專利名稱：用于產(chǎn)生報(bào)告分子的點(diǎn)擊化學(xué)的制作方法
專利說(shuō)明用于產(chǎn)生報(bào)告分子的點(diǎn)擊化學(xué) 本發(fā)明涉及產(chǎn)生適于檢測(cè)分析物，如核酸的報(bào)告分子。此外，本發(fā)明涉及檢測(cè)分析物的方法和區(qū)域。

背景技術(shù)：
在DNA合成領(lǐng)域中的劃時(shí)代突破，最重要的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和亞磷酰胺化學(xué)，已經(jīng)導(dǎo)致天然DNA修飾的所有組成不斷增加。在PCR中，使用某些B族聚合酶可以摻入在嘧啶的5位或在7-脫氮雜嘌呤的7位上攜帶接頭的經(jīng)修飾的核苷三磷酸[1]。這些結(jié)構(gòu)單元向DNA中摻入的容易程度強(qiáng)烈依賴于側(cè)鏈的空間體積和分子結(jié)構(gòu)。原則上，在PCR中所有天然的核堿基都可以被經(jīng)修飾的核堿基替代[2]。如果使用亞磷酰胺化學(xué)，原則上任何分子結(jié)構(gòu)都可以摻入DNA中。最大的限制是摻入DNA的經(jīng)修飾的核堿基對(duì)于亞磷酰胺DNA合成和所得DNA鏈的去保護(hù)條件必須是穩(wěn)定的。
在我們的研究小組中已經(jīng)開(kāi)發(fā)了避免修飾的空間體積以及潛在化學(xué)不穩(wěn)定性的問(wèn)題的方法[3]。經(jīng)修飾的核苷酸攜帶含有內(nèi)部和末端炔的接頭。內(nèi)部炔有助于通過(guò)PCR的摻入，因?yàn)榕c核堿基很接近的空間體積被減少了。末端炔是點(diǎn)擊反應(yīng)(click reaction)的反應(yīng)性位點(diǎn)[4]，點(diǎn)擊反應(yīng)是銅催化的疊氮化物和炔之間的Huisgen偶極環(huán)加成[5]。該反應(yīng)可以方便地用于生物分子的合成后標(biāo)記。從而疊氮化物可以在高產(chǎn)率反應(yīng)中連接到DNA而不會(huì)遇到任何嚴(yán)重的副反應(yīng)，因?yàn)樘烊坏纳锓肿硬粩y帶任何疊氮化物或者末端炔。該方法也描述于PCT/EP2006/004017，將其內(nèi)容引入本文作為參考。
根據(jù)以前描述的方法，僅僅一種類型的標(biāo)記基團(tuán)可以以位點(diǎn)選擇性方式導(dǎo)入。從而，本發(fā)明的目的是克服這種限制并允許用至少兩種不同的標(biāo)記基團(tuán)(例如，染料或其他功能分子)以連續(xù)的方式位點(diǎn)特異性標(biāo)記報(bào)告分子，從而實(shí)現(xiàn)修飾中前所未有的通用性。
發(fā)明概述 本發(fā)明允許向報(bào)告分子中以連續(xù)方式位點(diǎn)特異性摻入兩種或多種不同的官能團(tuán)。這可以通過(guò)在報(bào)告分子合成期間向其摻入至少兩種不同的手柄基團(tuán)，其可以選擇性偶聯(lián)到包含不同官能團(tuán)的反應(yīng)配偶體。
從而，本發(fā)明的第一方面涉及產(chǎn)生包含至少兩種不同官能團(tuán)的報(bào)告分子的方法，其中至少一個(gè)第一和至少一個(gè)第二手柄基團(tuán)摻入到報(bào)告分子中，其中手柄基團(tuán)選自炔基、經(jīng)保護(hù)的炔基、疊氮基、醛基、經(jīng)保護(hù)的醛基、肼基或者羥胺基，并且其中第一和第二手柄基團(tuán)是不同的并且其中第一和第二手柄基團(tuán)選擇性偶聯(lián)到包含第一和第二不同官能團(tuán)的第一和第二反應(yīng)配偶體。
本發(fā)明的另一方面涉及產(chǎn)生包含至少兩種不同官能團(tuán)的報(bào)告分子的方法，其包括 (a)從多個(gè)結(jié)構(gòu)單元合成報(bào)告分子，其中至少一個(gè)結(jié)構(gòu)單元包含選自炔基、經(jīng)保護(hù)的炔基、疊氮基、醛基、經(jīng)保護(hù)的醛基、肼基或者羥胺基的第一手柄基團(tuán)，其中至少一個(gè)結(jié)構(gòu)單元包含選自炔基、經(jīng)保護(hù)的炔基、疊氮基、醛基、經(jīng)保護(hù)的醛基、肼基或者羥胺基的第二手柄基團(tuán)，并且其中第一手柄基團(tuán)不同于第二手柄基團(tuán)； (b)在其中第一手柄基團(tuán)是反應(yīng)性并且第二手柄基團(tuán)不是反應(yīng)性的條件下將第一反應(yīng)配偶體與第一手柄基團(tuán)偶聯(lián)，其中第一反應(yīng)配偶體包含第一官能團(tuán)，并隨后 (c)將第二反應(yīng)配偶體與第二手柄基團(tuán)偶聯(lián)，其中第二反應(yīng)配偶體包含第二官能團(tuán)并且其中第一官能團(tuán)不同于第二官能團(tuán)。
本發(fā)明的另一方面涉及檢測(cè)樣品中的分析物的方法，其包括步驟 (a)提供樣品； (b)將樣品與報(bào)告分子接觸，該報(bào)告分子包含至少兩個(gè)不同的官能團(tuán)，其中所述官能團(tuán)通過(guò)包含1，2，3-三唑環(huán)的接頭基團(tuán)結(jié)合至報(bào)告分子， (c)檢測(cè)報(bào)告分子與分析物的相互作用，其表明樣品中分析物的存在和/或量。
本發(fā)明的另一方面是報(bào)告分子，其包含至少兩種不同的官能團(tuán)，其中所述官能團(tuán)通過(guò)包含1，2，3-三唑環(huán)的接頭基團(tuán)結(jié)合至報(bào)告分子。
本發(fā)明的另一方面是式(I)的化合物 C-S-N 其中C是經(jīng)保護(hù)的炔基， S是間隔體或鍵，并且 N是核酸或核酸類似物結(jié)構(gòu)單元，如核苷或核苷酸或非核苷化合物。
本發(fā)明的另一方面是式(II)的化合物 B-S-N3 其中B是生物素或生物素衍生物，如脫硫生物素或氨基生物素， S是間隔體或鍵，并且 N3是疊氮基。
本發(fā)明的另一方面是式(III)的化合物 Q-S-N 其中Q是淬滅基團(tuán)， S是間隔體或鍵，并且 N是疊氮基。
此外，本發(fā)明涉及式(IV)的化合物 Z-S-N 其中Z是醛糖基，其中羥基用?；?或甲硅烷基保護(hù)，或者是經(jīng)保護(hù)或未保護(hù)的1，2二醇基， S是間隔體或鍵，并且 N是核酸或核酸類似物結(jié)構(gòu)單元，如核苷或核苷酸化合物。
此外，本發(fā)明涉及式(V)的化合物 D-S-N 其中D是紅外(IR)染料， S是間隔體或鍵，并且 N是疊氮基。
式(I)-(V)的化合物適于在用于檢測(cè)分析物，尤其如下文詳述的照相方法中用作試劑。
本發(fā)明允許有效產(chǎn)生包含兩種、三種或多種不同官能團(tuán)的報(bào)告分子。這些報(bào)告分子允許高度靈敏地檢測(cè)生物樣品，如臨床樣品、環(huán)境樣品或農(nóng)業(yè)樣品中的分析物，如核酸或核酸結(jié)合蛋白。優(yōu)選的應(yīng)用包括但不限于，檢測(cè)遺傳變異性，例如，單核苷酸多態(tài)性(SNP)、殺蟲(chóng)劑或者藥物抗性、耐受性或者不耐性，基因分型，例如，檢測(cè)生物物種或者株系，檢測(cè)遺傳修飾的生物或者株系，或者檢測(cè)病原體或害蟲(chóng)，和診斷疾病，例如，遺傳疾病、變應(yīng)性疾病、自身免疫病或者感染性疾病。另一優(yōu)選的應(yīng)用是檢測(cè)樣品中的核酸用于商標(biāo)保護(hù)，其中產(chǎn)品，如農(nóng)產(chǎn)品、食品、或者有價(jià)值的商品和/或這些產(chǎn)品的包裝用產(chǎn)品特定信息編碼，例如，但不限于產(chǎn)地、生產(chǎn)日期、經(jīng)銷商，等等，并且其中該信息用如上述的方法和試劑檢測(cè)。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述 本發(fā)明的第一方面涉及報(bào)告分子的生產(chǎn)。報(bào)告分子可以是任一類型的分子，其適于診斷應(yīng)用并且其可以通過(guò)選擇性偶聯(lián)反應(yīng)用至少兩個(gè)，例如，2、3、4或更多不同的官能團(tuán)官能化。例如，報(bào)告分子可以是核酸分子、核酸類似物分子或者肽。優(yōu)選地，從結(jié)構(gòu)單元，例如，單體結(jié)構(gòu)單元，如氨基酸、核苷酸或核苷酸類似物合成報(bào)告分子。合成可以涉及化學(xué)合成，例如，化學(xué)固相合成或者酶促合成，例如，通過(guò)引物延伸進(jìn)行酶促核酸合成。優(yōu)選地，報(bào)告分子包含至少4個(gè)、更優(yōu)選至少6個(gè)，最優(yōu)選至少10個(gè)結(jié)構(gòu)單元。盡管可以使用具有幾百到多至數(shù)千個(gè)結(jié)構(gòu)單元長(zhǎng)度的報(bào)告分子，但是優(yōu)選最多至300個(gè)結(jié)構(gòu)單元。更優(yōu)選地，長(zhǎng)度為多至200，最優(yōu)選多至100個(gè)結(jié)構(gòu)單元。
