濃度梯度，依次加入已配置的不同濃度藥物(每個(gè)濃度設(shè)5復(fù)孔)，每孔90ul，混勻后，置于37'C、5%<:02飽和濕度孵箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。結(jié)果測定實(shí)驗(yàn)步驟l.實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4小時(shí)，每孔加20ul5mg/mlMTT溶液2.4小時(shí)后棄上清，每孔加入150ulDMSO溶液，37°C搖床100rpm振蕩10min。3.于550nm/490nm處測量OD值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及實(shí)驗(yàn)分析-根據(jù)公式抑制率=(陰性對照OD-給藥組OD)/陰性對照00*100%通過計(jì)算，各劑量組抑制率見表4。表4:不同濃度的黨參苷V、黨參苷VI對六種腫瘤細(xì)胞的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表4可知黨參苷VI對CNE-2鼻咽癌細(xì)胞、Hela宮頸癌細(xì)胞、H印G-2肝癌細(xì)胞有較明顯的抑制率。黨參苷V對CNE-2鼻咽癌細(xì)胞、Hela宮頸癌細(xì)胞、A549肺癌細(xì)胞、RAW264.7巨噬細(xì)胞有較明顯的抑制率。以上對黨參苷V和黨參苷VI進(jìn)行體外抗腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)表明，兩種化合物均可抑制細(xì)胞生長，具有細(xì)胞毒活性。本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的上述通式(i)化合物或通式(n)化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的化合物和藥物組合物可用于制備治療乳腺癌、鼻咽癌、宮頸癌、HepG-2肝癌和A54肺癌的藥物。上述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如填充劑如淀粉、蔗糖等；黏合劑如淀粉漿、甲基纖維素；潤濕劑如水、乙醇等；崩解劑如干燥淀粉等；潤滑劑如硬脂酸鎂、滑石粉等。另外還可以在組合物中加入其他輔劑如香味劑、甜味劑等。本發(fā)明化合物可以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者，如可制成膠囊劑、片劑、鼻用粉霧劑、鼻用凝膠劑、栓劑、靜脈注射劑、粉針劑等劑型。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性12成分與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體混合，然后將其制成所需的劑型。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.1%99.5%的活性成分，最優(yōu)選含有重量比為0.5%95%的活性成分。本發(fā)明化合物的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴(yán)重程度等變化，其日劑量可以是15mg/kg體重，優(yōu)選23mg/kg體重?？梢砸淮位蚨啻问┯?。圖1為黨參苷V紅外圖譜圖2為黨參苷V高分辨質(zhì)譜圖3為黨參苷V氫譜圖4為黨參苷V碳譜圖5為黨參苷VHMQC相關(guān)譜圖6為黨參苷VHMBC相關(guān)譜圖7為黨參苷VI紅外圖譜圖8為黨參苷VI高分辨質(zhì)譜圖9為黨參苷VI氫譜圖IO為黨參苷VI碳譜圖11為黨參苷VIHMQC相關(guān)譜圖12為黨參苷VIHMBC相關(guān)譜具體實(shí)施方式下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例13-甲基戊二酸-3-0-6"少-對羥基桂皮酰葡萄糖苷(3-methylglutarate陽3-0國(6"-(p-couraaroyl))-glucoside)，俗稱黨參苷V(tangshenosideV)，即上述通式(I)中R為氫的本發(fā)明化合物的制備，包括以下步驟&.將川黨參藥材50公斤用濃度為70%的乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，乙醇用量為川黨參的20倍；b.濃縮乙醇提取液得到浸膏20公斤，再用浸膏量1.5倍的硅藻土拌樣吸附干燥；C.然后依次用石油醚、乙酸乙酯、甲醇進(jìn)行抽提，得甲醇抽提物；d.將甲醇提取物濃縮后得甲醇提取濃縮物5公斤通過D101大孔樹脂分段；e.用濃度為30%的乙醇溶液對樹脂進(jìn)行洗脫至洗脫液為無色，收集洗脫物；f.將洗脫物依次用濃度分別為10%的甲醇水溶液、30%的甲醇水溶液、50%的甲醇水溶液和100%的甲醇溶液為洗脫溶劑、C18ODS反相柱層析進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫物；g.將洗脫物再用濃度50%的甲醇水溶液為溶劑，SephadexLH-20凝膠柱層析洗脫，收集并濃縮洗脫物，得到上述通式(I)中R為氫的本發(fā)明化合物60mg。實(shí)施例2黨參苷-3'-0-6"'-;>對羥基桂皮酰葡萄糖苷(tangshenoside-3'-0-(6'"-(p-co腦aroyl))-glucosid)，俗稱黨參苷VI(tangshenosideVI)，即上述通式(II)的本發(fā)明化合物的制備，包括以下步驟步驟a步驟e同實(shí)施例1中的步驟a步驟e:f.再用濃度為50%的乙醇溶液對樹脂進(jìn)行洗脫至洗脫液為無色，收集洗脫物；g.