專利名稱：：從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中提純頭孢克洛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說，涉及一種從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中提純頭孢克洛的方法。
背景技術(shù)：
：頭孢克洛(Cefaclor)是一種半合成的第二代頭孢類抗生素，對于革蘭氏陽性菌有較強的抗菌活性，具有高效、廣譜和較強的化學(xué)穩(wěn)定性，是目前臨床治療細菌感染的重要藥物之一。頭孢克洛從二十世紀七十年代成功上市以來，作為高效、廣譜和良好的臨床安全性的抗生素，一直受到人們推崇，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示-x=l,2COOH酶法合成頭孢菌素是目前新興的合成頭孢菌素類抗生素的"綠色工藝"，專利WO/2006/069984描述，通過D-苯基甘氨酰胺或D-苯甘氨酸酯，尤其是D-苯甘氨酸酯進行7-氨基-3-氯-去乙酰氧基-頭孢菌酸(7ACCA)的(酶促)去乙?；苽漕^孢克洛的方法。根據(jù)WO/1999/031109，為了獲得高轉(zhuǎn)化率與易于回收的頭孢克洛，采用萘酚為絡(luò)合劑，形成頭孢克洛沉淀是一個好的方法，采用酶法-絡(luò)合合成頭孢克洛的工藝，不僅可以提高轉(zhuǎn)化率，同時為簡化后續(xù)下游的分離提供了可能性。實踐發(fā)現(xiàn)，要提高頭孢克洛的轉(zhuǎn)化率，需要加大底物D-苯甘氨酸酯的比例，通常D-苯甘氨酸酯與7-ACCA的比例要大于1，甚至達到2:1的情況。因此，絡(luò)合后的頭孢克洛沉淀一般含有相對大量的苯甘氨酸和7-ACCA及一定量的苯甘氨酸酯或D-苯基甘氨酰胺。在實踐中，絡(luò)合后的頭孢克洛通常含有占頭孢克洛重量2-4%的苯甘氨酸，尤其是在為了盡可能多的獲得頭孢克洛萘酚復(fù)合物沉淀的情況下，苯甘氨酸甚至可以占到頭孢克汔重量的近5%，同時獲得的頭孢克洛中含有占總重量0.6%-1%的7-ACCA。在已知合成頭孢克洛方法中(如US56085055;US5693790;WO9931109),頭孢克洛成品均在含水溶液中經(jīng)反應(yīng)結(jié)晶制得。然而實踐證明，從酶促反應(yīng)后頭孢克洛萘酚復(fù)合物中通過結(jié)晶方法獲得的頭孢克洛通常含有高于頭孢克洛重量0.5%的苯甘氨酸，和高于頭孢克洛重量0.3%的7-ACCA，獲得的頭孢克洛不符合市售頭孢克洛原料藥的標準(中國藥典2005年版)。采用介質(zhì)吸附的方法，例如活性碳吸附法(CN1179425A)，可以除去抗生素中的雜質(zhì)。但是實踐發(fā)現(xiàn)，活性碳同樣會吸附抗生素，因而會顯著影響頭孢克洛的得率。因此，有必要提供一種新的純化反應(yīng)器酶法合成的頭孢克洛的方法，以降低終產(chǎn)物中雜質(zhì)的含量，獲得頭孢克洛含量符合市售頭孢克洛原料藥標準的頭孢克洛產(chǎn)品，同時，對頭孢克洛的得率沒有明顯影響。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種純化反應(yīng)器酶法合成的頭孢克洛的方法，以降低終產(chǎn)物中雜質(zhì)的含量，獲得頭孢克洛含量符合市售頭孢克洛原料藥標準的頭孢克洛產(chǎn)品。本發(fā)明提供的方法，包括以下步驟A)水洗頭孢克洛萘酚復(fù)合物，然后以有機溶劑萃取水相中的雜質(zhì)，收集水相；B)調(diào)節(jié)水相溶液的pH值至1—2，然后上大孔吸附樹脂吸附；c)待吸附完全后，使用低碳有機溶劑-水混合液作為流動相洗脫頭孢克洛，收集洗脫液。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述步驟A中用于萃取雜質(zhì)的有機溶劑為醋酸丁酯。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述步驟A中所述有機溶劑萃取雜質(zhì)的步驟重復(fù)多次。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述低碳有機溶劑-水混合液為甲醇-水混合液、乙腈-水混合液、丙酮-水混合液或異丙醇-水混合液；優(yōu)選為甲醇-水混合液或異丙醇-水混合液。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述大孔吸附樹脂為聚苯乙烯吸附樹脂及其衍生樹脂；優(yōu)選的，所述聚苯乙烯吸附樹脂及其衍生樹脂為Hz816吸附樹脂或AmberliteXAD-4吸附樹脂。綜上所述，采用本發(fā)明的純化方法，可以從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中獲得高純度的頭孢克洛，且雜質(zhì)含量低，符合《藥典》的標準，可以直接作為市售原料藥。