官能團(tuán)優(yōu)選選自標(biāo)記基團(tuán)，如染料，尤其熒光染料、光敏基團(tuán)、淬滅基團(tuán)和附著基團(tuán)。標(biāo)記基團(tuán)可以是直接標(biāo)記基團(tuán)，即產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的基團(tuán)，或者間接標(biāo)記基團(tuán)，即通過(guò)不同的基團(tuán)引起產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的基團(tuán)。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記基團(tuán)是熒光染料，例如，藍(lán)色、紅色或者綠色熒光染料，如花青染料或者部花青染料。尤其優(yōu)選IR染料。這些染料可以如實(shí)施例18中所述官能化為疊氮化物衍生物。
淬滅基團(tuán)是能夠淬滅從熒光基團(tuán)發(fā)出熒光的基團(tuán)。淬滅基團(tuán)可以選自已知的淬滅基團(tuán)，例如，如參考文獻(xiàn)[12-16]中所述的分子信標(biāo)(Molecular Beacon)報(bào)告分子中的淬滅基團(tuán)。
附著基團(tuán)是通過(guò)高親和力相互作用附著特定結(jié)合配偶體的基團(tuán)。附著基團(tuán)的特定實(shí)例是生物素和生物素衍生物，如脫硫生物素或氨基生物素，或者半抗原，例如，特別能夠與抗體相互作用的低分子量基團(tuán)(例如，分子量≤2000)，如三硝基苯基或肽表位，如FLAG序列。
本發(fā)明包括不同官能團(tuán)與報(bào)告分子的偶聯(lián)。不同的官能團(tuán)優(yōu)選包含至少一個(gè)標(biāo)記基團(tuán)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一官能團(tuán)是標(biāo)記基團(tuán)，第二官能團(tuán)是淬滅基團(tuán)或者附著基團(tuán)。
當(dāng)?shù)谝还倌軋F(tuán)是標(biāo)記基團(tuán)并且第二官能團(tuán)是淬滅基團(tuán)時(shí)，報(bào)告分子可以是分子信標(biāo)(MB)。分子信標(biāo)是單鏈雜交探針，例如，形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的核酸或核酸類似物探針。環(huán)可以含有與靶序列互補(bǔ)的探針序列，通過(guò)位于探針序列任一邊的互補(bǔ)的臂序列的退火形成莖。標(biāo)記基團(tuán)，例如，熒光團(tuán)優(yōu)選連接到臂的末端并且淬滅劑連接到另一臂。當(dāng)分子信標(biāo)在溶液中時(shí)游離的時(shí)候它們不發(fā)熒光。然而，當(dāng)它們與含有靶序列的核酸鏈雜交時(shí)，它們經(jīng)歷構(gòu)象改變，其產(chǎn)生明亮的熒光。分子信標(biāo)報(bào)告分子的長(zhǎng)度優(yōu)選為15-100并且更優(yōu)選20-50個(gè)核苷酸或核苷酸類似物結(jié)構(gòu)單元。
在另一實(shí)施方案中，第一和第二官能團(tuán)是能夠進(jìn)行熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的標(biāo)記基團(tuán)。
本發(fā)明的方法涉及向報(bào)告分子摻入至少兩種不同類型的手柄基團(tuán)，至少兩種不同類型的官能團(tuán)可以偶聯(lián)到所述報(bào)告分子。根據(jù)本發(fā)明，手柄基團(tuán)選自未保護(hù)或經(jīng)保護(hù)的炔基、疊氮基、醛基、經(jīng)保護(hù)的醛基、肼基或者羥胺基，并且其中第一和第二手柄基團(tuán)是不同的。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，手柄基團(tuán)選自炔基，其中第一手柄基團(tuán)是未保護(hù)的炔基并且第二手柄基團(tuán)可以是經(jīng)保護(hù)的炔基或者其中第一手柄基團(tuán)可以是第一經(jīng)保護(hù)的炔基并且第二炔基可以是第二經(jīng)保護(hù)的炔基，其中第一和第二保護(hù)基是不同的并且其中第一保護(hù)基可以從報(bào)告分子選擇性除去而不除去第二保護(hù)基。合適的保護(hù)基是例如如參考文獻(xiàn)[6]中所述的甲硅烷基，尤其是三(烷基/芳基)甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三異丙基甲硅烷基(TIPS)、三苯基甲硅烷基或叔丁基-二甲基甲硅烷基(TBDMS)。甲硅烷基保護(hù)基可以通過(guò)用酸和/或氟化物處理從炔基除去。小的甲硅烷基保護(hù)基如TMS是不穩(wěn)定的并且可以在溫和條件下除去，而較大的甲硅烷基保護(hù)基如TBDMS或TIPS的去除需要更嚴(yán)格的條件。
本發(fā)明的方法包括第一反應(yīng)配偶體與報(bào)告分子上的第一手柄基團(tuán)的選擇性偶聯(lián)，該選擇性偶聯(lián)在第一手柄基團(tuán)未保護(hù)并且從而能夠反應(yīng)而第二手柄基團(tuán)是不反應(yīng)性的，例如，由于存在保護(hù)基的條件下進(jìn)行?？梢酝ㄟ^(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)使用疊氮基使炔基與反應(yīng)配偶體偶聯(lián)，點(diǎn)擊反應(yīng)即疊氮化物與炔基之間的(3+2)環(huán)加成，導(dǎo)致形成1，2，3-三唑環(huán)。點(diǎn)擊反應(yīng)優(yōu)選在銅離子存在下進(jìn)行，例如，使用CuBr、三(1-芐基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)和抗壞血酸鹽。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，手柄基團(tuán)可以選自醛基，尤其選自含有不同類型保護(hù)基的經(jīng)保護(hù)的醛基。醛基可以與肼(H2N-NH)基或羥胺基(NH2-O)反應(yīng)得到腙(-C＝N-NH-)或肟(C＝N-O-)。通過(guò)用還原劑如NaBH4處理可以任選還原CN雙鍵。
優(yōu)選的經(jīng)保護(hù)醛基是乙縮醛或半縮醛基，其可以通過(guò)用酸，如有機(jī)或無(wú)機(jī)酸處理轉(zhuǎn)化為游離醛基。乙縮醛或半縮醛基的優(yōu)選實(shí)例是用多元醇如丙二醇或乙二醇形成的乙縮醛基，或者糖或糖相關(guān)化合物如醛糖(如葡萄糖或半乳糖)中的半縮醛基。經(jīng)保護(hù)的醛基的其他實(shí)例是亞氨基(例如，＝NH基)，其當(dāng)用酸處理時(shí)產(chǎn)生醛基；硫縮醛或二硫縮醛基(例如，C(SR)2基團(tuán)，其中R可以是烷基)，其當(dāng)用汞鹽處理時(shí)得到醛基；肟基(例如，＝NOH基)，其當(dāng)用酸處理時(shí)產(chǎn)生醛基；腙基(例如，＝N-NHR基，其中R可以是烷基)，其當(dāng)用酸處理時(shí)產(chǎn)生醛基；和咪唑啉酮或咪唑烷基或苯并噻唑或二氫苯并噻唑基，其當(dāng)例如用酸水解時(shí)產(chǎn)生醛。
特別優(yōu)選的經(jīng)保護(hù)的醛基是醛糖基，例如，環(huán)狀形式的丙糖、丁糖、戊糖或己糖，其中羥基被合適的保護(hù)基，尤其酰基或甲硅烷基保護(hù)。?；Ｗo(hù)基，例如，乙?；?、丁?；?、新戊?；蚱渌咀搴?或芳香族羧酸保護(hù)基可以在堿性條件下除去。通過(guò)用酸和/或氟化物處理可以除去甲硅烷基。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)保護(hù)的醛基是經(jīng)保護(hù)或不經(jīng)保護(hù)的1，2二醇基，其可以與氧化劑如NaIO4反應(yīng)產(chǎn)生游離醛基。
本發(fā)明也允許向報(bào)告分子中摻入兩個(gè)以上不同的手柄基團(tuán)。在該情況中，第一手柄基團(tuán)可以是未保護(hù)的基團(tuán)炔基。第二手柄基團(tuán)可以第一經(jīng)保護(hù)的基團(tuán)，例如，第一經(jīng)保護(hù)的炔基，其可以在第一去保護(hù)條件下切除。第三手柄基團(tuán)可以是第二經(jīng)保護(hù)的基團(tuán)，例如，第二經(jīng)保護(hù)的炔基，其在導(dǎo)致第一經(jīng)保護(hù)的基團(tuán)去保護(hù)的第一去保護(hù)條件下是穩(wěn)定的并且可以在與第一去保護(hù)條件不同的第二去保護(hù)條件下被切除。第一和第二去保護(hù)基團(tuán)的特定實(shí)例是TMS和TIPS。TMS可以在溫和的酸性條件下，例如1％乙酸中被切除。TIPS在這些條件下是穩(wěn)定的并且可以通過(guò)氟化物處理，例如用乙腈/DMF中的正叔丁基氟化銨(TBAF)處理而被切除。
報(bào)告分子的合成可以包括化學(xué)合成(例如，

