專利名稱：：卵黃聚乙二醇一次沉淀脫脂技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及卵黃聚乙二醇一次沉淀脫脂技術(shù)，是專用于卵黃中油脂和水溶性組分的分離工藝，屬于生物技術(shù)制藥中卵黃免疫球蛋白制備
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：雞卵黃免疫球蛋白又稱IgY(YolkImmunoglobulin),是存在于免疫后母雞的卵黃中的一種抗體，它是由母雞血清中的免疫球蛋白轉(zhuǎn)移而來(lái)。IgY具有穩(wěn)定性較好、取材方便、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。卵黃抗體可以應(yīng)用于多種抗原的多克隆抗體制備并應(yīng)用于臨床疾病治療，如雞傳染性法氏囊炎、新城疫、鴨瘟、小鵝瘟、豬瘟等等。用禽卵大量制備多克隆抗體在近年來(lái)抗體制備技術(shù)已經(jīng)逐漸興起，并且已經(jīng)制備了針對(duì)不同抗原的IgY，如服V、流感病毒大腸桿菌、鏈球菌、梭狀芽抱孢桿菌、人胰島素、人紅細(xì)胞、人血清免疫球蛋白、蛇毒和蝎毒等。卵黃是由約48.7%的水、16.6%蛋白質(zhì)和32.6%的脂類及其他組分組成，卵黃可以被看成是一個(gè)油包水的高度乳化體，IgY的開(kāi)發(fā)和利用首先要將卵黃中油脂和水溶性組分進(jìn)行分離，即將卵黃脫脂，所以卵黃脫脂技術(shù)一直是IgY開(kāi)發(fā)的起點(diǎn)。高效、簡(jiǎn)單、成本低廉的脫脂方法一直是科研工作者的追求目標(biāo)。卵黃脫脂研究國(guó)外起步較早，并且已經(jīng)形成了許多成熟的方法，如Poison的PEG法及其改進(jìn)方法(1980和1985)、Bade和Stegemann的氯仿一PEG法(1984)、Jensenius的硫酸葡聚糖法(1981)以及Nakai和Schwarzkopf的水稀釋法等等。國(guó)內(nèi)對(duì)卵黃脫脂研究相對(duì)較晚，許多方法是在以上方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。以上這些脫脂方法雖然能保證IgY的回收率，但是應(yīng)用于大批量生產(chǎn)卻都存在一定缺陷。首先，這些方法都需要使用大量試劑甚至有毒有機(jī)溶劑，脫脂后去除這些試劑或有機(jī)溶劑必然要增加卵黃抗體的成本；其次，這些方法都需要使用冷凍離心機(jī)和冰箱，這將大大限制卵黃脫脂的批生產(chǎn)量，并且也增加成本。所以，卵黃脫脂技術(shù)仍需要繼續(xù)的探索。這些年來(lái)，我國(guó)科研工作者為卵黃脫脂大規(guī)模生產(chǎn)也進(jìn)行了很多研究，并取得了一定的成果。如山東農(nóng)業(yè)大學(xué)柴家前的發(fā)明專利一種提取卵黃中抗體的新方法(申請(qǐng)?zhí)?5110458.6)中公開(kāi)的甲醛脫脂法是將卵黃用緩沖液稀釋后添加0.31.2Q^甲醛溶液，然后再冷凍快速溶解得到的液體即為抗體溶液。1998年山東農(nóng)業(yè)大學(xué)常韋山的發(fā)明專利精制卵黃抗體的制備工藝(ZL專利號(hào)98110215.8)中公開(kāi)的苯酚脫脂法是使用含23%的化學(xué)純苯酚溶液與卵黃35:1混合均勻，室溫靜置10分鐘，離心后可使卵黃液分為含脂類物質(zhì)的沉淀和含抗體的上清液。福州大學(xué)王輝龍?jiān)?001年發(fā)表了"聚乙二醇一步沉淀提取卵黃抗體"方法，該法是使用緩沖液稀釋后再超濾達(dá)到卵黃脫脂目的。另外還有江南大學(xué)楊嚴(yán)俊的發(fā)明專利一種高生物活性卵黃抗體的制備方法(申請(qǐng)?zhí)?00610040414.2)中利用天然高分子膠結(jié)合超濾技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化規(guī)模從蛋黃中分離提取高生物活性卵黃抗體的目的。以上專利以柴家前教授的方法最為有效、簡(jiǎn)單、成本低廉，但是甲醛的殘留毒害卻是該方法的致命缺點(diǎn)，同時(shí)使用大容量低溫冰箱也影響該方法的生產(chǎn)量。以上這些方法都必須使用大量無(wú)機(jī)或有機(jī)試劑、離心機(jī)或超濾設(shè)備以及都需要經(jīng)過(guò)多個(gè)步驟才能達(dá)到卵黃脫脂的目的。