具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。除非特別說明，以下實施例中所使用的百分比(％)均為重量百分比。在本發(fā)明的下述實施例中，頭孢克洛中有關(guān)物質(zhì)，參考中國藥典2005年版中的方法,釆用高效液相色譜(HPLC)檢測，具體如下液相色譜檢測所用的色譜柱為Agilent公司的ZORBAXSB-C18色譜柱；以0.78%磷酸二氫鈉溶液(以磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.0)為流動相A，以0.78%磷酸二氫鈉溶液(pH4.0)-乙腈(55:45)為流動相B;流速為每分鐘1.0ml，梯度洗脫；檢測波長為220nm;檢測溫度為25°C。取供試品溶液20pl，注入液相色譜儀，梯度洗脫，030分鐘，流動相B的比例從5%增加至25%;45分鐘時，流動相B的比例增加至100%，維持5分鐘，51分鐘時，流動相A的比例增加至95X，維持10分鐘，記錄色譜圖。在本發(fā)明的下述實施例中，頭孢克洛的含量，參考中國藥典2005年版中的方法，采用高效液相色譜(HPLC)檢測，具體如下液相色譜檢測所用的色譜柱為Agilent公司的ZORBAXSB-C18色譜柱；以0.78%磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.4)-乙腈(92:8)為流動相；流速為每分鐘1.0ml;檢測波長為254nm;檢測溫度為25°C。取供試品溶液20pl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。實施例1、制備頭孢克洛萘酚復(fù)合物參考WO2006/069984的方法，制備獲得頭孢克洛萘酚復(fù)合物，具體如下稱取7-氨基-3-氯-去乙酰氧基-頭孢菌酸(7-ACCA)19.15g，加去離子水約500ml，滴加氨水完全溶解7-ACCA，以硫酸緩慢調(diào)節(jié)pH到6.4。稱取D-苯甘氨酸甲酯(PGME)33.62g，加少量水使完全溶解后，將PGME加入7-ACCA溶液中，混合均勻，加入磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH為6.4,加去離子水至1000ml。連接原位分離反應(yīng)器各管路，控制反應(yīng)器溫度為20°C。隨后將約75%的上述底物溶液加入反應(yīng)瓶中，約25%的底物溶液加入絡(luò)合瓶中。然后，向反應(yīng)瓶中加20.8g(約4000IU)的固定化青霉素?；?IPA750)，而絡(luò)合瓶中加1-萘酚17.3g，隨后開始反應(yīng)。3h后停止反應(yīng)，從絡(luò)合瓶中過濾獲得頭孢克洛萘酚復(fù)合物約45g。實施例2、從頭孢克洛萘酚復(fù)合物提純頭孢克洛2.1、頭孢克洛萘酚復(fù)合物的溶解及初步純化用總量為400—450毫升的水，分多次洗滌頭孢克洛萘酚復(fù)合物，收集洗滌液，用硫酸或鹽酸調(diào)節(jié)pH值至約1.5，然后加入等體積的醋酸丁酯，攪拌1小時。靜置15—30分鐘，待分層后，收集水相，保存醋酸丁酯相。再次向水相中加入等體積的醋酸丁酯，調(diào)節(jié)pH值至約1.5，攪拌1小時，靜置分層后，收集水相，保存醋酸丁酯相。合并醋酸丁酯相，加入100—150毫升水，調(diào)節(jié)pH值至約1.5。攪拌1小時，靜置分層后，收集水相，合并水相，并檢測水相中頭孢克洛及主要雜質(zhì)的含量。檢測結(jié)果顯示，在水相中含有約32g頭孢克洛(純度為93.2%);其中含有4.52%的苯甘氨酸；0.92%的7-ACCA;0.21%的苯甘氨酸甲酯。2.2、大孔吸附樹脂純化將初步純化的1000毫升級的頭孢克洛及雜質(zhì)的混合水溶液調(diào)節(jié)pH值至l一2，如表1所示分別加入裝有大孔吸附樹脂的層析柱，待吸附完全后，以l一2倍樹脂體積的水沖洗樹脂，然后，分別使用表1所示的洗脫液進行洗脫，在采用約一倍樹脂體積洗脫液洗脫后，紫外檢測器顯示頭孢克洛開始從吸附樹脂上洗脫下來，此時收集洗脫液。表l、大孔吸附樹脂純化<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注Hz816吸附樹脂購自上海華震科技有限公司；AmberliteXAD-4吸附樹脂購自美國羅門哈斯公司。檢測洗脫液中頭孢克洛及主要雜質(zhì)的含量，并計算頭孢克洛的得率，結(jié)果如表2所示。表2、洗脫液中頭孢克洛的純度及主要雜質(zhì)含量檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表1和表2的結(jié)果可見，相對于樹脂處理前，使用上述4種有機溶劑-水混合液進行洗脫后，獲得的洗脫液中，頭孢克洛的得率均達到90%以上，且純度均超過99%，而在主要的雜質(zhì)中，苯甘氨酸含量降低了約lO—ll倍，7-ACCA含量降低了約5倍，苯甘氨酸甲酯含量降低了約3倍。