圖17)或者酶促合成(例如，圖18)。優(yōu)選地，合成是化學(xué)合成，例如，化學(xué)固相合成，其中通過(guò)在結(jié)合至固相時(shí)逐步裝配結(jié)構(gòu)單元合成報(bào)告分子。第一反應(yīng)配偶體和第二反應(yīng)配偶體以及任選地其他反應(yīng)配偶體的連續(xù)偶聯(lián)可以在化學(xué)合成方法期間在不同的步驟發(fā)生。例如，至少第一反應(yīng)配偶體可以是偶聯(lián)的，同時(shí)報(bào)告分子結(jié)合至固相。在該情況下，可以發(fā)生第二反應(yīng)配偶體和任選地其他反應(yīng)配偶體的偶聯(lián)，同時(shí)報(bào)告分子也仍然結(jié)合至固相或者在報(bào)告分子從固相切割后發(fā)生所述偶聯(lián)。另一方面，在報(bào)告分子從固相切除后第一反應(yīng)配偶體在溶液中偶聯(lián)也是可能的。在該情況下，其他反應(yīng)配偶體的逐步去保護(hù)和偶聯(lián)也在溶液中發(fā)生。
本發(fā)明的另一方面涉及使用報(bào)告分子檢測(cè)樣品中分析物的方法，所述報(bào)告分子包含兩種不同的官能團(tuán)，其中所述官能團(tuán)通過(guò)包含1，2，3-三唑環(huán)的接頭基團(tuán)結(jié)合至報(bào)告分子。這些接頭基團(tuán)導(dǎo)致進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)，其涉及通過(guò)炔基和疊氮基之間的點(diǎn)擊反應(yīng)將至少兩種不同的官能團(tuán)偶聯(lián)到報(bào)告分子的主鏈。
檢測(cè)可以是定性檢測(cè)，例如，測(cè)定待分析的樣品中分析物，例如特定核酸序列的存在或不存在。然而，本發(fā)明也允許定量檢測(cè)分析物，例如，待分析的樣品中的核酸序列。定性和/或定量檢測(cè)可以包括根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定標(biāo)記基團(tuán)。
待檢測(cè)的分析物優(yōu)選選自核酸和結(jié)合核苷、核苷酸或核酸的分子，例如，結(jié)合核苷、核苷酸或核酸的蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，分析物是核酸，例如，可以根據(jù)已知的技術(shù)，尤其根據(jù)雜交技術(shù)檢測(cè)的任一類型的核酸。例如，核酸分析物可以選自DNA，例如，雙鏈或單鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交體。核酸分析物的具體實(shí)例是基因組DNA、mRNA或從其衍生的產(chǎn)物，例如，cDNA。此外，核酸分析物可以是DNA片段，其通過(guò)連接酶從許多、例如兩個(gè)子片段連接得到。
可以根據(jù)適于檢測(cè)樣品中分析物，尤其核酸分析物的任何已知的測(cè)試形式進(jìn)行本發(fā)明的方法。例如，該方法可以涉及檢測(cè)固定在固體表面，如膜，例如，在Southern或Northern印跡、芯片、陣列或者如小珠的顆粒上的分析物。此外，可以在凝膠中，例如在電泳分離凝膠中的樣品中后，例如在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行檢測(cè)。該方法可以涉及檢測(cè)單一分析物或者平行地檢測(cè)多種分析物，例如，以芯片或微陣列形式進(jìn)行檢測(cè)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測(cè)涉及在懷疑含有分析物的樣品和報(bào)告分子的存在下，照射光敏介質(zhì)，所述報(bào)告分子包含光敏劑標(biāo)記基團(tuán)，例如，熒光基團(tuán)，其能夠?qū)崿F(xiàn)能量向光敏介質(zhì)的轉(zhuǎn)移，其中在該介質(zhì)中可以形成標(biāo)記物基團(tuán)。優(yōu)選地，使用報(bào)告分子，其中不存在分析物時(shí)，光敏基團(tuán)被淬滅。存在分析物時(shí)，光敏基團(tuán)的淬滅被減小或消除。
由于高度靈敏性，本發(fā)明的方法適于不用擴(kuò)增而直接檢測(cè)分析物。根據(jù)本發(fā)明，甚至在不擴(kuò)增的情況下測(cè)定微量的分析物，例如核酸，例如，0.1ng或更低，優(yōu)選0.01ng或更低，更優(yōu)選1pg或更低，甚至更優(yōu)選0.1pg或更低，甚至更優(yōu)選0.01pg或更低，最優(yōu)選0.001pg或更低。通過(guò)向報(bào)告分子摻入多個(gè)標(biāo)記基團(tuán)可以得到特別高的靈敏度。例如，通過(guò)組合Southern印跡和本發(fā)明方法可以進(jìn)行生物樣品中分析物，如基因的檢測(cè)。然而，應(yīng)該注意到，本發(fā)明的方法也允許與擴(kuò)增步驟組合檢測(cè)核酸，擴(kuò)增步驟可以根據(jù)已知的方案如PCR或其修飾方案，如不對(duì)稱PCR、實(shí)時(shí)PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR等等或者其他擴(kuò)增方案如LCR進(jìn)行。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，進(jìn)行分析物的序列特異性檢測(cè)，其中例如，具有特定序列的核酸與樣品中的其他核酸序列區(qū)分或者能夠結(jié)合特定核酸序列的多肽與樣品中的其他多肽區(qū)分。此類序列特異性檢測(cè)優(yōu)選包括序列特異性雜交反應(yīng)，通過(guò)該反應(yīng)，待檢測(cè)的核酸序列與攜帶標(biāo)記物基團(tuán)或標(biāo)記物前體基團(tuán)的化合物結(jié)合。然而，應(yīng)該注意到，本發(fā)明也允許序列非特異性檢測(cè)核酸，例如，檢測(cè)樣品中存在的任何核酸。
手柄基團(tuán)連接到適于合成報(bào)告分子的結(jié)構(gòu)單元。優(yōu)選地，手柄基團(tuán)連接到，核堿基可以選自天然的和非天然的嘌呤和嘧啶堿基。優(yōu)選地，核堿基選自胞苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥(niǎo)嘌呤、次黃苷和黃嘌呤。手柄基團(tuán)優(yōu)選連接到嘧啶核堿基的5或6位，優(yōu)選5位，或者連接到嘌呤核堿基的7或8位，優(yōu)選7位，尤其如果希望酶促摻入到核酸的情況下。
備選地，手柄基團(tuán)也連接到核苷酸結(jié)構(gòu)單元的磷酸或糖基。
此外，本發(fā)明也允許攜帶手柄基團(tuán)的非核苷結(jié)構(gòu)單元摻入到報(bào)告分子。優(yōu)選具有通式(V)的非核苷結(jié)構(gòu)單元
其中 A是經(jīng)保護(hù)或未保護(hù)的炔基， S1和S2在每種情況下獨(dú)立地為非核苷基團(tuán)，例如，間隔體或鍵，并且例如S1是如下定義的間隔體并且S2是共價(jià)鍵， P是磷酸或磷酸類似物基團(tuán)，例如，亞磷酰胺基團(tuán)， R是用于核酸合成的偶聯(lián)基團(tuán)，例如，二甲氧基三苯甲基(DMT)基團(tuán)。
手柄基團(tuán)可以共價(jià)連接到結(jié)構(gòu)單元，例如通過(guò)直接的鍵或者間隔體，例如具有多至20個(gè)原子的鏈長(zhǎng)的間隔體連接到結(jié)構(gòu)單元。間隔體可以是柔性間隔體，例如，基于亞烷基的間隔體，任選含有雜原子，如O、S和/或N或者至少部分剛性間隔體，例如，包含至少一個(gè)剛性基團(tuán)的間隔體，其選自烯基、炔基、環(huán)狀基團(tuán)，尤其芳族或雜芳族基團(tuán)，并且環(huán)脂肪族基團(tuán)和其組合。如果結(jié)構(gòu)單元化合物包含炔或疊氮化物，那么優(yōu)選通過(guò)直接的鍵、柔性間隔體或部分剛性間隔體進(jìn)行官能團(tuán)的附著，其中柔性間隔體可以例如具有多至6個(gè)原子、更尤其多至4個(gè)原子的鏈長(zhǎng)，并且其中部分剛性間隔體優(yōu)選具有多至20個(gè)原子，例如，多至10個(gè)原子的鏈長(zhǎng)并且包含如上文定義的至少一個(gè)剛性基團(tuán)，尤其是炔基，和至少一個(gè)柔性基團(tuán)，例如，亞烷基。如果另一方面，手柄基團(tuán)是醛基或經(jīng)保護(hù)的醛基或醛基前體基團(tuán)，那么通過(guò)如上文定義的部分剛性間隔體或者具有2到10個(gè)原子鏈長(zhǎng)的至少部分剛性間隔體連接是優(yōu)選的。含有剛性基團(tuán)的間隔體，例如部分剛性間隔體的結(jié)構(gòu)是優(yōu)選的，使得剛性基團(tuán)直接連接到核堿基。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“核苷酸”特別涉及核糖核苷酸、2’-脫氧核糖核苷酸或2’，3’-二脫氧核糖核苷酸。核苷酸類似物可以選自糖或骨架修飾的核苷酸，尤其可以是酶促摻入核酸的核苷酸類似物。在優(yōu)選的糖修飾的核苷酸中，核糖糖的2’-OH或H基被選自O(shè)R、R、鹵素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基團(tuán)取代，其中R是C1-C6烷基、烯基或炔基并且鹵素是F、Cl、Br或I。核糖自身可以被其他碳環(huán)或雜環(huán)5或6元基團(tuán)如環(huán)戊烷或環(huán)己烷基團(tuán)取代。在優(yōu)選的骨架修飾的核苷酸中，磷酸(三)酯基團(tuán)可以被修飾基團(tuán)，例如，被硫代磷酸基團(tuán)或者H-膦酸基團(tuán)取代。進(jìn)一步優(yōu)選的核苷酸類似物包括用于合成核酸類似物如嗎啉代核酸、肽核酸或鎖核酸(locked nucleic acid)的結(jié)構(gòu)單元。