其中許多試劑是有毒、有害的，在IgY液中殘留后很難去除；儀器或設(shè)備的使用也增加了脫脂成本，同時(shí)也約束了脫脂工藝的批生產(chǎn)量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是，在保證卵黃中IgY活性和回收率的基礎(chǔ)上，研究一種采用劑量少、安全、無(wú)毒的脫脂試劑，與卵黃作用后可以使卵黃中油脂與蛋白質(zhì)分離，且不使用離心儀器即能自然凝集沉淀，而達(dá)到一步脫脂的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所用的技術(shù)方案是使用聚乙二醇(PEG,分子量為100020000)或其溶液與卵黃原液或卵黃稀釋液直接混合，通過(guò)機(jī)械攪拌和PEG的強(qiáng)吸水能力打破卵黃的乳化狀態(tài)，使卵黃中油脂顆粒與蛋白質(zhì)分離，然后通過(guò)靜置，使卵黃油脂發(fā)生相互凝集而自然沉淀，從而達(dá)到卵黃脫脂的目的。本發(fā)明的具體方法如下在一5'C50'C環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，攪拌打破卵黃膜，取卵黃原液；先將卵黃原液加水做n倍稀釋成卵黃稀釋液，然后將聚乙二醇用卵黃原液m倍體積的水溶解，得聚乙二醇溶液；最后將卵黃稀釋液和聚乙二醇溶液充分?jǐn)嚢杌靹颍o置沉淀，沉淀后的底部即為卵黃油脂，上清液為卵黃水溶性組分，即IgY與其他蛋白的混合溶液；其中0〈n<20，0<m<20，且(Xn+m《20。本發(fā)明的另一種具體方法是:在一5'C5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，攪拌打破卵黃膜，取卵黃原液；先將卵黃原液加水做n倍稀釋成卵黃稀釋液，然后添加聚乙二醇充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置沉淀，沉淀后的底部即為卵黃油脂，上清液為卵黃水溶性組分，即IgY與其他蛋白的混合溶液；其中0<n《20。本發(fā)明的又一種具體方法是:在一5'C50'C環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，攪拌打破卵黃膜，取卵黃原液；然后將聚乙二醇用卵黃原液m倍體積的水溶解，得聚乙二醇溶液；最后將卵黃原液和聚乙二醇溶液充分?jǐn)嚢杌靹颍o置沉淀，沉淀后的底部即為卵黃油脂，上清液為卵黃水溶性組分，即IgY與其他蛋白的混合溶液；其中0〈m《20。本發(fā)明的又一種具體方法是:在一5'C5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，攪拌打破卵黃膜，取卵黃原液并添加聚乙二醇，然后向卵黃一聚乙二醇混合物中添加卵黃體積x倍的水，攪拌使聚乙二醇溶解完全后靜置沉淀，沉淀后的底部即為卵黃油脂，上清液為卵黃水溶性組分，即IgY與其他蛋白的混合溶液；其中0〈x《20。本發(fā)明方法中聚乙二醇與卵黃原液的用量比(w/v)為1%10%。本發(fā)明中用的PEG為高分子聚合物，它超強(qiáng)的吸水性，可以破壞水溶液中蛋白質(zhì)和脂類水化膜的作用。卵黃作為一種高濃度油包水的乳劑，在PEG溶液稀釋并攪拌的狀態(tài)下，油脂和蛋白質(zhì)的乳化狀態(tài)被打破，兩者分離開(kāi)來(lái)，懸浮于水溶液中的油脂顆粒易發(fā)生碰撞而凝集，由于卵黃中油脂密度大于水，在靜置過(guò)程中，卵黃油脂便沉淀于底部，從而達(dá)到卵黃脫脂的作用。當(dāng)PEG用量低于卵黃的1%(w/v)時(shí)，PEG不能充分破壞卵黃的乳化狀態(tài)，不能發(fā)生明顯的沉降作用；當(dāng)PEG用量達(dá)到卵黃的10%(w/v)或更高時(shí)，PEG對(duì)IgY水化膜的破壞作用增強(qiáng)，IgY和油脂都會(huì)發(fā)生沉淀而嚴(yán)重影響IgY的回收率。本發(fā)明中PEG用量直接決定著卵黃的脫脂速度和效果，脫脂效果的好壞直接體現(xiàn)在脫脂后上清液的澄清度、顏色以及IgY損失上。隨著PEG用量的增大，上清液的澄清度越來(lái)越高，顏色越來(lái)越淡(直至無(wú)色)，但是達(dá)到無(wú)色后IgY損失率也升高較快。另外PEG用量增大，沉降速度也隨之減慢，但是沉淀物卻非常結(jié)實(shí)。PEG用量與沉降速度、上清液澄清度和顏色的關(guān)系見(jiàn)表1;PEG的用量與IgY損失情況見(jiàn)表2(以雞傳染性法氏囊炎卵黃抗體效價(jià)的瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果為例)。