專利名稱：：黃酮碳苷類化合物在制備治療和預(yù)防肝炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，涉及通式I代表的黃酮碳苷化合物在制備預(yù)防及治療肝炎藥物中的應(yīng)用。技術(shù)背景肝病是嚴(yán)重威脅人類健康的常見傳染病、多發(fā)病之一，根據(jù)病因可分為病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、藥物中毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝、遺傳代謝性肝病和其他感染因子引起的肝炎。肝炎中以病毒性肝炎對(duì)人類危害最大，而病毒性肝炎中以乙肝和丙肝尤為突出。乙型肝炎是世界性疾病，全球約有3.5億患者，我國(guó)是乙肝大國(guó)，乙肝表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性者約占總?cè)丝诘?/10。目前全世界約有3億(我國(guó)1,2億)乙肝病毒攜帶者。近年來(lái)，國(guó)際醫(yī)藥界對(duì)防治肝炎藥物研究工作比較活躍，主要針對(duì)抑制肝炎病毒復(fù)制、改善肝功能障礙、抗肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化、免疫調(diào)節(jié)等方面進(jìn)行研究。臨床上常用的肝炎藥物包括抗病毒類的干擾素、阿昔洛韋，免疫抑制劑環(huán)磷酰胺，保肝的水飛薊素、聯(lián)苯雙酯等。目前，化學(xué)藥物對(duì)于病毒性肝炎，尤其是慢性肝炎的防治尚無(wú)明確的療效，并且存在著毒副作用等弊端。我國(guó)有著豐富的天然藥物資源，在防治肝炎的臨床應(yīng)用等許多方面有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，并成功開發(fā)出茯芩多糖、甘利欣(甘草酸二銨)、水飛薊素、聯(lián)苯雙酯等天然藥物，并用于臨床治療，但由于肝炎發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，多數(shù)藥物療效有限，對(duì)肝炎不能有效根治，故研究和開發(fā)出新一代的肝炎治療藥物是非常必要的。中藥防治肝損傷作用主要為改善肝功能，降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、降低血清總膽紅素Bil，增加血清白蛋白Alb;促進(jìn)肝糖元合成，保護(hù)肝細(xì)胞，防止急慢性肝損傷造成的糖元合成障礙；改善肝細(xì)胞病理，對(duì)急性肝損傷能減輕細(xì)胞腫脹，防止脂肪變性、阻止肝纖維化；抑制肝膠原纖維、網(wǎng)狀纖維增生。通常認(rèn)為中藥的抗肝傷作用在于能提高SOD或其他抗氧化酶活性，從而清除自由基，阻止肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，維持細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)，避免細(xì)胞的損害。雞骨草為豆科植物雞骨草^fcn^omtom'eww:sHance和毛雞骨草^6nw;noZfoHance的干燥全株。具有清熱利濕、舒肝止痛、活血散瘀的功效，臨床用于治療急慢性肝炎、肝使化腹水、胃痛、風(fēng)濕痹痛等癥。主要分布于中國(guó)的南部地區(qū)，如廣西、廣東、福建及海南等。相思子屬植物中雞骨草治療傳染性肝炎療效顯著，從民間草藥使用發(fā)展到中成藥制劑，廣泛應(yīng)用于臨床，現(xiàn)有雞骨草沖劑、復(fù)方雞骨草片、雞骨草丸等劑型。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)藥材雞骨草和毛雞骨草的化學(xué)成分研究較少，文獻(xiàn)報(bào)道本植物分離得到脂肪酸、三萜、甾體、異黃酮等，已有的化學(xué)成分研究與藥效活性篩選工作脫節(jié)，未能系統(tǒng)地闡明藥材雞骨草治療肝炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。文獻(xiàn)報(bào)道雞骨草提取物及雞骨草中三萜皂苷槐花皂苷III和大豆阜苷I具有保肝降酶的活性(MiyaoH,efa/.KaikasaponinIIIandSoyasaponinI,majortriterpenesaponinsofJZvmomto;i/e腦-s，actonGOTandGPT:influenceontransaminaseelevationofratlivercellsconcomitantlyexposedtoCCUforonehour.刊a加flMeA'ai.1998，64(1):5-7.)。