官能化的核酸可以是寡核苷酸，例如，具有多至30個(gè)核苷酸(或核苷酸類似物)結(jié)構(gòu)單元長(zhǎng)度的核酸，或者具有或大于30個(gè)核苷酸(或核苷酸類似物)結(jié)構(gòu)單元長(zhǎng)度的多核苷酸。優(yōu)選地，核酸和核酸類似物能夠特異結(jié)合分析物，例如能夠在測(cè)定條件下與核酸分析物雜交。最小長(zhǎng)度優(yōu)選為12并且更優(yōu)選為14個(gè)核苷酸(或核苷酸類似物)結(jié)構(gòu)單元。
通過(guò)用于化學(xué)合成的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和/或通過(guò)酶促摻入可以向核酸中摻入結(jié)合至核酸或核酸類似物結(jié)構(gòu)單元的手柄基團(tuán)。例如，在標(biāo)準(zhǔn)合成方案中使用經(jīng)修飾的核苷亞磷酰胺作為結(jié)構(gòu)單元，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)可以進(jìn)行化學(xué)合成。用于化學(xué)合成的其他類型的優(yōu)選結(jié)構(gòu)單元包括H-膦酸或磷酸三酯修飾的核苷。
另一方面，通過(guò)酶促方法可以向核酸中摻入經(jīng)修飾的核苷酸。令人驚奇地，發(fā)現(xiàn)手柄修飾的核苷三磷酸被核酸合成酶接受為酶底物，所述酶為諸如DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或端粒酶。例如，發(fā)現(xiàn)經(jīng)修飾的核苷三磷酸被常用于引物延伸和擴(kuò)增方案的DNA聚合酶接受，所述DNA聚合酶為諸如熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，如Taq聚合酶、Vent聚合酶、Pfx聚合酶、Pwo聚合酶或Therminator聚合酶。酶接受經(jīng)修飾的三磷酸酯而不喪失保真性并且允許基于模板摻入核酸，如DNA和RNA。
本發(fā)明的方法提供了分析物檢測(cè)的多種實(shí)施方案。例如，可以提供酶促摻入核酸分子中的經(jīng)修飾的核酸結(jié)構(gòu)單元，例如，核苷酸或核苷酸類似物，以及合適的酶。在本發(fā)明中，可以使用多種不同類型的官能化核苷酸。
通過(guò)任何已知的核酸檢測(cè)方案，例如，涉及使用固相支持體的方案進(jìn)行本發(fā)明的檢測(cè)方法。例如，可以提供固相支持體，例如，芯片或陣列或如小珠的顆粒物質(zhì)，能夠與待檢測(cè)的分析物雜交的捕獲探針與所述固相支持體結(jié)合。可以如下檢測(cè)固相結(jié)合的核酸分析物使用官能化的雜交探針，其作為捕獲探針與核酸分析物在不同序列部分中雜交，并隨后例如用金屬化試劑檢測(cè)結(jié)合的雜交探針。該方法尤其適于農(nóng)業(yè)和臨床領(lǐng)域中的診斷應(yīng)用，例如用于檢測(cè)來(lái)自植物，例如，遺傳經(jīng)修飾的植物的DNA和/或mRNA，來(lái)自病原體或植物害蟲(chóng)等的DNA，或者用于商標(biāo)保護(hù)。
在特定實(shí)施方案中，檢測(cè)可以涉及將分析物與包含光敏基團(tuán)的報(bào)告分子的聯(lián)合產(chǎn)物與光敏介質(zhì)接觸，例如，通過(guò)點(diǎn)樣、移液等等轉(zhuǎn)移樣品或樣品等分試樣，其中聯(lián)合產(chǎn)物可以存在于光敏介質(zhì)上。照射時(shí)，實(shí)現(xiàn)能量從光敏基團(tuán)向光敏介質(zhì)的轉(zhuǎn)移，使得在光敏基團(tuán)存在下而不是缺失時(shí)，在光敏介質(zhì)中形成標(biāo)記物基團(tuán)如金屬，如銀核。如果必要，標(biāo)記物基團(tuán)可以根據(jù)照相技術(shù)進(jìn)行顯影步驟，例如，化學(xué)或光化學(xué)顯影步驟。光敏介質(zhì)可以是能夠形成標(biāo)記物基團(tuán)，如金屬核的任何固相支持體或任何受支持的材料。
優(yōu)選地，光敏介質(zhì)是光敏感介質(zhì)，如光敏紙或者支持材料上的光敏乳劑或凝膠劑。更優(yōu)選地，光敏介質(zhì)是照相介質(zhì)，如曬像紙。在例如照射光的波長(zhǎng)和/或強(qiáng)度的條件下進(jìn)行照射，在所述條件下在光敏基團(tuán)存在下發(fā)生選擇性標(biāo)記物基團(tuán)形成。優(yōu)選地，取決于介質(zhì)的靈敏性，用紅外線和/或用長(zhǎng)波可見(jiàn)光進(jìn)行照射。對(duì)于可見(jiàn)光，照射波長(zhǎng)可以為例如500nm或更高，520nm或更高，540nm或更高，560nm或更高，580nm或更高，或?qū)τ诩t外線，照射波長(zhǎng)可以為700nm到10μm。
本發(fā)明的方法包括檢測(cè)標(biāo)記基團(tuán)。標(biāo)記基團(tuán)可以優(yōu)選選自形成金屬沉積物的基團(tuán)(例如，醛官能化基團(tuán))，熒光或形成熒光的基團(tuán)，或者氧化還原活性基團(tuán)。
金屬沉積物的形成需要用金屬化試劑處理醛基，所述金屬化試劑為例如包含選自Ag、Au、Bi、Cu、Pd或Pt的金屬原子和/或離子的試劑，所述金屬原子和/或離子可以例如通過(guò)還原選擇性沉積在醛基周圍。優(yōu)選地，金屬化試劑包含Ag+鹽，如Ag-銨絡(luò)合物，即Tollens試劑。金屬化試劑的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)例是Cu(NO3)/I2、鉑三聯(lián)吡啶絡(luò)合物，如[Pt(三聯(lián)吡啶)Cl]Cl、Pd(OAc)2或KAuCl4。
可以根據(jù)已知的方法進(jìn)行標(biāo)記物基團(tuán)的檢測(cè)。例如，通過(guò)光學(xué)方法和/或電學(xué)方法可以定性和/或定量測(cè)定金屬沉積物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)量電學(xué)參數(shù)，例如，電導(dǎo)率來(lái)測(cè)定固相表面上的金屬沉積物。通過(guò)已知的熒光測(cè)量方法，例如，通過(guò)合適的光源如激光激發(fā)并檢測(cè)發(fā)生的熒光來(lái)定性和/或定量測(cè)定熒光標(biāo)記物基團(tuán)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括檢測(cè)在光敏基團(tuán)存在下在光敏介質(zhì)中位點(diǎn)特異性形成的標(biāo)記物基團(tuán)。光敏基團(tuán)優(yōu)選選自熒光或發(fā)光基團(tuán)。光敏介質(zhì)包含這樣的基團(tuán)，其當(dāng)在光敏基團(tuán)存在下照射時(shí)形成可檢測(cè)的標(biāo)記物基團(tuán)，如金屬核，所述標(biāo)記物基團(tuán)可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)照相技術(shù)，如通過(guò)化學(xué)或光化學(xué)顯影技術(shù)進(jìn)行顯影。
此外，本發(fā)明涉及核酸或核酸類似物結(jié)構(gòu)單元與經(jīng)保護(hù)的炔基任選通過(guò)如式(I)所示的分子連接的綴合物。優(yōu)選地，間隔體具有3-10個(gè)原子的鏈長(zhǎng)。此外，優(yōu)選間隔體包含內(nèi)部剛性基團(tuán)，例如，炔基。經(jīng)保護(hù)的炔基優(yōu)選為如上述的甲硅烷基保護(hù)的炔基。
此外，本發(fā)明涉及生物素或生物素衍生物如脫硫生物素或氨基生物素與疊氮基任選通過(guò)如式(II)所示的間隔體連接的綴合物。間隔體優(yōu)選具有1-10個(gè)原子的鏈長(zhǎng)。
此外，本發(fā)明涉及淬滅劑基團(tuán)與核酸或核酸類似物結(jié)構(gòu)單元任選通過(guò)如式(III)所示間隔體連接的綴合物。間隔體優(yōu)選具有3-10個(gè)原子的鏈長(zhǎng)并且可以包含內(nèi)部剛性基團(tuán)，如炔基。
此外，本發(fā)明涉及經(jīng)保護(hù)的醛糖基或者經(jīng)保護(hù)的或未保護(hù)的1，2二醇基與核酸或核酸類似物結(jié)構(gòu)單元任選通過(guò)如式(IV)所示間隔體連接的綴合物，所述醛糖基中醛糖的羥基優(yōu)選用?；?或甲硅烷基保護(hù)。?；蚣坠柰榛Ｗo(hù)基優(yōu)選如上述。
間隔體優(yōu)選具有3-10個(gè)原子的鏈長(zhǎng)并且優(yōu)選包含剛性基團(tuán)，例如，炔基。
本發(fā)明還涉及式(I)、式(II)、式(III)以及式(IV)的化合物。這些化合物尤其可用于標(biāo)記核酸，尤其是DNA或RNA。使用這些化合物，一個(gè)、優(yōu)選至少兩個(gè)官能團(tuán)與分子的連接是可能的?；衔镉绕淇捎糜贒NA純化，例如，使用生物素標(biāo)記，用于DNA-微陣列，用于DNA-芯片，用于實(shí)時(shí)PCR以及用于RNAi實(shí)驗(yàn)和用于定位細(xì)胞中的DNA。
