專利名稱：一個(gè)i型細(xì)胞因子受體樣分子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞因子受體樣分子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)I型細(xì)胞 因子受體樣分子及其編碼基因與其在制備抑制細(xì)胞增殖的治療性基因藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維結(jié)合素III型(FNIII)結(jié)構(gòu)域是許多蛋白分子(如細(xì)胞黏附與遷移分子、細(xì) 胞受體分子、生長(zhǎng)因子受體分子、蛋白酪氨酸磷酸酶等)的重要結(jié)構(gòu)域(C.W. Ward, Members of the insulin receptor family contain three fibronectin type III domains, Growth Factors 16 (1999) 315-322)。 FNIII結(jié)構(gòu)域最早是在牛的纖維結(jié) 合素中發(fā)現(xiàn)的(T.E. Petersen, H. C. Thogersen， K. Skorstengaard， K. Vibe-Pedersen， P. Sahl， Sottrup-Jensen, S. Magnusson， Partial primary structure of bovine plasma fibronectin: three types of internal homology, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80 (1983) 137-141)。該結(jié)構(gòu)域在典型的纖維結(jié) 合素分子中是一個(gè)長(zhǎng)約100個(gè)氨基酸殘基、有15次重復(fù)的同源單位。纖維結(jié)合素蛋 白與其異源二聚體形式的整合素受體的特異性結(jié)合主要依賴于靠近纖維結(jié)合素蛋白
羧基端的第10個(gè)FNIII結(jié)構(gòu)域(FNIII10)內(nèi)的細(xì)胞黏附基序，即精氨酸、甘氨酸和天 門冬氨酸結(jié)構(gòu)域(RGD)，及其附近的FNIII9結(jié)構(gòu)域中的協(xié)同位點(diǎn)(M.A. Arnaout， S. L. Goodman, J. P. Xiong, Coming to grips with integrin binding to ligands, Curr. Opin. Cell. Biol. 14 (2002) 641-651)。 RGD結(jié)構(gòu)域不僅存在于纖維結(jié)合素中，它
也存在于許多整合素受體家族蛋白的特異性配體中，其中包括纖維蛋白原、膠原、玻 璃體結(jié)合蛋白、馮威特布蘭特因子、內(nèi)動(dòng)蛋白、韌粘素、外加某些黏附蛋白等(E. Ruoslahti， RGD and other recognition sequences for integrins, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12 (1996) 697-715)。雖然如此，目前估計(jì)僅有5_6%的RGD蛋白屬于膜 蛋白或分泌型蛋白，而自然界存在的大多數(shù)RGD蛋白主要分布在細(xì)胞內(nèi)(G. K. Papadopoulos， C. Ouzounis， E. Eliopoulos, RGD sequences in several receptor proteins: novel cell adhesion function of receptors, Int. J. Biol. Macromol. 22 (1998) 51—57)。
I型細(xì)胞因子受體超家族蛋白的特點(diǎn)是受體的胞外區(qū)分布有一個(gè)細(xì)胞受體同源區(qū) (CRH)。典型的CRH結(jié)構(gòu)由兩個(gè)反向平行的FNIII結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)FNIII結(jié)構(gòu)域又
由7個(gè)時(shí)斤疊片構(gòu)成桶狀結(jié)構(gòu)。在第一個(gè)FNIII結(jié)構(gòu)域靠近蛋白氨基末端的位置通常 會(huì)有四個(gè)半光氨酸殘基，而保守的WSXWS基序位于第二個(gè)FNIII結(jié)構(gòu)域的羧基端，即 靠近細(xì)胞膜的區(qū)域。通常認(rèn)為，CRH的功能主要是參與受體的二聚化，與特異性配體 的相互作用，以及受體跨膜區(qū)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可將細(xì)胞阻抑于G0/G1期，降低S期細(xì)胞比例的I型細(xì) 胞因子受體樣分子。
本發(fā)明所提供的I型細(xì)胞因子受體樣分子，名稱為CRLF-p48(簡(jiǎn)稱p48或h-p48)， 來(lái)源于人屬人(及朋o幼; ie/^)，是下述氨基酸殘基序列之一
1) 序列表中的SEQ ID NO: 1;
2) 將序列表中SEQIDNO: 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加且具有將細(xì)胞阻抑于G0/G1期，降低S期細(xì)胞比例功能的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQIDNO: 1由438個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第76-261 位氨基酸殘基為纖維結(jié)合素ni型(FNIII)結(jié)構(gòu)域，自氨基端第255-259位氨基酸殘 基為WSPWS基序，自氨基端第249-253位氨基酸殘基為RGD回文序列，自氨基端第 216-230位氨基酸殘基為酪氨酸硫化位點(diǎn)(N-snhfedvYvgsetef-C)，自氨基端第 292-295位氨基酸殘基為單一的N糖基化位點(diǎn)。
所述取代、缺失或添加的一至十個(gè)氨基酸殘基可以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基， 其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。
編碼本發(fā)明I型細(xì)胞因子受體樣分子的基因(CK尸-簡(jiǎn)稱/7必或力-/ 必)， 其cDNA是下述核苷酸序列之一
1) 序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列;
2) 編碼序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列；
3) 與序列表中SEQ ID NO: 2限定的DNA序列具有90X以上同源性且具有將細(xì)胞 阻抑于G0/G1期，降低S期細(xì)胞比例功能的核苷酸序列；
4) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在O. 1XSSPE (或0. 1XSSC) 、 0.1% SDS的溶液中，65。C條 件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO: 2由1317個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5'端第1-1317 位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO: l的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5'端第 226-783位堿基編碼纖維結(jié)合素III型(FNin)結(jié)構(gòu)域，自5'端第763-777位堿基編碼WSPWS基序，自5，端第745-759位堿基編碼RGD回文序列，自5，端第646-690 位堿基編碼酪氨酸硫化位點(diǎn)(N-snhfedvYvgsetef-C)，自5，端第874-885位堿基編碼 N糖基化位點(diǎn)。
含有本發(fā)明基因的各種表達(dá)載體、穩(wěn)定細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及宿主菌均屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增CiK,-p^ 中任一片段的引物對(duì)也是本發(fā)明要保護(hù)的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種在細(xì)胞水平調(diào)控細(xì)胞從Gl期進(jìn)入到S期的方法。
本發(fā)明所提供的在細(xì)胞水平調(diào)控細(xì)胞從Gl期進(jìn)入到S期的方法，是將所述I型 細(xì)胞因子受體樣分子基因CvK尸-p^9或?qū)⒃摶蛐「蓴_RNA的編碼基因?qū)胨拗骷?xì)胞， 導(dǎo)致宿主細(xì)胞被阻抑于G0/G1期或G0/G1期阻抑被解救，細(xì)胞進(jìn)入到S期。
所述I型細(xì)胞因子受體樣分子基因C虹尸-;^9的小干擾RNA，是正義鏈為序列表中 SEQ ID NO: 3的核苷酸序列，反義鏈為序列表中SEQ ID NO: 4的雙鏈RNA序列。
將上述雙鏈RNA序列命名為si-p48。si-p48的反義鏈與6T Z尸-;^《raRNA第836-856 位置序列5， -gguacagucugagcagucgaa-3，互補(bǔ)，序列表中SEQ ID NO: 3由21個(gè)堿 基組成，序列的方向從左至右為5'端一3'端，序列表中SEQIDN0: 4由21個(gè)堿基 組成，序列的方向從左至右為5'端一3'端。
所述I型細(xì)胞因子受體樣分子基因小干擾RNA的編碼基因，其有義鏈(正義鏈) (不做模板的DNA鏈)可為序列表中的SEQ ID NO: 5或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表 中SEQ ID NO: 5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈(做模板的DNA鏈)可 為序列表中的SEQ ID NO: 6或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO: 6限定的DNA 序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0. 1XSSPE (或0. 1XSSC) ， 0. 1% SDS的溶液中，在65°C 下雜交并洗膜。
序列表中SEQIDN0: 5由53個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5'端一3'端； 序列表中SEQ ID NO: 6由57個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為3'端一5'端。
所述宿主細(xì)胞可為(但不僅限于)293T細(xì)胞、CAP1、 Cos7、 CAM、 BEL-7402或H印G2 細(xì)胞等。
所述I型細(xì)胞因子受體樣分子基因OZF-;^《可通過(guò)各種轉(zhuǎn)染及重組病毒感染的 方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物。
本發(fā)明所提供的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物，其活性成分為所述I型細(xì)胞因子受體 樣蛋白分子CRLF-p48或其編碼基因C瓜F-/^ 。
所述CRLF-p48可存在于真核表達(dá)載體中。
需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種基因藥物可接受的載體。所述
基因藥物載體包括(但不僅限于)攜帶基因的載體，如脂質(zhì)體、重組病毒載體等；攜 帶蛋白質(zhì)的載體，如(但不僅限于)其它的蛋白或多肽成分，也包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀 釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附 載體等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊等多種形式。上述各種 劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明的藥物可以與抗生素、免疫刺激劑等進(jìn)行組合治療。
上述藥物的用量一般為10-50u g CRLF-p48 (或200-1200 u g攜帶CRLF-p48的 質(zhì)粒/kg體重/day ，療程為7-20天。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為人p48基因的染色體定位及基因結(jié)構(gòu)
圖2為人p48基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果
圖3為人p48蛋白的跨膜區(qū)分析結(jié)果
圖4為人p48及其主要同源蛋白的序列比對(duì)分析結(jié)果
圖5為人p48及其主要同源蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果
圖6為人p48蛋白的亞細(xì)胞器定位結(jié)果
圖7為人p48基因在腫瘤細(xì)胞系及正常組織中表達(dá)情況的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
圖8為檢測(cè)過(guò)量表達(dá)p48基因?qū)0/G1期和S期細(xì)胞比例的影響
圖9為檢測(cè)過(guò)量表達(dá)EGFP-p48融合基因?qū)0/G1期和S期細(xì)胞比例的影響
圖10為Western Blotting及RT-PCR檢測(cè)si-p48對(duì)p48基因的抑制效應(yīng)
圖11為用特異性siRNA(si-p48)抑制內(nèi)源性p48基因表達(dá)后細(xì)胞周期變化的檢測(cè)
結(jié)果
圖12為p48基因表達(dá)水平與Gl-S期相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)水平的關(guān)系的RT-PCR檢 測(cè)結(jié)果
圖13為p48介導(dǎo)的cyclin Dl上調(diào)與STAT3和RAS/MAPK信號(hào)通路關(guān)系的檢測(cè)結(jié)
果
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn) 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, DavidW.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 31" edition, 2001， NY， Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工合成。