到目前為止，國(guó)內(nèi)外均未明確提出雞骨草治療肝炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，更無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道雞骨草植物中治療肝炎的有攻成分為黃酮碳苷類有效成分。為了尋找傳統(tǒng)中藥雞骨草的治療肝炎的藥效活性成分，本發(fā)明對(duì)雞骨草、毛雞骨草進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，結(jié)合與治療肝炎相關(guān)的藥效活性篩選，尋拔出本植物治療肝炎的藥效活性成分為5，7，4，-三羥基黃酮碳苷類化合物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所涉及的從豆科植物雞骨草^nwcfl加om'e/wi'和毛雞骨草/4&n^/mo肌j中提取分離的黃酮碳苷類化合物如通式I所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>1芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷(apigenin-6，8-di-C-j3-D-glucopyranoside),Vicenin2芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷(apigenin6-C-/f-D-glucopyranosyl-8-C-fl-Larabinopyranoside),Schaftoside3芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(apigenin6-C-a-L"Arabinopyranosyl-8-C-j3-D-Glucopyranoside)，Isoschaftoside本發(fā)明目的是提供通式I代表的化合物在制備預(yù)防及治療乙型肝炎、免疫型肝炎及酒精性肝炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是同通過(guò)下述技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的，取廣西產(chǎn)的毛雞骨草藥材^nw/noZfc經(jīng)70%乙醇回流提取，減壓回收至稠浸膏，用水混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取，正丁醇部分經(jīng)硅膠、低壓Cw柱及制備高效液相色譜分離純化，分離得到化合物13?；衔飈:淡黃色粉末(MeOH)，AlCl3反應(yīng)陽(yáng)性，提示為黃酮類化合物，mp235-236。C，結(jié)合13CNMR信息推斷該化合物的分子式為C27H3o015。IR(KBr)Vn^cm":3397(OH)，1650(C=0)，1564(Ar),1512(Ar),1042(C-O)。力NMR(500MHz,DMSO-rf6)dppin:13.80(lH,s,C5-OH),10.33(IH,，C7-OH),9.40(IH,，C4'-OH),8.04(2H,d,J=8.7Hz,H-2'，6'),6.91(2H，d，/=8.7Hz，H-3'，5')，6.79(1H，s，3-H)，4.80(IH，(!，/=9.4Hz,H-l"ofGlc),4.71(IH，d，/=9.8Hz，H-l'"ofGlc)。13CNMR(125MHz，DMSO-rf6)dppm:163.7(C-2),102.2(C-3)，182.3(C-4),161.5(C-5),108.5(C-6)，159.9(C-7),105.1(C-8)，159.0(C-9)，103.9(C-IO)，121.4(C-l')，128.9(C-2',6'),115.9(C-3',5'),161.2(C-4'),73.9(C-l"ofGlc)，71,3(C-2"ofGlc),78.8(C-3"ofGlc),70.3(C-4"ofGlc)，81.1(C-5")，61.2(C-6"ofGlc)，72.3(C-l"'ofGlc),70.1(C-2'"ofGlc)，79.2(C-3'"ofGlc),70.5(C-4"'ofGlc),81.8(C-5"'ofGlc),59.7(C-6mofGlc)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)對(duì)照，鑒定化合物1為芹菜素-6,8-二C-葡萄糖苷(apigenin-6,8-di-C-j3-D-glucopyranoside,Vicenin)?；衔?:淡黃色粉末，AlCl3反應(yīng)陽(yáng)性，鹽酸一鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性，mp.201-203°C;Positive-ESI-MSm/z:587[M+Na]+結(jié)合^、"CNMR信息推斷化合物2的分子式為C26H28014。