通過(guò)下面的實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)述 圖1用于DNA的合成后標(biāo)記的經(jīng)修飾的脫氧核糖核苷酸。
圖2通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)的DNA官能化。
圖3通過(guò)順序點(diǎn)擊反應(yīng)的DNA官能化。
圖4合成炔官能化的2’-脫氧尿苷三磷酸和亞磷酰胺。
圖5合成炔官能化的2’-脫氧胞苷三磷酸和兩種亞磷酰胺。
圖6合成炔官能化的2’-脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸。
圖7PAGE凝膠電泳(Vent exo-，0.5mM Mg2+，50mM TMAC)。泳道1100bp DNA序列梯，泳道2天然的289bp片段，泳道3與2相同，所有胸苷都是經(jīng)修飾的，泳道4所有胸苷和胞苷都是經(jīng)修飾的。
圖8對(duì)DNA的點(diǎn)擊反應(yīng)。
圖9反應(yīng)順序，產(chǎn)生共價(jià)連接到兩個(gè)不同分子(R1-R2)的寡核苷酸。
圖10糖修飾的核苷酸結(jié)構(gòu)單元。
圖11合成環(huán)狀二醇官能化的尿苷三磷酸和亞磷酰胺。
圖12醛的NaIO4-去保護(hù)。
圖13炔修飾的胸苷和胞苷結(jié)構(gòu)單元。
圖14疊氮化物結(jié)構(gòu)單元。芐基疊氮35、香豆素疊氮36、生物素疊氮37、蒽醌疊氮38、半乳糖疊氮39、dabcyl疊氮40、芘疊氮41、熒光素疊氮42、TAMRA疊氮43、Cy3疊氮44。
圖15用dabcyl疊氮40和香豆素疊氮36修飾的寡核苷酸ODN-3的初步HPLC跡線(260nm)(表2，條目10)和MALDI譜(插圖)。
圖16非核苷DNA修飾劑13和14。
圖17固相合成后通過(guò)順序點(diǎn)擊反應(yīng)進(jìn)行核酸官能化的圖示。
圖18PCR后通過(guò)順序點(diǎn)擊反應(yīng)進(jìn)行核酸官能化的圖示。
實(shí)施例 1.合成經(jīng)修飾的核苷酸結(jié)構(gòu)單元 可以以短而有效的反應(yīng)順序?qū)崿F(xiàn)合成如圖1中所示的作為三磷酸和作為亞磷酰胺的核苷酸結(jié)構(gòu)單元1-5。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案可以在標(biāo)準(zhǔn)固相化學(xué)中使用這些亞磷酰胺進(jìn)行DNA合成，只是對(duì)于經(jīng)修飾的結(jié)構(gòu)單元偶聯(lián)時(shí)間延長(zhǎng)。通過(guò)PCR摻入三磷酸在實(shí)施例6中描述。這些結(jié)構(gòu)單元可以用于通過(guò)如圖2所示的點(diǎn)擊化學(xué)官能化報(bào)告分子，尤其DNA分子。如圖3所示，可以通過(guò)順序點(diǎn)擊反應(yīng)摻入不同的官能團(tuán)。
2.合成攜帶炔手柄基團(tuán)的2’-脫氧尿苷衍生物 炔官能化的2’-脫氧尿苷衍生物的合成在圖4中圖示。它用可商購(gòu)的5-2’-脫氧碘代尿苷6開(kāi)始。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)-Sonogashira-去保護(hù)順序，使用1-三甲基甲硅烷基-1，7-辛二烯在Sonogashira交叉偶聯(lián)中導(dǎo)入容易官能化的接頭，可以得到游離的、官能化的核苷8。使用標(biāo)準(zhǔn)方法可以得到亞磷酰胺9。通過(guò)Yoshikawa的磷酸化方法可以制備三磷酸10[7]。
3.合成攜帶炔或甲硅烷基保護(hù)的炔手柄基團(tuán)的2’-脫氧胞苷衍生物 通過(guò)對(duì)未保護(hù)的和可商購(gòu)的5-碘代-2’-脫氧胞苷進(jìn)行Sonogashira交叉偶聯(lián)可以制備容易官能化的、游離的核苷12。用銨處理可以除去TMS基團(tuán)。以逐步方式制備N4-苯甲?；Ｗo(hù)的亞磷酰胺13。通過(guò)兩步LudwigEckstein方法[8]制備三磷酸14。在Sonogashira交叉偶聯(lián)后，通過(guò)簡(jiǎn)單地省略TMS去保護(hù)步驟得到帶有TMS保護(hù)的炔的亞磷酰胺16。反應(yīng)方案在圖5中顯示。通過(guò)類似方法，可以得到攜帶TIPS保護(hù)的炔基的亞磷酰胺。
4.合成攜帶炔手柄基團(tuán)的2’-脫氧鳥(niǎo)苷衍生物 17的合成按照Froehler等人的合成方法[9]。Sonogashira交叉偶聯(lián)、總體去保護(hù)和Yoshikawa方法的磷酸化[7]的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)順序得到三磷酸18。反應(yīng)方案在圖6中顯示。
5.合成攜帶炔手柄基團(tuán)的2’-脫氧腺苷衍生物 經(jīng)修飾的2’-脫氧腺苷衍生物4的合成與脫氧鳥(niǎo)苷衍生物的合成非常類似。它非常類似于Froehler等人的工作[9]。類似于鳥(niǎo)苷合成，成功地進(jìn)行了Sonogashira交叉偶聯(lián)。最后的步驟類似于對(duì)衍生物18所述的。
6.通過(guò)PCR摻入核苷三磷酸 通過(guò)引物延伸進(jìn)行結(jié)構(gòu)單元1和2向289mer DNA鏈的同時(shí)摻入。對(duì)于2的三磷酸實(shí)現(xiàn)了最佳的摻入效率。使用的聚合酶是來(lái)自B族的Vent exo-和Pwo。在高密度修飾的情況下，添加劑(DMSO、甲酰胺、TMAC、甜菜堿)的加入變得必須。通過(guò)PAGE凝膠電泳可以顯示不同水平的炔修飾。圖7中的泳道2-4顯示了炔向DNA中增加摻入的效果。所觀察到的偏移是由于DNA鏈的分子量的提高。
7.合成后官能化 如引言中概述的，合成后標(biāo)記策略的主要優(yōu)點(diǎn)是可能向DNA中引入不穩(wěn)定的或反應(yīng)性的部分。待附著到DNA的分子僅僅必須攜帶疊氮化物以便用于點(diǎn)擊反應(yīng)中。該方法是高度模塊化的并且因此可以被改變而不需要精心合成。
點(diǎn)擊反應(yīng)已經(jīng)成功地用于在高密度水平官能化DNA。接頭具有足夠柔性以允許甚至通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)摻入六個(gè)連續(xù)的修飾，如在一行中帶有六個(gè)炔修飾的堿基的短寡核苷酸修飾中所示。反應(yīng)在水和氧的存在下進(jìn)行并且不需要任何復(fù)雜的設(shè)備。Cu(I)是活性催化物并且可以通過(guò)配體穩(wěn)定化。反應(yīng)方案在圖8中顯示。
8.逐步官能化的策略 8.1一般考慮 使用上述方法可以制備用于合成后修飾的含有兩個(gè)接頭的DNA。通過(guò)PCR制備的DNA不連接到樹(shù)脂并且在核堿基上不含有任何保護(hù)基并且可以以如圖9中所示的直接方式官能化。
未保護(hù)的炔可以用R1-N3進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)。TMS保護(hù)的炔在測(cè)試反應(yīng)中顯示出對(duì)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)擊反應(yīng)條件的足夠穩(wěn)定性。TMS-炔基可以用TBAF去保護(hù)，從而釋放游離炔。另一疊氮化物R2-N3然后可以在第二點(diǎn)擊反應(yīng)中連接到DNA。
通過(guò)固相亞磷酰胺化學(xué)制備的DNA附著到樹(shù)脂并且在核堿基上攜帶堿基不穩(wěn)定的保護(hù)基。使用H2O/MeOH中的氨可以將TMS-炔基去保護(hù)。然而，15中甲硅烷基的制備使用的去保護(hù)(圖5)需要2-4天才完成。該顯著的穩(wěn)定性可以用于從樹(shù)脂選擇性切除DNA和/或去保護(hù)核堿基而不用去保護(hù)大量的經(jīng)修飾的炔，例如，TMS-炔。原則上，有三種方法可以處理該問(wèn)題，其將在下文中提出。
8.2特定方案 例如，使用Expedite DNA合成儀(Applied Biosystems)或在Amersham Biosciences的

Oligopilot上，通過(guò)DMT-和β-(氰乙基)亞磷酰胺方法在CPG支持體(500

)上制備寡核苷酸(ODN)。為偶聯(lián)經(jīng)修飾的堿基，使用雙偶聯(lián)方案(每個(gè)10當(dāng)量)并且將偶聯(lián)時(shí)間延長(zhǎng)到10分鐘。作為活化劑，苯甲基硫代四唑(BTT)得到最佳的偶聯(lián)產(chǎn)率。自動(dòng)化合成后，通過(guò)在25℃下浸入濃氨水/乙醇溶液(3∶1)中24小時(shí)從固相支持體切除ODN。在SpeedVac中除去氨水，并通過(guò)RP-HPLC純化粗ODN。UV/Vis光譜和MALDI-TOF質(zhì)譜法用于表征ODN。
9.樹(shù)脂上的點(diǎn)擊化學(xué) 9.1一般考慮 可以在樹(shù)脂上進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)[10]。在第一官能團(tuán)R1附著到DNA時(shí)，使用氨可以在延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)一步實(shí)現(xiàn)TMS-基團(tuán)(核堿基保護(hù)基)的總體去保護(hù)和樹(shù)脂的切除。此時(shí)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)擊反應(yīng)可以引入第二官能團(tuán)R2。在該方法中，R1必須是堿基穩(wěn)定的分子。