實(shí)施例1、 I型細(xì)胞因子受體樣分子基因OZ尸-p4《cDNA的克隆
收集約5Xl(f個(gè)人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞，用lmL TRIzol (Invitrogen公司)處理，再加入15(^1氯仿，混合后離心取上清，加入等量的異丙醇 沉淀，得到人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞的總RNA。取l|ig K562細(xì)胞的總RNA 為模板，在引物P1 (上游引物):5'-tatagtcgaccatggagctggagcctgagct-3'和P2 (下 游引物)5'-tatactcgagctaaaacactaacactttcc-3'的引導(dǎo)下，用一步法反轉(zhuǎn)錄-聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(one st印RT-PCR)試劑盒(Takara公司)反轉(zhuǎn)錄合成C厄,-p4汰簡(jiǎn)稱； 必或 力-Z 必)的全長(zhǎng)cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為先5(TC 45分鐘；然后94°C 30秒，58°C 30 秒，72°C 90秒，共35個(gè)循環(huán)，最后72。C 10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用購(gòu)自鼎國(guó)公司的DNA回收試劑盒回收長(zhǎng)度約1317bp的 目的片段并對(duì)其進(jìn)行純化，將回收片段連接入到T-A載體pGEM-Teasy (Promega公司) 中，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(￡coW) DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì) 粒，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，命名為pGEM-T-p48，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表 明擴(kuò)增片段具有序列表中的SEQ ID N0: 2的核苷酸序列，由1317個(gè)堿基組成，其編 碼序列為自5'端第1-1317位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID N0: 1的氨基酸殘基 序列的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例2、 p48基因組基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)及同源性分析
一、p48基因組基因的生物信息學(xué)分析
將本發(fā)明的p48基因在NCBI基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)分析，分析結(jié)果 表明p48基因位于人17號(hào)染色體的qll. 2區(qū)域，與I型神經(jīng)纖維瘤病的NF1基因比 鄰(見(jiàn)圖1中的圖A)，并且，p48的基因組基因存在兩種剪接異構(gòu)體形式p48-l和 p48-2(GenBank號(hào)分別為AF120151和AF046059)。為了揭示p48基因的基因組結(jié)構(gòu)， 用這兩種剪接異構(gòu)體的mRNA構(gòu)建了一個(gè)共同的cDNA序列，該共同序列包含兩種剪接 異構(gòu)體mRNA的所有序列信息。用該共同的cDNA序列在NCBI人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST比對(duì)分析，得到了 p48基因組基因在染色體17qll. 2上外顯子與內(nèi)含子的分布 與結(jié)構(gòu)，如圖1中的圖B所示，p48的基因組基因至少由13個(gè)外顯子組成，分布于長(zhǎng) 約73kb的染色體區(qū)域，在p48基因組基因的5'端所進(jìn)行的選擇性剪接可產(chǎn)生兩種不 同的剪接異構(gòu)體，即p48-l和p48-2。 p48-l和p48-2編碼蛋白序列基本相同，差異 僅為p48-2的氨基端較p48-l多出4個(gè)氨基酸殘基(MRGA)。在外顯子1和外顯子5上各有一個(gè)蛋白質(zhì)翻譯的ATG起始位點(diǎn)，選擇性剪接使p48-1使用第二個(gè)ATG起始位 點(diǎn)，而p48-2則使用第一個(gè)位點(diǎn)。
二、 p48蛋白的生物信息學(xué)分析
將p48的氨基酸殘基序列在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)分析，分析結(jié) 果如圖2所示，p48氨基酸序列自氨基端(N端)第76位的精氨酸(Arg，至261位的 脯氨酸(Pro2"為一個(gè)典型的纖維結(jié)合素III型(FNIII)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與瘦素 (l印tin)受體、催乳素(prolactin)受體和白細(xì)胞介素23受體具有顯著的同源性。在 FNIII結(jié)構(gòu)域的羧基端，即從255位的色氨酸(Trp，到259位的絲氨酸(Ser259)，有一 個(gè)典型的WSPWS基序，該基序?yàn)镮類細(xì)胞因子受體超家族成員胞外區(qū)常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)。在 WSPWS基序的上游存在一個(gè)旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的RGD回文序列。PR0SITE分析結(jié)果顯示自氨基 端第216位的絲氨酸(Ser216)至第230位的苯丙氨酸(Phe23。)的序列為一個(gè)典型的酪氨 酸硫化位點(diǎn)(N-snhfedvYvgsetef-C)，自氨基端第292位的天冬氨酸(AsrT)到295位 的谷氨酸(Glu^)是一個(gè)單一的N糖基化位點(diǎn)。用Dense Alignment Surface (DAS)軟 件未預(yù)測(cè)出p48蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)，說(shuō)明該蛋白是一個(gè)在胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)(結(jié)果見(jiàn) 圖3，縱坐標(biāo)為跨膜區(qū)分值，橫坐標(biāo)為氨基酸的相對(duì)位置；loose CUtoff表示 寬松的域值，strict cutoff表示嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠蛑?。
三、 P48及其同源蛋白的序列分析