IR(KBr)v證cm-1:3365(OH)，1649(C=0)，1583(C=C)，1512(OC)，1092(C-O)。^NMR(500MHz,DMSCW6)dppm:13.79(1H，s,C5-OH)，8.09(2H，d，J=6.7Hz，H-2'，6')，6.91(2H，d,J=8.8Hz，H-3',5'),6,75(1H，s，H國(guó)3)，4.78(1H,d，J=9.4Hz，H-l"ofGlc)，4.71(1H，d，J=9.8Hz,H-l"'ofAra)。13CNMR(125MHz，DMSO-^)3ppm:163.7(C-2)，102.2(C-3)，182.0(C-4),161.1(C-5),108.5(C-6),159.5(C-7),104.3(C-8),159.5(C-9),103.6(C-IO)，121.3(C-l'),129.0(C國(guó)2'，6')，115.9(C-3',5'),161.1(C國(guó)4')，73.6(C-l"ofGlc)，70.9(C-2"ofGlc)，78.7(C-3"ofGlc),70.1(C-4"ofGlc)，81.3(C-5"ofGlc)，60.9(C-6")，74.5(C-l"')，69.1(C-2'"),75.0(C-3'"),68.8(C-4'"),70.7(C-5"')。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)對(duì)照，鑒定化合物2為芹菜素-6-(:-葡萄糖-8-(:-阿拉伯苷(apigenin6-C-》-D-glucopyranosyl-8-C-a-L"arabinopyranoside,Schaftoside)?；衔?:淡黃色粉末，AlCl3反應(yīng)陽(yáng)性，鹽酸一鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性，mp.200-201。C;Positive-ESI-MSw/z:587[M+Na]+，結(jié)合111、13CNMR信息推斷化合物3的分子式為C26H280"。IR(KBr)v邁戰(zhàn)cm":3362(OH),1649(C=0)，1582(C=C)，1520(C=C),1090(C-O)。工HNMR(300MHz,DMSO-^)dppm:13.80(5-OH)，7.99(2H,d,>/=8.4Hz,H-2'，6'),6.89(2H，d,/=8.2Hz,H-3',5')，6.73(1H，s,H-3)4.80(1H,d,J=9.2Hz,H-l"ofGlc)，4.65(1H,d,J=8.8Hz,H隱l"'ofAra)。13CNMR(75MHz,DMSO-d6)3ppm:163.5(C-2),102.3(C-3),181.8(C-4)，161.1(C-5),108.2(C-6)，161.1(C-7)，104.4(C扁8)，154.8(C-9)，102.3(C-10)，121.6(C-l')，128.7(C-2',6')，115.8(C-3'，5')，158.4(C-4')，74.3(C-l"ofAra)，74,0(C-2"ofAra)，71.0(C-3"ofAra)，70.0(C-4"ofAra),68.6(C-5"ofAra)，73.3(C-l'"ofGlc),70.6(C-2mofGlc),78.9(C-3"'ofGlc)，70.5(C-4"'ofGlc)，81.8(C-5'"ofGlc),61.2(C-6"'ofGlc)。綜合以上信息，并與文獻(xiàn)比較，化合物3的以上數(shù)據(jù)與異夏佛塔苷一致，故鑒定化合物3為6-C-arabinosyl-8-C-glycopyranosylapigenin。以上所示序菜素黃酮碳苷類化合物的植物來(lái)源可以是豆科相思子屬植物雞骨草omtoWe^f和毛雞骨草^^nwwo/fc，也可以是在豆科植物其他屬植物中分離，如山螞蟥屬植物廣金錢草￡>^附0^"附507^70//"/。其來(lái)源也可以是化學(xué)合成，也可以是在某個(gè)黃酮類化合物的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或生物轉(zhuǎn)化。本發(fā)明進(jìn)一步提出芹菜素黃酮碳苷類化合物或以其為基本活性成分的組合物在制備預(yù)防和治療乙型肝炎、免疫型肝炎及酒精性肝炎藥物的應(yīng)用，。芹菜素黃酮碳苷類化合物或以其為基本活性成分的組合物可以與藥學(xué)上可以接受的載體組成藥物組合物，制成各種制劑，包括膠囊、片劑、顆粒劑、滴丸、注射劑等。給藥途徑為口服、注射等。本發(fā)明對(duì)芹菜素黃酮碳苷進(jìn)行了藥效學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。