9.2特定方案 例如，DNA合成后在高真空下干燥CPG樹(shù)脂上的約0.02μmol的DNA并將其與20μL芐基疊氮35一起置于1.5mL瓶中。在單獨(dú)的瓶中，將40μL CuBr溶液(DMSO/t BuOH 3∶1中10mM)，10μL抗壞血酸鈉(水中100mM)和80μL配體溶液(DMSO/tBuOH 3∶1中10mM)進(jìn)行渦旋并加入到DNA中。將反應(yīng)瓶輕輕旋轉(zhuǎn)過(guò)夜，離心并且小心取出并丟棄溶液。通過(guò)加入溶劑(2×DMSO，2×H2O，2×乙醇)、渦旋、離心并丟棄該溶液反復(fù)洗滌樹(shù)脂。隨后如上述將DNA去保護(hù)。
10.第一點(diǎn)擊反應(yīng)前的總體DNA去保護(hù) 在第一點(diǎn)擊反應(yīng)前(氨，12h)可以對(duì)DNA核堿基去保護(hù)并從樹(shù)脂切除所述鏈。TMS-炔對(duì)去保護(hù)條件的穩(wěn)定性應(yīng)該足夠高以使其多數(shù)保持完整形式。必須進(jìn)行HPLC純化以除去含有去保護(hù)的TMS-炔位點(diǎn)的DNA。從這點(diǎn)向前，可以使用圖9概述的合成。
11.從樹(shù)脂單獨(dú)切除 11.1一般考慮 從樹(shù)脂切除DNA后，也可以不去除保護(hù)基而在溶液中進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)。
DNA與樹(shù)脂的連接在堿性條件下的穩(wěn)定性低于核堿基保護(hù)基的穩(wěn)定性。從而，可以通過(guò)用氨處理30分鐘從樹(shù)脂切除DNA。該處理后，將核堿基部分去保護(hù)，TMS-炔基應(yīng)該保持幾乎定量。必須將該復(fù)雜混合物進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)，引入R1。此時(shí)，可以在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)用氨處理DNA，導(dǎo)致核堿基和TMS-炔的總體去保護(hù)。該步驟釋放第二點(diǎn)擊位點(diǎn)，其可以與R2-N3反應(yīng)。
11.2具體方案 將DNA(0.38μM，200μL)和疊氮化物(10mM，114μL)置于1.5mL瓶中。在第二個(gè)瓶中，對(duì)17μL CuBr溶液(DMSO/t BuOH 3∶1中100mM)和34μL配體溶液(DMSO/tBuOH 3∶1中100mM)進(jìn)行渦旋并加入DNA中。將該溶液在25℃搖動(dòng)4h并在SpeedVac中蒸發(fā)至接近干燥。加入乙酸鈉溶液(0.3M，100μL)并將懸浮液靜置1h，偶爾渦旋。加入1mL乙醇，將瓶子渦旋并置于冰箱(-20℃)中過(guò)夜。離心(13000rpm 15分鐘)后，從DNA沉淀小心地去除上清液。加入70％乙醇(-20℃)，渦旋小瓶，離心并除去上清液。重復(fù)該洗滌步驟兩次。最后一次洗滌步驟后，將沉淀物風(fēng)干并優(yōu)選用水或緩沖液吸收。
11.3TIPS-炔基的去保護(hù) 將凍干的DNA溶于無(wú)水乙腈(400μL)和無(wú)水DMF(100μL)中。加入兩滴TBAF(THF中1.0M)并將溶液在45℃搖動(dòng)2h。用MeOTMS(10μL)淬滅過(guò)量的氟離子。如果將對(duì)DNA鏈進(jìn)行額外的點(diǎn)擊反應(yīng)，那么應(yīng)該如下將有機(jī)溶劑交換成水在SpeedVac中蒸發(fā)反應(yīng)液至接近干燥，加入水(1mL)，冷凍溶液，凍干，并用適量水吸收。
12.糖修飾的結(jié)構(gòu)單元的合成 已經(jīng)成功地將三磷酸22-26摻入DNA中。也已經(jīng)合成了23的對(duì)應(yīng)的亞磷酰胺并將其摻入DNA中?；衔?6中的乙酰基保護(hù)的糖引起在聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)修飾的DNA的有效染色，因?yàn)楸Ｗo(hù)基在Tollens處理?xiàng)l件下被切除。丙酮化合物保護(hù)的糖24和25需要在酸性條件下去保護(hù)。初步實(shí)驗(yàn)表明乙縮醛保護(hù)基的切割是可行的，不引起DNA的脫嘌呤作用。
在下文中，詳細(xì)給出了環(huán)狀二醇修飾的核苷酸的示例性合成。
用環(huán)狀二醇修飾的尿苷三磷酸31的合成用已知的化合物27開(kāi)始[11]。關(guān)鍵步驟是吡咯啉雙鍵的Sharpless鄰位二羥基化。根據(jù)已知的方法，從中間體30可以合成亞磷酰胺32。
13.通過(guò)PCR摻入核苷三磷酸 通過(guò)PCR可以向DNA中摻入所有五種給出的核苷酸。核苷酸26甚至摻入到2000bp鏈中。迄今用核苷酸26得到的結(jié)果開(kāi)啟了任何目的基因的有效銀染的方法。原則上，應(yīng)該可能合成用末端二醇修飾的胞苷從而實(shí)現(xiàn)DNA中每個(gè)堿基對(duì)的醛官能化。
通過(guò)酶促合成(例如PCR)摻入三磷酸并且三元點(diǎn)擊反應(yīng)在圖18中示例。使用的優(yōu)選的聚合酶是來(lái)自B族的Vent exo-和Pwo。在高密度修飾的情況下，添加劑(DMSO、甲酰胺、TMAC和/或甜菜堿)的加入是優(yōu)選的。通過(guò)PAGE凝膠電泳可以顯示不同水平的炔修飾。
14.合成后官能化 如具有二醇修飾的尿嘧啶的DNA鏈的化學(xué)修飾所示，可以在溫和條件下用NaIO4處理所得鏈，得到二醇部分的溫和切割，而無(wú)任何可觀察到的副反應(yīng)。通過(guò)MALDI，以及通過(guò)用二硝基苯肼的清潔偶聯(lián)反應(yīng)(clean coupling reaction)，可以表征帶有醛的鏈。已經(jīng)進(jìn)行了長(zhǎng)的二醇修飾的DNA鏈的切割，并且消化研究已經(jīng)表明切割與短寡核苷酸中一樣有效地進(jìn)行。在帶有醛的DNA與含有肼的染料的偶聯(lián)中已經(jīng)得到了初步結(jié)果，證明了高碘酸切割的有效性。
對(duì)于含糖DNA鏈的情況，消化實(shí)驗(yàn)也表明向DNA的有效摻入。對(duì)于乙酰基保護(hù)的糖已經(jīng)顯示了有效銀染。
也提出了新的二醇修飾的核苷酸以及新的糖修飾的核苷酸向DNA的直接摻入。這些三磷酸向DNA的直接摻入及其后接著進(jìn)行溫和的合成后去保護(hù)極大地簡(jiǎn)化了我們的研究組中開(kāi)發(fā)的銀染方法。與“點(diǎn)擊-點(diǎn)擊”化學(xué)組合，通過(guò)高碘酸鹽切割對(duì)我們的經(jīng)修飾的DNA的選擇性醛修飾可以用于開(kāi)發(fā)新的三元標(biāo)記策略。
15.生物素疊氮的合成 活性酯與1-氨基-3-疊氮基丙烷反應(yīng)形成生物素疊氮。

16.用點(diǎn)擊化學(xué)進(jìn)行單、雙和三DNA修飾 16.1導(dǎo)入兩種不同的標(biāo)記 16.1.1樹(shù)脂上的雙點(diǎn)擊反應(yīng) 第一種方法涉及為第一點(diǎn)擊反應(yīng)引入一個(gè)自由炔和用弱酸在樹(shù)脂上去保護(hù)后為第二點(diǎn)擊方法引入第二個(gè)TMS保護(hù)的炔。為了測(cè)試樹(shù)脂上點(diǎn)擊反應(yīng)的可行性，我們制備了含有一個(gè)自由炔的測(cè)試鏈33并直接在樹(shù)脂上進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)，接著DNA去保護(hù)。官能化DNA鏈與相同系列的未處理的DNA鏈的HPLC跡線(trace)的比較顯示了幾乎定量轉(zhuǎn)化，表明點(diǎn)擊反應(yīng)在用于DNA合成的可控孔度玻璃支持體上高效率地進(jìn)行(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了引入兩種標(biāo)記，我們使用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)向寡核苷酸如ODN-1或ODN-2(表1)中摻入了胸苷和胞苷結(jié)構(gòu)單元33和34a。兩種亞磷酰胺的偶聯(lián)產(chǎn)率是優(yōu)秀的。在固相支持體上完全裝配寡核苷酸后，干燥樹(shù)脂并通過(guò)用CuBr、TBTA配體、抗壞血酸鈉和芐基疊氮35的溶液搖動(dòng)樹(shù)脂進(jìn)行第二點(diǎn)擊反應(yīng)。用1％乙酸洗滌并沖洗樹(shù)脂以切割第二個(gè)炔上的TMS保護(hù)基。最后，使用dabcyl疊氮40與第一點(diǎn)擊反應(yīng)類似地再次進(jìn)行第二點(diǎn)擊反應(yīng)。最后從樹(shù)脂切除DNA并通過(guò)將樹(shù)脂暴露于氨(H2O/EtOH 3∶1)除去所有保護(hù)基。發(fā)現(xiàn)所得的原始-MALDI譜與預(yù)期的雙修飾寡核苷酸完全一致(表2，條目1)，表明可以在固相支持體上直接向DNA中引入穩(wěn)定的標(biāo)記。