利用BLASTP程序在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索出數(shù)個(gè)本發(fā)明人源p48 (h-p48)蛋 白的同源蛋白，包括鼠源p48(m-p48)，人源CRLF3 (hCRLF3)，鼠源CRLF3 (raCRLF3)， 非洲爪蟾CRLF3-prov蛋白，斑馬魚(yú)L0C550515蛋白及黑青斑河豚的I型細(xì)胞因子受 體，這些蛋白的Genbank號(hào)依次為AAD31759. 1、 NP—057070、 NP—061246、 AAH45226、 AAH92800和MR25665.1。用ClustalW程序?qū)σ陨系鞍仔蛄羞M(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如圖 4所示，h-p48分別與m-p48、hCRLF3、mCRLF3、非洲爪蟾CRLF3-prov(Xen叩us laevis)、 斑馬魚(yú)L0C550515(Danio rerio)及黑青斑河豚(Tetraodon nigrovridis)的I型細(xì)胞 因子受體在氨基酸水平上有93%、 99%、 92%、 70%、 66%和60%的序列一致性， 并且這些蛋白的FNIII結(jié)構(gòu)域，RGD、 WSXWS基序，以及酪氨酸硫化位點(diǎn)均呈現(xiàn)較高的 保守性，預(yù)示該類蛋白質(zhì)在脊椎動(dòng)物中很有可能行使相似的功能。用TreeTop軟件對(duì) h-p48及其相關(guān)蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果如圖5所示，h-p48與兩棲類動(dòng)物(如非 洲爪蟾)的同源蛋白在進(jìn)化上的親緣關(guān)系要比與水生魚(yú)類的近。
實(shí)施例3、 p48基因的亞細(xì)胞器定位及組織細(xì)胞的表達(dá)與分布情況檢測(cè) 一、P48基因的亞細(xì)胞器定位及其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況檢測(cè)
1、 含有P4《與6^尸融合基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶&7 I和J力o I對(duì)實(shí)施例1構(gòu)建的含有p必的重組質(zhì)粒pGEM-T-p48 進(jìn)行雙酶切，將酶切后釋放的438bp的p48全長(zhǎng)cDNA片段亞克隆到經(jīng)5"a7 I單酶切 的線性化載體pCMV-Myc (購(gòu)自Clontech公司)中，得到含有/^《的真核表達(dá)載體， 命名為pCMV-Myc-p48。以pCMV-Myc-p48為模板，在引物P3:
5'-tatagtcgaccatggagctggagcctgagct-3'禾口 P4: 5'-taggtaccgtaaacactaacactttcc-3' 的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增不含終止密碼子的/^ 基因。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用購(gòu)自鼎國(guó)公司的DNA回收試劑盒回收目的片段并對(duì)其進(jìn) 行純化，將回收片段用限制性內(nèi)切酶I和必/7 I雙酶切后與經(jīng)J力o I和I雙 酶切的載體pEGFP-Nl (購(gòu)自Clontech公司)連接，得到含有與"(綠色熒光 蛋白)融合基因(f67^-的真核表達(dá)載體，命名為pEGFP-p48。
2、 p48基因的亞細(xì)胞定位及其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況檢測(cè) 用下述兩種方法觀察p48在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及分布情況，具體方法如下
1) 采用共聚焦顯微鏡直接觀察;^《與^F融合基因在活細(xì)胞中的表達(dá)情況 將人胚腎細(xì)胞系293T、人肝癌細(xì)胞系BEL-7402、和人乳腺癌細(xì)胞系CAM均按5X107mL的接種量鋪于35mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞覆蓋80%時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectaraine 2000 (Invitrogen公司)將2嗎的pEGFP-p48質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的單 層細(xì)胞中，以pEGFP-Nl空載體為對(duì)照，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，在共聚焦顯微鏡下觀察綠色 熒光蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如圖6中的圖A所示(b， d， f為對(duì)照)，EGFP-p48融合蛋 白主要在293T、 BEL-7402和CAM的細(xì)胞漿中表達(dá)。
2) 采用免疫染色方法觀察p48在細(xì)胞內(nèi)定位將5X107mL的Cos7細(xì)胞鋪于35mra培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞覆蓋80%時(shí)，采用脂質(zhì)體 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000將2叫的pCMV-Myc-p48質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入Cos7細(xì)胞，轉(zhuǎn) 染48小時(shí)后，用4%甲醛固定20分鐘，然后用0.5X的TritonX-100孵育15分鐘， 再加入鼠源抗Myc單克隆抗體(購(gòu)自Santa Crutz公司)，洗脫后，加入TRITC標(biāo)記 的山羊抗鼠抗體(購(gòu)自Santa Crutz公司)孵育至少35min，最后，在激發(fā)波長(zhǎng)為568nm 的條件下用共聚焦顯微鏡觀察Cos7細(xì)胞中p48蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果如圖6中的圖B 所示(DAPI為4-6-二氨基-2-苯基吲哚，anti-Myc為抗Myc標(biāo)簽抗體，Merged為: 重疊)，p48蛋白不僅在細(xì)胞漿中分布，在細(xì)胞核中也大量表達(dá)。