表lPEG用量與脫脂后上清液澄清度、顏色記錄PEG濃度(w/v)2.4%3.2%4.0%4.8%5.6%6.4%7.2%0%沉降速度不沉淀65ml66ml60ml35ml20ml20ml不沉淀上清液澄清度渾濁微濁澄清澄清澄清澄清澄清渾濁上清液顏色黃色黃色淡黃色微黃色微黃色無(wú)色無(wú)色黃色注沉降速度采用測(cè)量沉降后上清液體積的方法進(jìn)行比較，此表數(shù)據(jù)為沉降30分鐘后的上清液體積表2PEG用量與IgY損失記錄<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注1、該結(jié)果為雞傳染性法氏囊炎高免卵黃脫脂后上清液瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抗體效價(jià)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。2、該表數(shù)據(jù)為兩次平行試驗(yàn)結(jié)果的平均值。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較有以下優(yōu)點(diǎn)1、低毒、無(wú)害本發(fā)明使用的試劑PEG為無(wú)毒、無(wú)害的試劑，可在許多注射劑、口服液以及食品中大量使用，IgY中殘留的PEG毒性和危害性可以忽略不計(jì)，同時(shí)PEG也是IgY進(jìn)一步純化的常用試劑。2、簡(jiǎn)單、易于操作該脫脂方法不使用任何儀器，直接用PEG水溶液與卵黃原液或卵黃稀釋液混合攪拌，一步便可使卵黃油脂自然沉淀，所以該方法最為簡(jiǎn)便，易于操作。3、滿足大規(guī)模生產(chǎn)需求由于該專利不使用任何儀器，所以批生產(chǎn)量不受到限制，因而適合于大規(guī)模生產(chǎn)。4、脫脂速度快采用本方法脫脂，不同反應(yīng)量的混合液一般0.55小時(shí)后，沉淀過(guò)程就完全結(jié)束，沉淀物形成粘稠膏狀物，攪拌也無(wú)法使其再次混懸。5、成本低廉本發(fā)明中使用的PEG量較少，同時(shí)PEG價(jià)格又很低，再加上不使用任何儀器，所以本發(fā)明方法成本非常低廉。具體實(shí)施方式具體實(shí)施實(shí)例1在ot:5'c環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，攪拌打破卵黃膜，然后精確量取卵黃原液100ml，置500ml燒杯中。精確稱取1.5g聚乙二醇6000溶于300ml蒸餾水中，攪拌至完全溶解，然后將PEG液倒入卵黃原液中攪拌5分鐘，再將混合液靜置沉淀24小時(shí)。沉淀后的卵黃液分為兩層，底部為粘稠膏狀卵黃油脂，上清液為澄清透明的卵黃水溶性組分，即IgY與其他蛋白的混合溶液。具體實(shí)施實(shí)例2在2(TC25"C環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，攪拌打破卵黃膜，然后精確量取卵黃原液100ml，置500ml燒杯中，然后添加100ml蒸餾水稀釋，攪拌均勻。精確稱取5.6g聚乙二醇4000溶于500ml蒸餾水中，攪拌至完全溶解。然后將PEG液倒入卵黃稀釋液中攪拌5分鐘，然后將混合液靜置沉淀2小時(shí)。沉淀后的卵黃液分為兩層，底部為粘稠膏狀卵黃油脂，上清液為澄清透明的卵黃水溶性組分，即IgY與其他蛋白的混合溶液。具體實(shí)施實(shí)例3在4(TC45'C環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，攪拌打破卵黃膜，然后精確量取卵黃原液100ml，再稱取8.Og聚乙二醇12000加到卵黃原液中，再添加1500ml水?dāng)嚢柚罰EG完全溶解，然后將混合液靜置沉淀過(guò)夜。沉淀后的卵黃液分為兩層，底部為粘稠膏狀卵黃油脂，上清液為澄清透明的卵黃水溶性組分，即IgY與其他蛋白的混合溶液。具體實(shí)施實(shí)例4在KTC15'C環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，攪拌打破卵黃膜，然后精確量取卵黃原液100ml，置1000ml燒杯中，然后添加500ml蒸餾水稀釋再添加4.8g聚乙二醇6000后攪拌至完全溶解。然后將混合液靜置沉淀3小時(shí)。沉淀后的卵黃液分為兩層，底部為粘稠膏狀卵黃油脂，上清液為澄清透明的卵黃水溶性組分，即IgY與其他蛋白的混合溶液。權(quán)利要求1.