16.1.2樹(shù)脂上的單點(diǎn)擊反應(yīng)和組合切割/去保護(hù) 在一些情況下，優(yōu)選在溶液中進(jìn)行第二點(diǎn)擊反應(yīng)。用溶于水/乙醇的濃NH3處理單修飾的ODN-2(表1)從樹(shù)脂切除了DNA。在這些條件下，也除去了堿基保護(hù)基和保護(hù)醛的TMS基團(tuán)。所得的粗DNA帶有一個(gè)clicked-on修飾和一個(gè)自由炔，將該DNA在溶液(CuBr，TBTA配體，疊氮化物)中進(jìn)行第二點(diǎn)擊反應(yīng)，以優(yōu)良的產(chǎn)率和純度得到雙修飾的DNA(表2，條目2)。
16.1.3溶液中的雙點(diǎn)擊反應(yīng) 用帶有兩個(gè)炔的結(jié)構(gòu)單元33和34b容易得到用兩種堿基和親核試劑敏感性分子修飾的寡核苷酸。使用標(biāo)準(zhǔn)固相亞磷酰胺化學(xué)方法將它們都摻入ODN-3(表1)中。脫保護(hù)并從樹(shù)脂切除寡核苷酸后，進(jìn)行第一點(diǎn)擊反應(yīng)(使用上述溶液條件)，產(chǎn)生單修飾的寡核苷酸，具有平均＞90％的高產(chǎn)率。在第二步中，我們用溶于乙腈/DMF(4∶1 v/v)中的TBAF溶液切割TIPS保護(hù)基，對(duì)帶有一個(gè)標(biāo)記的DNA鏈不引起任何損害。溶液中的第二點(diǎn)擊反應(yīng)在三步驟方法中以通常60-90％到優(yōu)良產(chǎn)率產(chǎn)生雙修飾的寡核苷酸。
為了研究雙點(diǎn)擊修飾的寬應(yīng)用性，我們用整個(gè)系列的不同標(biāo)記進(jìn)行雙點(diǎn)擊，并且發(fā)現(xiàn)了對(duì)DNA的優(yōu)良化學(xué)方法產(chǎn)率(表2，條目3-15)。值得一提的是各點(diǎn)擊反應(yīng)和去保護(hù)步驟如此干凈使得在每個(gè)反應(yīng)步驟后簡(jiǎn)單的乙醇沉淀就足夠純化。圖15顯示了典型的原始HPLC層析圖和ODN-3的雙修飾后得到的MALDI分析(插圖)。對(duì)于非常靈敏的應(yīng)用，推薦一次最終的HPLC純化。在罕見(jiàn)情況下，如對(duì)于Cy3疊氮44，我們發(fā)現(xiàn)接頭在很小程度上被切割。
16.2引入三種不同的標(biāo)記 使用點(diǎn)擊反應(yīng)及其后通過(guò)乙醇沉淀，也可能用三種不同的標(biāo)記修飾寡核苷酸。為此，我們向寡核苷酸如ODN-4中引入了三種結(jié)構(gòu)單元33、34a和34b(表1)。直接在樹(shù)脂上進(jìn)行第一點(diǎn)擊反應(yīng)。隨后在TMS基團(tuán)的相伴切割下從支持體切除單修飾的寡核苷酸并通過(guò)HPLC純化。在溶液中以高產(chǎn)率進(jìn)行第二點(diǎn)擊反應(yīng)。乙醇沉淀雙修飾的寡核苷酸，用TBAF切割TIPS基團(tuán)并隨后在溶液中進(jìn)行第三點(diǎn)擊反應(yīng)提供了所希望的三重修飾的寡核苷酸，在最終的乙醇沉淀后產(chǎn)率為約50％(表2，條目16和17)。
16.3在非核苷酸結(jié)構(gòu)單元上引入手柄基團(tuán) 盡管非常希望在一些堿基(這里為dC和dT)上直接標(biāo)記寡核苷酸，但是經(jīng)常需要在核堿基外，例如在磷酸或糖上引入標(biāo)記。為了允許容易引入標(biāo)記，我們制備了帶有炔的非核苷DNA修飾劑37和38(圖16)。在DNA中使用這些結(jié)構(gòu)單元的點(diǎn)擊反應(yīng)一樣有效。
16.4結(jié)論 總之，我們報(bào)導(dǎo)了DNA的高效的、模塊化的和穩(wěn)健的多官能化方案。該方法的效率是基于三個(gè)特征1.在DNA去保護(hù)中的氨處理期間定量去除了TMS保護(hù)的炔。2.在該氨處理期間定量保留了TIPS保護(hù)的炔。3.可以有效而溫和地實(shí)現(xiàn)TIPS保護(hù)的炔的切除。帶有經(jīng)保護(hù)的炔的三磷酸的合成允許我們以逐步的方式標(biāo)記PCR片段。該方法極大地?cái)U(kuò)寬了我們對(duì)于分子生物學(xué)診斷和納米技術(shù)應(yīng)用所需的操作DNA的能力。此外，多個(gè)經(jīng)修飾的DNA鏈的文庫(kù)的組合合成得到新的適體。
表1.用于該研究中的ODN[a]
[a]X＝基于1的DNA核苷酸，Y＝基于34a的DNA核苷酸，Z＝基于34b的DNA核苷酸。
表2.ODN 1-4的合成后標(biāo)記
[a]最后一次點(diǎn)擊反應(yīng)后通過(guò)260nm處初步HPLC的積分確定，[b]從樹(shù)脂切割后無(wú)HPLC純化。因此，產(chǎn)率包括來(lái)自DNA合成的雜質(zhì)，[c]樹(shù)脂上點(diǎn)擊后HPLC純化。*在樹(shù)脂上進(jìn)行的點(diǎn)擊反應(yīng)。
17.用于DNA(和RNA)中三元點(diǎn)擊反應(yīng)的結(jié)構(gòu)單元 核糖核苷酸的合成遵循脫氧核糖系列的相同方法。所有炔可以作為自由炔、作為T(mén)MS保護(hù)的炔或者作為T(mén)IPS保護(hù)的炔產(chǎn)生。這得到了12種脫氧核糖核苷酸-亞磷酰胺和12中脫氧核糖核苷酸-三磷酸(每種核堿基3種不同的炔)和其他24種核糖核苷酸系列。此外，也可以得到6種末端炔亞磷酰胺。

方案1用于DNA的合成后標(biāo)記的經(jīng)修飾的脫氧核糖核苷酸(或核糖核苷酸)和末端炔。
核苷酸結(jié)構(gòu)單元作為三磷酸和作為亞磷酰胺的合成可以在短的和有效的反應(yīng)順序中實(shí)現(xiàn)。在下面報(bào)告這些合成的一些實(shí)例。
帶有末端炔的尿苷衍生物的合成
方案2合成炔官能化的尿苷三磷酸和亞磷酰胺 炔官能化的尿苷衍生物的合成用可商購(gòu)的5-碘代尿苷7開(kāi)始。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)-Sonogashira-去保護(hù)順序，使用1-三甲基甲硅烷基-1，7-辛二炔在Sonogashira交叉偶聯(lián)中導(dǎo)入容易官能化的接頭可以得到官能化的核苷9。使用標(biāo)準(zhǔn)方法可以得到亞磷酰胺10。通過(guò)Yoshikawa的磷酸化方法可以制備三磷酸11。
合成帶有末端炔和甲硅烷基保護(hù)的炔的胞苷衍生物
方案3合成炔官能化的胞苷三磷酸和兩種亞磷酰胺 通過(guò)對(duì)未保護(hù)的和可商購(gòu)的5-碘代胞苷進(jìn)行Sonogashira交叉偶聯(lián)可以制備容易官能化的游離的核苷13。通過(guò)用氨處理可以除去TMS基團(tuán)。以逐步的方式制備N4-苯甲?；Ｗo(hù)的亞磷酰胺14。通過(guò)兩步Ludwig-Eckstein方法制備三磷酸15。在Sonogashira1交叉偶聯(lián)后通過(guò)簡(jiǎn)單地省略TMS去保護(hù)步驟得到帶有TMS保護(hù)的炔的亞磷酰胺17。
合成帶有末端炔的鳥(niǎo)苷和腺苷衍生物
方案4合成炔官能化的鳥(niǎo)苷和腺苷三磷酸 18的合成按照Froehler等人的合成方法。Sonogashira交叉偶聯(lián)、總體去保護(hù)和Yoshikawa方法的磷酸化的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)順序產(chǎn)生了三磷酸19。經(jīng)修飾的腺苷衍生物4的合成與鳥(niǎo)苷衍生物的合成非常類似并且仍然在發(fā)展中。其非常類似于Froehler等人的工作。已經(jīng)類似于鳥(niǎo)苷合成成功地進(jìn)行了Sonogashira交叉偶聯(lián)。最終的步驟類似于為鳥(niǎo)苷衍生物19所述的。
在標(biāo)準(zhǔn)固相化學(xué)中使用這些經(jīng)修飾的亞磷酰胺的DNA(或RNA)合成是直接的，只是對(duì)于經(jīng)修飾的結(jié)構(gòu)單元延長(zhǎng)了偶聯(lián)時(shí)間。
使用三種不同的炔以便實(shí)現(xiàn)三元點(diǎn)擊反應(yīng)一種游離的炔，一種TMS保護(hù)的炔和一種TIPS保護(hù)的炔。第一點(diǎn)擊反應(yīng)仍然在樹(shù)脂存在下進(jìn)行(用于自動(dòng)化合成的固相支持體)。從樹(shù)脂的標(biāo)準(zhǔn)DNA(或RNA)切除后(其也除去了TMS基團(tuán))，使用標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)擊方案實(shí)現(xiàn)了第二點(diǎn)擊反應(yīng)。對(duì)TIPS基團(tuán)的最后的TBAF(四丁基氟化銨)去保護(hù)后，進(jìn)行第三次點(diǎn)擊反應(yīng)(方案4)。
18.作為疊氮化物修飾商業(yè)IR-染料的實(shí)例 IR-染料可以容易地轉(zhuǎn)化為它們的疊氮化物衍生物。下面的方案顯示了來(lái)自許多其他可能的合成中的兩種不同的合成路徑。
在第一次情況下，接頭通過(guò)Sonogashira偶聯(lián)附著到該染料。
下面的甲磺酸化和疊氮化產(chǎn)生了可用于DNA中的點(diǎn)擊反應(yīng)的疊氮化物。

在第二次合成中，直接在染料核心上產(chǎn)生疊氮化物(方案2)。