二、半定量RT-PCR法檢測(cè)p48基因在不同細(xì)胞系及正常組織中的分布情況 用半定量RT-PCR法檢測(cè)p48基因在不同細(xì)胞系及正常組織中的分布情況，具體 方法為共使用ll種細(xì)胞系，即人胚腎細(xì)胞系293T、人胰腺癌細(xì)胞系CAP1、人肝癌細(xì)胞系H印G2、鼠髓性瘤細(xì)胞系J558、人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562、人喉癌細(xì)胞 系H印2、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人乳腺癌細(xì)胞系CAM、人胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901、 EB 病毒轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系3D5和人肝癌細(xì)胞系BEL-7402 (均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué) 研究所的細(xì)胞中心)。正常人血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液(鼎國(guó)生物公司) 分離獲得。上述每種細(xì)胞各收集約5Xl(f個(gè)，分別進(jìn)行如下處理用lmL TRIzol處 理，加入150pl氯仿，混合后離心取上清，加入等量的異丙醇沉淀，得到總RNA。正 常人組織(包括腎[kid]、腦[bra]、脾[spl]和肺[lung])的總RNA購(gòu)自陜西超英生 物公司。取lng總RNA并以此為模板，在引物P5 (上游引物) 5'-AACGTTGATTACCAGTTCAG-3'和P6 (下游引物)5'-CTGAGGACAGCTACGTTAGA-3'的引導(dǎo) 下，用一步法反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成p48基因的cDNA片段，以P -actin基因?yàn)閮?nèi)參(擴(kuò)增引物序列為5， -cacactgtgcccatctacga-3，禾口 5， -ctgcttgctgatccacatct-3，)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為先50°C 45分鐘；然后94 °C 30秒，58°C 30秒，72°C 90秒，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C IO分鐘。反應(yīng)結(jié)束后， 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示(泳道M為DNA Marker)， 除了CAP1和J558細(xì)胞外，p48基因在其它所有受檢的組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，說(shuō)明 P48在多種組織細(xì)胞中具有普遍表達(dá)的趨勢(shì)。
實(shí)施例4、檢測(cè)過(guò)量表達(dá)p48基因?qū)?xì)胞周期的影響
用不同量(Opg、 lpg、 3|ig)的pCMV-Myc-p48質(zhì)粒瞬式轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染劑 量不足3pg的，用pCMV-Myc質(zhì)粒補(bǔ)足到3fig。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用胰酶消化所轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞單層，并制備單細(xì)胞懸液。將1X10'細(xì)胞用70X乙醇-2(TC固定至少1小時(shí)，用 0. 5叫/mLRNaseA酶消化15分鐘，加入50pg/mL的碘化丙啶(PI)染色10分鐘，用流式 細(xì)胞儀對(duì)處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分析。結(jié)果如圖8所示，隨著pCMV-Myc-p48 轉(zhuǎn)染劑量的增加，被阻抑在G0/G1期的細(xì)胞數(shù)目也在增加，而進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)目則 顯著減少。具體來(lái)講，將轉(zhuǎn)染劑量由0^ig增加到lpg，再增加到3pg，相對(duì)應(yīng)的G0/G1 期細(xì)胞比例則從58. 5±4.16%增加到64. 3±2. 81% (P>0. 05)，再增加到68. 2±1. 88% (P<0. 05);而S期細(xì)胞比例則顯著下降，從35. 4±2. 56%降到31. 2±1. 16% (P〈0. 05)， 再降到21. 1±4.29% (P〈0.01)。上述結(jié)果說(shuō)明，p48基因產(chǎn)物在G1-S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中 發(fā)揮抑制作用。因此，p48基因很有可能是一個(gè)新型的抑癌基因，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期 特別是G1-S期，來(lái)達(dá)到阻抑細(xì)胞過(guò)度增殖的目的。
為進(jìn)一步核實(shí)p48基因?qū)⒓?xì)胞阻抑于G0/G1期以及對(duì)S期細(xì)胞比例下降的作用， 將pEGFP和pEGFP-p48分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收獲細(xì)胞，PI染色，用
流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI及綠色熒光蛋白(EGFP)雙陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。結(jié)果如圖9 所示，過(guò)量表達(dá)pEGFP-p48可使細(xì)胞在G0/G1期發(fā)生阻抑，同時(shí)顯著抑制S細(xì)胞比例 (將圖9中的圖A)。與轉(zhuǎn)染pEGFP的細(xì)胞相比，過(guò)量表達(dá)pEGFP-p48可使G0/G1期 細(xì)胞比例由29.5土1. 77°% (EGFP)顯著增加到40. 9±1. 37% (EGFP-p48);而S期細(xì) 胞比例則由69. 4±2. 55% (EGFP)下降到52士1. 85% (EGFP-p48)(將圖9中的圖B)。 該結(jié)果進(jìn)一步證明p48基因確實(shí)對(duì)細(xì)胞的G0/G1期有明顯的阻抑作用。
實(shí)施例5、檢測(cè)用p^9特異性RNA干擾載體抑制內(nèi)源性p^9表達(dá)對(duì)S期細(xì)胞比例 的影響
一、/^《特異性RNA干擾載體的構(gòu)建
1、 p必特異性小RNA干擾的設(shè)計(jì)
根據(jù)p必mRNA序列以及pBS/U6載體(Sui GC et al. PNAS. 2002 April ;99 (8) :5515-5520)中U6啟動(dòng)子的特殊要求，得到一對(duì)抑制p^"表達(dá)的小干擾RNA， 命名為si-p48，作用于p4《mRNA的第836-856核苷酸位置序列 5' -gguacagucugagcagucgaa-3，。
2、 根據(jù)所設(shè)計(jì)的siDNAl和siDNA2，i恰成4條寡核苷酸，序列如下(下劃線堿基序 列為針對(duì)P必raRNA的耙序列)
Oia: 5， -ggtacagtctgagcagtcgaa-3'
Oib: 5， -agctttcgactgctcagactgtacc-3';
02a: 5， -agctttcgactgctcagactgtaccctttttg-3'
。2b: 5， -aattcaaaaagggtacagtctgagcagtcgaa-3'。
ggtacagtct gagcagtcga aagctttcga ctgctcagac tgtacccttt ttg