實施例3、結(jié)晶經(jīng)大孔吸附樹脂純化后的頭孢克洛洗脫液，分別于35—45t:之間減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮后加入等體積的異丙醇攪拌，4'C冷卻，并緩慢滴加氨水至溶液開始出現(xiàn)渾濁，攪拌1小時后，用氨水調(diào)節(jié)pH值至4，攪拌均勻，結(jié)晶干燥后得頭孢克洛水合物固體，同時，以步驟2.1獲得的頭孢克洛及雜質(zhì)的混合水溶液進行結(jié)晶作為對照。分別檢測上述獲得的頭孢克洛水合物晶體獲得的固體中頭孢克洛的純度及各主要雜質(zhì)的含量，結(jié)果如表3所示。表3、晶體中頭孢克洛的純度及主要雜質(zhì)含量檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表3的結(jié)果可見，對照的樣品中頭孢克洛純度為98.3%，苯甘氨酸含量0.93%,7-ACCA含量0.3lX，苯甘氨酸甲酯0.08%，不符合市售頭孢克洛原料藥標準；而經(jīng)過大孔吸附樹脂純化后，樣品中頭孢克洛的純度達到99.4—99.5%;苯甘氨酸的含量降至0.18—0.22%;7陽ACCA的含量降至0.02—0.022%;苯甘氨酸甲酯的含量降至0.006—0.008%，同時，按照藥典中測定頭孢克洛的含量的方法檢測結(jié)晶后的晶體頭孢克洛的含量，結(jié)果顯示，上述純化后的溶液的結(jié)晶晶體中頭孢克洛的含量均高于95%，符合市售頭孢克洛原料藥標準。綜上所述，采用本發(fā)明的純化方法，可以從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中獲得高純度的頭孢克洛，且雜質(zhì)含量低，符合《藥典》的標準，可以直接作為市售原料藥。權(quán)利要求1、一種從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中提純頭孢克洛的方法，其特征在于包括以下步驟A)水洗頭孢克洛萘酚復(fù)合物，然后以有機溶劑萃取水相中的雜質(zhì)，收集水相；B)調(diào)節(jié)水相溶液的pH值至1-2，然后上大孔吸附樹脂吸附；C)待吸附完全后，使用低碳有機溶劑-水混合液作為流動相洗脫頭孢克洛，收集洗脫液。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟A中用于萃取雜質(zhì)的有機溶劑為醋酸丁酯。3、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟A中所述有機溶劑萃取雜質(zhì)的步驟重復(fù)多次。4、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附樹脂為聚苯乙烯吸附樹脂及其衍生樹脂。，5、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附樹脂為Hz816吸附樹脂或AmberliteXAD-4吸附樹脂。6、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述低碳有機溶劑-水混合液為甲醇-水混合液、乙腈-水混合液、丙酮-水混合液或異丙醇-水混合液。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述甲醇-水混合液為體積比1:1的甲醇-水混合液。8、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述異丙醇-水混合液為1:1的異丙醇-水混合液。9、如權(quán)利要求1一8中任一項所述的方法，其特征在于，還包括對洗脫液進行結(jié)晶獲得頭孢克洛晶體的步驟。全文摘要本發(fā)明提供了一種從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中提純頭孢克洛的方法，本發(fā)明提供的方法包括以下步驟A)水洗頭孢克洛萘酚復(fù)合物，然后以有機溶劑萃取水相中的雜質(zhì)，收集水相；B)調(diào)節(jié)水相溶液的pH值至1-2，然后上大孔吸附樹脂吸附；C)待吸附完全后，使用低碳有機溶劑-水混合液作為流動相洗脫頭孢克洛，收集洗脫液。采用本發(fā)明的純化方法，可以從頭孢克洛萘酚復(fù)合物中獲得高純度的頭孢克洛，且雜質(zhì)含量低，符合《藥典》的標準，可以直接作為市售原料藥。文檔編號C07D501/12GK101314605SQ20081003889公開日2008年12月3日申請日期2008年6月12日優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日發(fā)明者林金萍,許偉欽,魏東芝申請人:華東理工大學(xué)