IR染料疊氮化物可以用于DNA照相中作為被設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)用于通過(guò)紅外線感光的相紙的光敏劑。此類紙可以在正常光條件下處理，消除了對(duì)暗室的限制。
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權(quán)利要求
1.產(chǎn)生包含至少兩種不同官能團(tuán)的報(bào)告分子的方法，其中至少一個(gè)第一和至少一個(gè)第二手柄基團(tuán)摻入到報(bào)告分子中，其中手柄基團(tuán)選自炔基、經(jīng)保護(hù)的炔基、疊氮基、醛基、經(jīng)保護(hù)的醛基、肼基或者羥胺基，并且其中第一和第二手柄基團(tuán)是不同的并且其中第一和第二手柄基團(tuán)選擇性偶聯(lián)到包含不同的第一和第二官能團(tuán)的第一和第二反應(yīng)配偶體。
2.產(chǎn)生包含至少兩種不同官能團(tuán)的報(bào)告分子的方法，其包括
(a)從多個(gè)結(jié)構(gòu)單元合成報(bào)告分子，其中至少一個(gè)結(jié)構(gòu)單元包含選自炔基、經(jīng)保護(hù)的炔基、疊氮基、醛基、經(jīng)保護(hù)的醛基、肼基或者羥胺基的第一手柄基團(tuán)，其中至少一個(gè)結(jié)構(gòu)單元包含選自炔基、經(jīng)保護(hù)的炔基、疊氮基、醛基、經(jīng)保護(hù)的醛基、肼基或者羥胺基的第二手柄基團(tuán)，并且其中第一手柄基團(tuán)不同于第二手柄基團(tuán)；
(b)在其中第一手柄基團(tuán)是反應(yīng)性并且第二手柄基團(tuán)不是反應(yīng)性的條件下將第一種反應(yīng)配偶體與第一手柄基團(tuán)偶聯(lián)，其中第一反應(yīng)配偶體包含第一官能團(tuán)，并隨后
(c)將第二反應(yīng)配偶體與第二手柄基團(tuán)偶聯(lián)，其中第二反應(yīng)配偶體包含第二官能團(tuán)并且其中第一官能團(tuán)不同于第二官能團(tuán)。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述報(bào)告分子選自肽、核酸和核酸類似物。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述報(bào)告分子包含多至2000，優(yōu)選4-200，更優(yōu)選10-100個(gè)結(jié)構(gòu)單元。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述官能團(tuán)選自標(biāo)記基團(tuán)，如染料、淬滅基團(tuán)和附著基團(tuán)，如生物素、生物素衍生物和半抗原。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中第一和第二官能團(tuán)是標(biāo)記基團(tuán)和淬滅基團(tuán)或者其中第一和第二官能團(tuán)是標(biāo)記基團(tuán)和附著基團(tuán)。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中手柄基團(tuán)選自炔基和經(jīng)保護(hù)的炔基。
8.權(quán)利要求7的方法，其中包含疊氮基的反應(yīng)配偶體通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)偶聯(lián)到炔基。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中第一和第二手柄基團(tuán)是炔基和經(jīng)保護(hù)的炔基或者其中第一和第二手柄基團(tuán)是第一經(jīng)保護(hù)的炔基和第二經(jīng)保護(hù)的炔基。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中在第一手柄基團(tuán)為未保護(hù)并且第二手柄基團(tuán)為經(jīng)保護(hù)的條件下，第一種反應(yīng)配偶體偶聯(lián)到第一手柄基團(tuán)。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其中至少三種手柄基團(tuán)摻入到報(bào)告分子中。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中第一手柄基團(tuán)是炔基并且第二和第三手柄基團(tuán)是攜帶不同保護(hù)基的經(jīng)保護(hù)的炔基。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中報(bào)告分子的合成是化學(xué)合成，優(yōu)選化學(xué)固相合成，其中在結(jié)合固相的情況下通過(guò)結(jié)構(gòu)單元的逐步裝配合成報(bào)告分子。
14.權(quán)利要求13的方法，其中至少第一反應(yīng)配偶體是偶聯(lián)的而報(bào)告分子結(jié)合至固相。
15.權(quán)利要求13的方法，其中在報(bào)告分子從固相切除后，第一反應(yīng)配偶體被偶聯(lián)。
16.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中合成是報(bào)告分子合成，其中報(bào)告分子從核苷三磷酸結(jié)構(gòu)單元合成。
17.檢測(cè)樣品中分析物的方法，其包括步驟
(a)提供樣品；
(b)將樣品與報(bào)告分子接觸，該報(bào)告分子包含至少兩種不同的官能團(tuán)，其中所述官能團(tuán)通過(guò)包含1，2，3-三唑環(huán)的接頭基團(tuán)結(jié)合至報(bào)告分子，
(c)檢測(cè)報(bào)告分子與分析物的相互作用，其表明樣品中分析物的存在和/或量。
18.權(quán)利要求17的方法，其中分析物是核酸或者核酸切割或結(jié)合蛋白。
19.權(quán)利要求17或18任一項(xiàng)的方法，其中報(bào)告分子與分析物的相互作用是結(jié)合，優(yōu)選雜交。
20.權(quán)利要求12-19任一項(xiàng)的方法，其中報(bào)告分子是核酸或核酸類似物，優(yōu)選分子信標(biāo)。
21.報(bào)告分子，其包含至少兩種不同的官能團(tuán)，其中所述官能團(tuán)通過(guò)包含1，2，3-三唑環(huán)的接頭基團(tuán)結(jié)合至該報(bào)告分子。
22.權(quán)利要求21的報(bào)告分子，其是核酸或核酸類似物，優(yōu)選分子信標(biāo)。
23.式(I)的化合物
C-S-N
其中C是經(jīng)保護(hù)的炔基，
S是間隔體或鍵，并且
N是核酸或核酸類似物結(jié)構(gòu)單元，如核苷或核苷酸或非核苷化合物。
24.式(V)的非核苷化合物
其中
A是經(jīng)保護(hù)或未保護(hù)的炔基，
S1和S2在每種情況下獨(dú)立地為非核苷基團(tuán)，例如，間隔體或鍵，
P是磷酸或磷酸類似物基團(tuán)，并且
R是用于核酸合成的偶聯(lián)基團(tuán)。
25.權(quán)利要求24的化合物，其中S1是間隔體并且S2是共價(jià)鍵。
26.權(quán)利要求23-25任一項(xiàng)的化合物，其中間隔體具有3到10個(gè)原子的鏈長(zhǎng)。
27.權(quán)利要求23-26任一項(xiàng)的化合物，其中間隔體包含炔基。
28.權(quán)利要求23-27任一項(xiàng)的化合物，其中經(jīng)保護(hù)的炔基是甲硅烷基保護(hù)的炔基。
29.權(quán)利要求28的化合物，其中甲硅烷基是三(烷基/芳基)甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基或叔丁基-二甲基甲硅烷基或環(huán)狀橋接的甲硅烷基。
30.式(II)的化合物
B-S-N3
其中B是生物素或生物素衍生物，如脫硫生物素或氨基生物素，
S是間隔體或鍵，并且
N3是疊氮基。
31.式(III)的化合物
Q-S-N3
其中Q是淬滅基團(tuán)，
S是間隔體或鍵，并且
N3是疊氮基。
32.式(IV)的化合物
Z-S-N
其中Z是醛糖基，其中羥基用酰基和/或甲硅烷基保護(hù)，或者經(jīng)保護(hù)或未保護(hù)的1，2二醇基，
S是間隔體或鍵，并且
N是核酸或核酸類似物結(jié)構(gòu)單元，如核苷或核苷酸化合物。
33.權(quán)利要求32的化合物，其中酰基選自乙?；?、丁酰基或新戊?；?。
34.式(V)的化合物
D-S-N
其中D是紅外(IR)染料，
S是間隔體或鍵，并且
N是疊氮基。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生適于分析物如核酸的檢測(cè)的報(bào)告分子的方法。此外，本發(fā)明涉及檢測(cè)分析物的方法和區(qū)域。
文檔編號(hào)C07B61/00GK101605743SQ200780040593
公開(kāi)日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2007年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月31日
發(fā)明者T·卡萊爾, A·斯科沃格勒 申請(qǐng)人:貝瑟克里科有限公司