將上述2對(duì)寡核苷酸片段兩兩之間進(jìn)行退火即(L與0化，(k與02b相互混合，沸 水煮5min，然后自然冷卻至室溫。用限制性內(nèi)切酶^^ I充分消化pBS/U6，以酚/氯 仿抽提純化DNA后，加入Klenow及四種dNTP在37。C下作用約lh，補(bǔ)平粘性末端， 跑1. 0%瓊脂糖凝膠電泳回收并純化質(zhì)粒DNA，再以過(guò)量歷Wni酶切消化質(zhì)粒DNA， 再次跑1. 0%瓊脂糖凝膠電泳回收并純化質(zhì)粒DNA。將酶切處理的pBS/U6與退火的寡 核苷酸雙鏈lalb按一定比例(1: 20或1: 40)室溫連接過(guò)夜(12-24小時(shí))，得到 含有l(wèi)alb的重組載體，命名為pBS/U6-si-p48-lalb。再用III和￡co7 I雙酶 切載體pBS/U6-si-p48-lalb，跑1. 0%瓊脂糖擬膠電泳回收并純化大片段的載體DNA， 將回收的載體片段與退火的寡核苷酸雙鏈DNA 2a2b按1:20比例室溫連接過(guò)夜，得到 /^《特異性RNA干擾載體，命名為pBS/U6-si-p48。
二、檢測(cè)用/^《特異性RNA干擾載體抑制內(nèi)源性/^《表達(dá)對(duì)S期細(xì)胞比例的影響 將pBS/U6-si-p48瞬式轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測(cè)在抑制內(nèi)源性p48基因表達(dá)后，細(xì)
胞周期的變化，方法如下
1、 檢測(cè)si-p48對(duì)p48基因的抑制效應(yīng)
1) Western Blotting檢測(cè)si-p48對(duì)p48基因的抑制效應(yīng)
首先用Western Blotting法檢測(cè)si-p48對(duì)p48基因的抑制效應(yīng)，具體方法為 將不同劑量的pBS/U6-si-p48 (Opg， 0. 5pg， 4. 5pg)分別與等量的pCMV-Myc-p48質(zhì)粒 (2網(wǎng))共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后，收取細(xì)胞裂解液，每個(gè)劑量的轉(zhuǎn)染細(xì)胞取10pg 總蛋白質(zhì)，跑10%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(Amersham Biosciences)上， 然后分別以鼠源抗Myc標(biāo)簽的單克隆抗體為一抗(購(gòu)自Santa Cruz公司)進(jìn)行雜交， 以熒光素標(biāo)記的羊源抗鼠抗體(Amersham Biosciences UK Limited)為二抗，最后用 ECL化學(xué)發(fā)光的底物(Amersham Biosciences)進(jìn)行雜交信號(hào)放大，同時(shí)以e-actin 為內(nèi)參(檢測(cè)用一抗為抗(3-actin (a-(3-actin)的單克隆抗體(購(gòu)自Santa Cruz公 司)，二抗為熒光素標(biāo)記的羊源抗鼠抗體(Amersham Biosciences UK Limited))。檢 測(cè)結(jié)果如圖10中的圖A所示("+ "表示添加，"一"表示未添加)，si-p48對(duì)過(guò) 量轉(zhuǎn)染的P48基因的具有明顯的劑量抑制效應(yīng)。
2) RT-PCR檢測(cè)si-p48對(duì)p48基因的抑制效應(yīng)
將不同劑量的pBS/U6-si-p48 (0|ng， l網(wǎng)，3叫)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后， 收獲細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR方法(引物P5和P6 (見(jiàn)實(shí)施例3))檢測(cè)內(nèi)源性p48 基因的表達(dá)情況，同時(shí)以e-actin基因?yàn)閮?nèi)參。檢測(cè)結(jié)果如圖10中的圖B所示(泳 道1和2為未轉(zhuǎn)染pBS/U6-si-p48的細(xì)胞內(nèi)p48基因的表達(dá)水平，泳道3-5為 pBS/U6-si-p48轉(zhuǎn)染量為lpg的細(xì)胞內(nèi)p48基因的表達(dá)水平，泳道6-8為 pBS/U6-si-p48轉(zhuǎn)染量為3^g的細(xì)胞內(nèi)p48基因的表達(dá)水平)，結(jié)果表明過(guò)量轉(zhuǎn)染 pBS/U6-si-p48可顯著抑制內(nèi)源性p48基因的表達(dá)水平，并且這種抑制作用呈現(xiàn)劑量 依賴性，且si_p48對(duì)P48基因表達(dá)的抑制是具有基因特異性的。
2、 檢測(cè)在抑制內(nèi)源性p48基因表達(dá)后細(xì)胞周期的變化
用不同劑量的pBS/U6-si-p48 (0|ig， l叫，3ng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以抑制內(nèi)源性p48 基因表達(dá)，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用與實(shí)施例4相同的方法對(duì)處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)量 進(jìn)行分析，以檢測(cè)抑制內(nèi)源性p48基因表達(dá)后細(xì)胞周期的變化。細(xì)胞周期分析結(jié)果如 圖11所示，抑制內(nèi)源性p48基因表達(dá)后，G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低，同時(shí)S期細(xì)胞 比例增加(見(jiàn)圖11中的圖A)。細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果見(jiàn)圖11中的圖B，用低劑 量si-p48(l網(wǎng))抑制內(nèi)源性p48基因表達(dá)可顯著增加S期細(xì)胞比例，可從45. 5±1. 79% (0ng)提升到51. 4±1. 50% (1網(wǎng)，P<0. 01)，但高劑量si-p48(3pg)對(duì)S期細(xì)胞比例 的影響不明顯，即從45.5±1.79%(0^)到48. 0±3. 63% (3pg， P〉0. 05);但是G0/G1 期細(xì)胞比例卻隨si-p48轉(zhuǎn)染劑量的增加而顯著降低，即從49. 6±1. 22% (Opg)降到 42. 3±2.94%(lpg， P<0.01)，或降到44. 8±2. 09% (3嗎，P〈0. 01)。上述檢測(cè)結(jié)果表 明，用si-p48抑制內(nèi)源性p48基因的表達(dá)可在一定程度上解除p48介導(dǎo)的G0/G1期 阻抑，導(dǎo)致進(jìn)入S期的細(xì)胞比例增加。
實(shí)施例6、 RT-PCR檢測(cè)過(guò)量p48基因表達(dá)水平與Gl-S期相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)水平 的關(guān)系
1) 首先，用RT-PCR方法檢測(cè)G1-S期的調(diào)控基因CyclinDl(GenBank號(hào)BC014078)， CyclinD2 (GenBank號(hào)BC089384)和CyclinD3 (GenBank號(hào)NM—001760)在CAP1 和293T細(xì)胞中的表達(dá)水平，方法為每種細(xì)胞各收集約5乂106個(gè)，用lmL TRIzol(Invitrogen公司)處理，加入150pl氯仿，混合后離心取上清，加入等量的異 丙醇沉淀，得到總RNA。然后以總RNA為模板，用與實(shí)施例3中相同的RT-PCR的方法 檢測(cè)兩種細(xì)胞中p48基因，CyclinDl、 CyclinD2和CyclinD3基因的表達(dá)水平，其中， 檢測(cè)CyclinDl基因的引物序列為5， -atggaacaccagctcct-3，和