一、黃酮碳苷對(duì)CCl4致小鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷的保肝活性篩選1、肝細(xì)胞分離小鼠Z.p.戊巴比妥麻醉，背位固定，腹正中V形切口，使腹腔充分暴露，行門靜脈插管，向肝臟灌注預(yù)溫37'C的前灌流液(無(wú)鈣鎂Hank's平衡鹽溶液，內(nèi)含0.5mMEGTA、25mMHEPES，PH7.4),同時(shí)打開后腔靜脈，盡量沖盡肝組織中殘血，然后打開胸腔，剪斷前腔靜脈，結(jié)扎后腔靜脈，再用預(yù)溫372C的灌流液(含0.1%膠原酶、4mMCaCl2、0.8mMMgS04的HBSS)繼續(xù)灌流，控制流速約6ml/min，持續(xù)灌流數(shù)分鐘后，待肝組織韌性消失，輕壓不易恢復(fù)，停止灌流，立即將肝臟轉(zhuǎn)移入冷的無(wú)血清RPMI-1640液中，用眼科鑷去除肝包膜，輕輕抖動(dòng)，分散肝細(xì)胞，將此肝細(xì)胞懸液用100目濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液以50g離心2min,沉淀為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(hepatocytes,HC)。2、CCl4致肝損傷與轉(zhuǎn)氨酶的釋放試驗(yàn)在96孔培養(yǎng)板中加入HC，每孔細(xì)胞數(shù)為2x104，于37。C，5%(302培養(yǎng)4匕肝細(xì)胞單層用William'sE培養(yǎng)液洗滌2次，給藥預(yù)培養(yǎng)3小時(shí)，棄上清，再加入CC14(0.15%)和藥物共培養(yǎng)2小時(shí)或只加CCU培養(yǎng)2小時(shí)，吸取上清按試劑盒說(shuō)明測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活力。每組藥物三個(gè)濃度(100、30、10jimol/L)，每個(gè)濃度三個(gè)復(fù)孔，二銨鹽(30fAmol/L)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表l。表1黃酮碳苷對(duì)CCl4致原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>CCI4致原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷活性篩選結(jié)果顯示，CCl4造模組的ALT和AST活性明顯高于正常對(duì)照組(p<0.01)。黃酮碳苷類化合物l、2和3均劑量依賴性地抑制CCl4損傷后肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞ALT、AST水平的上升，保肝降酶活性與陽(yáng)性藥甘草酸二銨鹽基本相當(dāng)，相同濃度的保肝降酶活性優(yōu)于陽(yáng)性藥甘草酸二銨鹽。二、黃酮碳苷對(duì)BCG+LPS致大鼠原代肝細(xì)胞損傷的保肝活性篩選1、大鼠原代肝細(xì)胞分離參照二步膠原酶灌注技術(shù)分離獲取大鼠原代肝細(xì)胞。取正常大鼠或卡介苗(BCG)致敏12d的大鼠，乙醚麻醉，開腹，分離肝門靜脈并行門靜脈插管，以37。C的無(wú)鈣灌流液灌流肝臟，剪斷下腔靜脈，分離周圍組織，采用IV型膠原酶灌流液循環(huán)灌流數(shù)分鐘，取出肝臟轉(zhuǎn)移4。CMEG培養(yǎng)液，用MEG培養(yǎng)液清洗2次，用眼科鑷去除肝包膜，輕輕抖動(dòng)，分散肝細(xì)胞，將此肝細(xì)胞懸液用100目濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液以50g離心2min，棄上清液，沉淀加培養(yǎng)液混懸均勻，同條件重復(fù)離心3次。0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，光鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞產(chǎn)量與活率，活率在95%以上的肝細(xì)胞用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。2、大鼠原代肝細(xì)胞免疫性損傷模型的建立及藥物活性篩選將分離的正?；駼CG致敏大鼠肝細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板上，用MEM培養(yǎng)液稀釋成2.5x105細(xì)胞/孔，37°C，5%C02培養(yǎng)約16h后，換以不含血清和地塞米松的MEM培養(yǎng)液，BCG致敏大鼠的肝細(xì)胞用10mg/L的脂多糖(LPS)攻擊，造成免疫型肝損傷細(xì)胞模型，分別加入測(cè)試及陽(yáng)性藥物，培養(yǎng)16h,收集培養(yǎng)孔內(nèi)的細(xì)胞上清液，置-20。