將洗脫物用粒徑為200300目的柱層析硅膠濕法裝柱，干法上樣，并且用二氯甲烷甲醇=80:1的混合溶劑為洗脫劑梯度洗脫至二氯甲烷甲醇=3:1，收集洗脫物；h.將洗脫物用甲醇水=1:2的甲醇水溶液為溶劑，C18ODS反相柱層析洗脫，收集并濃縮洗脫液，得到上述通式為(II)的本發(fā)明化合物20mg。實(shí)施例3片劑黨參苷V50g淀粉30g糊精30g制備方法取黨參苷V50g，淀粉30g，糊精30g，充分?jǐn)嚢杌旌虾笾屏?，低溫干燥，制?000片，每片含黨參苷V0.05g。實(shí)施例4片劑黨參苷VI50g淀粉30g糊精30g制備方法同實(shí)施例3。實(shí)施例5膠囊劑黨參苷VI50g藥用淀粉200g制備方法取黨參苷VI50g，藥用淀粉200g，制粒，整粒，低溫烘干，裝2號膠囊，每粒含黨參苷VI0.05g。實(shí)施例6鼻用凝膠劑黨參苷Vlg卡波沫(CP934)2g甘油20gNaOH1.6g制備方法取上述配比中的卡波沫與甘油研磨混勻使成凝膠狀，另取配比中的NaOH加適量蒸餾水溶解后加入到凝膠中，中和后加入配比中的黨參苷VI混勻，補(bǔ)足水共制成100g。實(shí)施例7鼻用凝膠劑黨參苷VIlg卡波沫(CP934)2g甘油20g三乙醇胺2.7g制備方法中用三乙醇胺2.7g替代NaOH1.6g，其余同實(shí)施例6。實(shí)施例8注射劑黨參苷V50g注射用水10000ml制備方法無菌條件下取黨參苷V50g，加入到注射用水10000ml中，攪拌約30分鐘充分溶解，灌封，滅菌，即得黨參苷V注射劑。實(shí)施例9注射劑黨參苷VI50g注射用水10000ml制備方法同實(shí)施例8。權(quán)利要求1.下述通式(I)化合物id="icf0001"file="A2008100694090002C1.gif"wi="97"he="52"top="36"left="34"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中R表示氫。2、如權(quán)利要求1所述的化合物的制備方法，該方法包括以下步驟a.將黨參類植物用乙醇回流提取1次以上；b.濃縮乙醇提取液成浸膏后用硅藻土吸附干燥；C.然后依次用石油醚、乙酸乙酯、甲醇進(jìn)行抽提；d.將甲醇抽提物濃縮后通過DlOl大孔樹脂；e.用濃度為30%的乙醇溶液對樹脂進(jìn)行洗脫至洗脫液為無色，收集洗脫物；f.將洗脫物用C^ODS反相柱層析、甲醇水溶液為洗脫溶劑洗脫，收集洗脫物；g.將洗脫物再用濃度50%的甲醇水溶液為溶劑，葡聚糖LH-20凝膠柱層析洗脫，收集并濃縮洗脫物，得到所需產(chǎn)物。3、如權(quán)利要求2所述的化合物的制備方法，其中步驟a中所述的黨參類植物為川黨參；所述的乙醇回流提取是用濃度為70。％的乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，乙醇用量為黨參類植物的20倍。4、如權(quán)利要求2所述的化合物的制備方法，其中步驟f中所述的甲醇水溶液為洗脫溶劑洗脫是依次用濃度分別為10%的甲醇水溶液、30%的甲醇水溶液、50%的甲醇水溶液和100%的甲醇溶液為洗脫溶劑進(jìn)行洗脫。5、下述通式(II)化合物OOH(II)6、如權(quán)利要求5所述的化合物的制備方法，該方法包括以下步驟a.將黨參類植物用乙醇回流提取b.濃縮乙醇提取液成浸膏后用硅藻土吸附干燥；C.然后依次用石油醚、乙酸乙酯、甲醇進(jìn)行抽提；d.將甲醇抽提物濃縮后通過DlOl大孔樹脂；e.用濃度為30%的乙醇溶液對樹脂進(jìn)行洗脫至洗脫液為無色；f.再用濃度為50%的乙醇溶液對樹脂進(jìn)行洗脫至洗脫液為無色，收集洗脫物；g.將洗脫物用柱層析硅膠裝柱，然后用二氯甲烷和甲醇的混合溶液為洗脫劑洗脫，收集洗脫物；h.將洗脫物用甲醇水=1:2的甲醇水溶液為溶劑，C18ODS反相柱層析洗脫，收集并濃縮洗脫液，得到所需產(chǎn)物。7、如權(quán)利要求6所述的化合物的制備方法，其中步驟a中所述的黨參類植物為川黨參，所述的乙醇回流提取是用濃度為70%的乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，乙醇用量為黨參類植物的20倍；步驟g中是將洗脫物用粒徑為200300目的柱層析硅膠濕法裝柱，干法上樣；并且所述用二氯甲烷和甲醇的混合溶液為洗脫劑洗脫，是指用二氯甲烷甲醇=80:1的混合溶液梯度洗脫至二氯甲烷甲醇=3:1。8、用于治療乳腺癌、鼻咽癌、宮頸癌、HepG-2肝癌和A54肺癌的藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求1化合物和藥學(xué)上可接受的載體。9、用于治療乳腺癌、鼻咽癌、宮頸癌、HepG-2肝癌和A54肺癌的藥物組合物，其中含有治療有效量的權(quán)利要求5化合物和藥學(xué)上可接受的載體。10、權(quán)利要求1或5所述的化合物在制備治療乳腺癌、鼻咽癌、宮頸癌、HepG-2肝癌和A54肺癌的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及新穎的通式(I)的苯丙素類衍生物，其中R表示氫。本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法，以該化合物為活性成分的藥物組合物，以及本發(fā)明化合物和藥用組合物在治療乳腺癌、鼻咽癌、宮頸癌、HepG-2肝癌和A549肺癌中的應(yīng)用。文檔編號C07H15/00GK101235059SQ200810069409公開日2008年8月6日申請日期2008年2月29日優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日發(fā)明者侴桂新,丹宋,李隆云,王崢濤,穎趙,鐘國躍申請人:重慶市中藥研究院