5' -aggaagttgttggggct-3，，檢測(cè)CyclinD2基因的引物序列為 5， -atggagctgctgtgcca-3，禾口 5， -tctttcggcccaactgg-3，，檢測(cè)CyclinD3基因的 引物序列為5， -atggagctgctgtgttg-3，和5, -agtccacttcagtgcca-3，，同時(shí)以P -actin基因?yàn)閮?nèi)參。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖12中的圖A，在Capl細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)不到p48基因的 表達(dá)，也檢測(cè)不到CyclinDl， CyclinD2和CyclinD3基因的表達(dá)；相反，在293T細(xì) 胞中有較高水平內(nèi)源性p48基因的表達(dá)，同時(shí)，在293T細(xì)胞中，內(nèi)源性CyclinDl， CyclinD2和CyclinD3基因也呈高表達(dá)的趨勢(shì)。
2) 將pCMV-Myc-p48過(guò)量轉(zhuǎn)染CAP1，以pCMV-Myc空載體轉(zhuǎn)染的CAP1細(xì)胞為對(duì)照， 用RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞G1-S期相關(guān)基因CyclinDl、 CyclinD2、 CyclinD3、 CDK4 (GenBank號(hào)NM—000075) 、 CDK6 (GenBank號(hào)BC052264) 、 P21 (GenBank號(hào) S67388)和P27 (GenBank號(hào)AY004255)基因的表達(dá)水平，其中，檢測(cè)CDK4基因的 弓l物序列為5， -tctcccttgatctgagaatg-3， 禾口 5， -agatacagccaacactccac-3，， 檢 測(cè)CDK6基因的引物序列為5， -tcaggttgtttgatgtgtgc-3，和
5， -tcagaagtaggtctttgcct-3，，檢測(cè)P21基因的引物序列為
5， -aaggtcagttccttgtgga-3，和5， -ttagggcttcctcttggaga-3，，檢測(cè)P27基因的
弓I物序歹U為5， -agatgtcaaacgtgcgagtg-3，禾口 5， -gtgcttatacaggatgtcca-3，， 同 時(shí)以0-actin基因?yàn)閮?nèi)參。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖12中的圖B和圖C (泳道Myc為pCMV-Myc 空載體轉(zhuǎn)染的CAP1細(xì)胞)，在pCMV-Myc空載體轉(zhuǎn)染的CAP1細(xì)胞中，除僅有CyclinD2 基因微弱表達(dá)外，控制G1-S轉(zhuǎn)換的諸多基因，如CyclinDl， CyclinD3， CDK4， CDK6， P21和P27均沒(méi)有明顯表達(dá)；而在p48基因過(guò)量表達(dá)的CAPl細(xì)胞中，CyclinDl、CyclinD3 和CDK6基因均上調(diào)表達(dá)。上述檢測(cè)結(jié)果表明p48介導(dǎo)的G0/G1期阻抑及S期細(xì)胞比 例的下降是與CyclinDl等基因的上調(diào)表達(dá)而非下調(diào)相關(guān)的。
實(shí)施例7、檢測(cè)p48介導(dǎo)的cyclin Dl上調(diào)與STAT3和RAS/MAPK信號(hào)通路的關(guān)系 p48介導(dǎo)的cyclin Dl上調(diào)有可能受以下兩種信號(hào)通路控制即RAS/MAPK信號(hào)通 路與STAT3信號(hào)通路。為增加檢測(cè)的靈敏性，將0、 1、 3、 6微克的pCMV-Myc-p48分 別與等量的Ras顯性正(RasG12V)質(zhì)粒(120ng， Terada K et al. ， J Biol Chem. 1995 Nov 17;270 (46) :27880-6.)混合后共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，裂解細(xì)胞， 收取細(xì)胞裂解液。每個(gè)劑量的轉(zhuǎn)染細(xì)胞總蛋白各取l(^g，跑10^SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn) 到硝酸纖維素膜(AmershamBiosciences)上，然后分別以鼠源抗Myc標(biāo)簽(a -Myc)、 抗ERK (a-ERK)、抗磷酸化ERK ( a -p-ERK)、抗CyclinDl (a-CyclinDl)、抗 STAT3 (a-Stat3)、抗磷酸化STAT3 (a-p-Stat3)及抗p-actin (a-p-actin)的 單克隆抗體為一抗(購(gòu)自Santa Cruz公司)進(jìn)行雜交，以熒光素標(biāo)記的羊源抗鼠抗體 (Amersham Biosciences UK Limited)為二抗，最后用ECL化學(xué)發(fā)光的底物(Amersham Biosciences)進(jìn)行雜交信號(hào)放大。檢測(cè)結(jié)果如圖13所示("+ "表示添加，"一" 表示未添加)，p48介導(dǎo)的cyclin Dl上調(diào)不影響細(xì)胞內(nèi)ERK的磷酸化水平，說(shuō)明cyclin Dl的上調(diào)不受RAS/MAPK信號(hào)通路的控制；與此相反，在細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)p48基因， 可顯著激活STAT3蛋白，并且，增加p48的轉(zhuǎn)染量，STAT3磷酸化水平呈現(xiàn)遞增的趨 勢(shì)，說(shuō)明p48可通過(guò)激活STAT3信號(hào)通路上調(diào)cyclin Dl的表達(dá)。
以上通過(guò)實(shí)施例具體說(shuō)明了本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員從中還可以了解，通過(guò)在核 酸序列中造成核苷酸的適當(dāng)?shù)母淖?，或通過(guò)體外合成所需的多肽，可以制備本發(fā)明蛋 白p48的氨基酸序列突變體。此類突變體包括序列中的氨基酸殘基的缺失、插入或替 代。所得的治療性突變體蛋白質(zhì)的活性可比野生型p48蛋白高，也可以降低。在合成 過(guò)程中或合成后被不同修飾的多肽同樣屬于本發(fā)明的范圍，例如，通過(guò)(但不局限于) 生物素化、泛素化、芐化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通過(guò)已知的保護(hù)/阻 斷基團(tuán)進(jìn)行衍生化、蛋白水解裂解、連接抗體分子或其它細(xì)胞配體等。這些修飾可以 增強(qiáng)或降低本發(fā)明的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和/或生物學(xué)活性。