C冰箱保存，按照試劑說(shuō)明操作，測(cè)試ALT、AST、LDH活性和NO含量。每組藥物三個(gè)濃度(100、30、1Onmol/L)，每個(gè)濃度三個(gè)復(fù)孔，陽(yáng)性藥物為甘草酸二銨鹽(30jxmol/L)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。表2黃酮碳苷對(duì)BCG+LPS致大鼠原代肝細(xì)胞損傷的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>p<0.05，p<0.01vsmodelgroup結(jié)果顯示，BCG+LPS造模組肝細(xì)胞上清液的ALT、AST及LDH活性及NO含量明顯高于正常對(duì)照組。黃酮碳苷化合物l、2、3，在測(cè)定劑量范圍內(nèi)，均能顯著抑制卡介苗聯(lián)合脂多糖所致的免疫性損傷后肝細(xì)胞ALT、AST、LDH及NO水平的上升，且相同濃度下效果優(yōu)于甘草酸二銨鹽組。三、黃酮碳苷對(duì)酒精致大鼠原代肝細(xì)胞損傷的保肝活性篩選1、大鼠原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)參照二步膠原酶灌注技術(shù)分離獲取大鼠原代肝細(xì)胞。2、大鼠原代肝細(xì)胞酒精性損傷模型的建立及藥物活性篩選將分離的大鼠原代肝細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，用高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋成5.0x105細(xì)胞/孔中培養(yǎng)，37°C，5免C02培養(yǎng)約24h后，24h后更換含有受試藥物的新鮮培養(yǎng)基或空白培養(yǎng)基，培養(yǎng)lh，再加入100mmol/L無(wú)水乙醇共同培養(yǎng)8h，收集培養(yǎng)孔內(nèi)的細(xì)胞上清液，i"-^rc沐箱膝，按照試劑說(shuō)明操作，iraMT、mr、mds^sod含量。wmwwh^濃度(100、30、10nmol/L)，每個(gè)濃度三個(gè)復(fù)孔，陽(yáng)性藥物為甘草酸二銨鹽(30jimol/L)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。表3黃酮碳苷對(duì)酒精致大鼠原代肝細(xì)胞損傷的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>p<0.05,p<0.01vsmodelgroup酒精致原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷活性篩選結(jié)果顯示，酒精造模組的AST、LDH、MDA活性明顯高于正常對(duì)照組，SOD水平明顯高于正常對(duì)照組(p<0.01)。黃酮碳苷類化合物l、2和3均劑量依賴性地抑制酒精損傷后肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞AST、MDA水平的上升，升高SOD水平，保肝降酶活性與陽(yáng)性藥甘草酸二銨鹽基本相當(dāng)，提示化合物l、2、3均具有減小酒精性肝損傷細(xì)胞的損傷程度、降低脂質(zhì)過(guò)氧化、提高內(nèi)源性抗氧化能力，對(duì)酒精性肝損傷具有較好的防護(hù)作用，且相同濃度下效果優(yōu)于甘草酸二銨鹽組。權(quán)利要求1.下列通式I的5，7，4’-三羥基黃酮碳苷類化合物，其中R1代表葡萄糖或阿拉伯糖，R2代表葡萄糖或阿拉伯糖，2.通式I代表的化合物在制備預(yù)防及治療乙型肝炎、免疫型肝炎及酒精性肝炎藥物及保健食品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，下列通式I的5，7，4’-三羥基黃酮碳苷類化合物在制備預(yù)防及治療乙型肝炎、免疫型肝炎及酒精性肝炎藥物和保健食品中的應(yīng)用，其中R₁代表葡萄糖或阿拉伯糖，R₂代表葡萄糖或阿拉伯糖。文檔編號(hào)C07H17/00GK101161668SQ200710134589公開日2008年4月16日申請(qǐng)日期2007年11月2日優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日發(fā)明者劉卓偉,葉文才,靖尚,張陸勇,江振洲,豪汪,非熊,趙守訓(xùn)申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)