卵黃聚乙二醇一次沉淀脫脂技術(shù)，其特征在于，將聚乙二醇(PEG，分子量為1000～20000)或其溶液與卵黃原液或卵黃稀釋液直接混合充分?jǐn)嚢瑁缓箪o置，卵黃油脂發(fā)生相互凝集而自然沉淀，沉淀后的底部即為卵黃油脂，上清液為卵黃水溶性組分，即IgY與其他蛋白的混合溶液。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的卵黃聚乙二醇一次沉淀脫脂技術(shù)，其特征在于，在一5"C50'C環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，攪拌打破卵黃膜，取卵黃原液；先將卵黃原液加水做n倍稀釋成卵黃稀釋液，然后將聚乙二醇用卵黃原液m倍體積的水溶解，得聚乙二醇溶液；最后將卵黃稀釋液和聚乙二醇溶液充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置沉淀，沉淀后的底部即為卵黃油脂，上清液為卵黃水溶性組分，即IgY與其他蛋白的混合溶液；其中0〈n〈20，0<m<20，且0<n+m《20。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的卵黃聚乙二醇一次沉淀脫脂技術(shù)，其特征在于，在一5'C5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，攪拌打破卵黃膜，取卵黃原液；先將卵黃原液加水做n倍稀釋成卵黃稀釋液，然后添加聚乙二醇充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置沉淀，沉淀后的底部即為卵黃油脂，上清液為卵黃水溶性組分，即lgY與其他蛋白的混合溶液；其中0<n《20。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的卵黃聚乙二醇一次沉淀脫脂技術(shù)，其特征在于，在一5'C5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，攪拌打破卵黃膜，取卵黃原液；然后將聚乙二醇用卵黃原液m倍體積的水溶解，得聚乙二醇溶液；最后將卵黃原液和聚乙二醇溶液充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置沉淀，沉淀后的底部即為卵黃油脂，上清液為卵黃水溶性組分，即IgY與其他蛋白的混合溶液；其中0<m《20。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的卵黃聚乙二醇一次沉淀脫脂技術(shù)，其特征在于，在一5'C5(TC環(huán)境中，將卵黃從雞蛋中取出后，攪拌打破卵黃膜，取卵黃原液并添加聚乙二醇，然后向卵黃一聚乙二醇混合物中添加卵黃體積x倍的水，攪拌使聚乙二醇溶解完全后靜置沉淀，沉淀后的底部即為卵黃油脂，上清液為卵黃水溶性組分，即IgY與其他蛋白的混合溶液；其中0〈x《20。6、根據(jù)權(quán)利要求2或3或4或5所述的卵黃聚乙二醇一次沉淀脫脂技術(shù)，其特征在于，聚乙二醇與卵黃原液的用量比(w/v)為1%10%。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了卵黃聚乙二醇一次沉淀脫脂技術(shù)，是專用于卵黃中油脂和水溶性組分的分離工藝，屬于生物技術(shù)制藥中卵黃免疫球蛋白制備
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明所用的技術(shù)方案是使用PEG或其溶液與卵黃原液或卵黃稀釋液直接混合，通過(guò)機(jī)械攪拌和PEG的強(qiáng)吸水能力打破卵黃的乳化狀態(tài)，使卵黃中油脂顆粒與蛋白質(zhì)分離，然后通過(guò)靜置，使卵黃油脂發(fā)生相互凝集而自然沉淀，從而達(dá)到卵黃脫脂的目的。本方法與現(xiàn)有脫脂方法相比較具有使用試劑少、安全、無(wú)毒，操作簡(jiǎn)便以及不使用大型儀器等優(yōu)點(diǎn)，并且能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。文檔編號(hào)C07K1/00GK101225103SQ20081001451公開(kāi)日2008年7月23日申請(qǐng)日期2008年2月1日優(yōu)先權(quán)日2008年2月1日發(fā)明者劍付,何元龍,靜吳,楊英閣,閻佩佩申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所