本發(fā)明提供了一個(gè)I型細(xì)胞因子受體樣分子CRLF-p48及其編碼基因。該I型細(xì) 胞因子受體樣分子自氨基端第176位精氨酸(Arg176)至261位的脯氨酸(Pro261)區(qū)域含 有一個(gè)典型的纖維結(jié)合素III型(FNIII)結(jié)構(gòu)域，并且在該結(jié)構(gòu)域的羧基端呈現(xiàn)一個(gè) 旋轉(zhuǎn)對(duì)稱的RGD回文序列和一個(gè)WSXWS基序。同源性分析結(jié)果表明，該蛋白及其編碼
基因在不同脊椎動(dòng)物中呈現(xiàn)高度保守的趨勢(shì)。此外，cy z,-/^ 在多種正常組織及腫瘤
細(xì)胞系中均普遍表達(dá)，并很有可能是一個(gè)新型的抑癌基因，通過(guò)抑制Gl-S期的轉(zhuǎn)換 來(lái)調(diào)控細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)證明，在人胚腎細(xì)胞系293T中過(guò)量表達(dá)CRLF-p48，可使細(xì) 胞阻止在G0/G1期，導(dǎo)致S期細(xì)胞比例顯著下降；利用RNA干擾技術(shù)抑制內(nèi)源性 CRLF-p48基因的表達(dá)可顯著降低GO/Gl期細(xì)胞的比例；CRLF-p48介導(dǎo)的Gl-S期阻抑 與周期素CyclinDl、 CyclinD3和CDK6的上調(diào)有關(guān)，并且，周期素CyclinDl的上調(diào) 很有可能是由于STAT3信號(hào)通路而非RAS/MAPK信號(hào)通路的激活所致。本發(fā)明的I型 細(xì)胞因子受體樣分子CRLF-p48及其編碼基因既可作為潛在的腫瘤診斷標(biāo)記使用，也 可以其為活性成分制備成I型神經(jīng)纖維瘤、胰腺腫瘤及其它相關(guān)腫瘤的治療性基因或 重組蛋白藥物，將在醫(yī)學(xué)及制藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。此外，抑制本發(fā) 明I型細(xì)胞因子受體樣分子基因表達(dá)的小干擾RNA也可作為針對(duì)野生型或突變衍生型 p48基因表達(dá)的抑制劑，可將細(xì)胞阻抑于GO/Gl期，降低S期細(xì)胞比例，或解救GO/Gl 期阻抑，使進(jìn)入S期的細(xì)胞比例增加，用于制備正反兩方面的治療腫瘤的核酸藥物， 或用于商業(yè)性(如生物公司出售的)的研究細(xì)胞周期及腫瘤治療的試劑與研究工具。
序列表
<160〉 6
〈210〉 1 <211〉 438 <212〉 PRT
<213〉 人屬人(/fa/z7。 sa/ ie"s)
〈400〉 1
Met Glu Leu Glu Pro Glu Leu Leu Leu Gin Glu Ala Arg Glu Asn Val
15 10 15
Glu Ala Ala Gin Ser Tyr Arg Arg Glu Leu Gly His Arg Leu Glu Gly
20 25 30
Leu Arg Glu Ala Arg Arg Gin lie Lys Glu Ser Ala Ser Gin Thr Arg
35 40 45
Asp Val Leu Lys Gin His Phe Asn Asp Leu Lys Gly Thr Leu Gly Lys
50 55 60
Leu Leu Asp Glu Arg Leu Val Thr Leu Leu Gin Glu Val Asp Thr lie 65 70 75 80
Glu Gin Glu Thr lie Lys Pro Leu Asp Asp Cys Gin Lys Leu lie Glu
85 90 95
His Gly Val Asn Thr Ala Glu Asp Leu Val Arg Glu Gly Glu lie Ala
100 105 110
Met Leu Gly Gly Val Gly Glu Glu Asn Glu Lys Leu Trp Ser Phe Thr
115 120 125
Lys Lys Ala Ser His lie Gin Leu Asp Ser Leu Pro Glu Val Pro Leu
130 135 140
Leu Val Asp Val Pro Cys .Leu Ser Ala Gin Leu Asp Asp Ser lie Leu 145 150 155 160
Asn lie Val Lys Asp His lie Phe Lys His Gly Thr Val Ala Ser Arg 165 170 175Pro Pro Val Gin 180
Val Arg Trp Cys 195
Leu Gin Phe Arg 210
Gly Ser Glu Thr 225
Tyr Gin Phe Arg
Pro Trp Ser Val 260
Trp Thr Ala Gly 275
Ala Leu Arg Asn 290
Pro Thr Tyr Phe 305
Gly Gin Pro Asp
Asp Gly Tyr Asp 340
Asn Gly Ala Val 355
Ala Val Thr Ser 370
Heu Gly Thr Thr 385
Thr lie Ser Ser
Gin Ser Cys Gly 420
lie Glu Glu Leu Leu Glu 185
Lys Val Asp Asp Asp Phe 200
Lys Cys Thr Ser Asn His 215
Glu Phe lie Val Leu His 230
Val Cys Ala Arg Gly Asp 245 250 Pro Gin lie Gly His Ser 265
Phe Glu Gly Tyr Ser Leu 280
Asp Ser Glu Ser Ser Gly 295
Gin Thr Leu Thr
Cys Gly 310 Arg Arg 325
Ser Leu
Ser Asn 390 Asn Asn 405
Ser Leu
Lys Pro Gly Gly lie lie 190 Asp
Thr Ala Gin 205
Phe Glu Asp Val 220
lie Asp Pro Asn 235
Gly Arg Gin Glu
Tyr Arg
Tyr Val
Val Asp 240 Trp Ser 255
His Glu
Asp Ser lie Gly 330
Gin Arg Asp Gin 345
Phe Val Asn Gly Lys Glu 360
Gly Ser Thr Val Thr Phe 375
Asn Glu Gly Gly
Thr Leu Val Pro 270
Ser Ser Arg Arg Asn lie 285
Val Leu Tyr Ser Arg Ala 300
Phe Arg Val Glu 315
Val Cys Ala Glu
Ala Val Cys
Thr Val 320 Lys Gin 335
Ser Thr
lie 350
Gin Leu Pro
Met Thr Asn 365
Asp lie Glu Ala Val Thr 380
His Phe Lys Leu 395
Phe Asp Trp
Arg Glu Val Val Phe Asp Trp Leu 410
Tyr Phe Gly Cys Ser Phe Phe Tyr
425 430
Arg Val 400 Leu Asp 415
Pro GlyTrp Lys Val Leu Val Phe 435
〈210〉 2
<211〉 1317
〈212> 腿
〈213> 人屬人(jYowo sa/7j.e/ 50
〈400〉 2
atggagctggagcctgagctgctgttgcaggaggcccgcgggcagcgcag60
agctaccggcgggagctgggtcaccggcttgaggggctgcgtgaggcgcgg3ggC卿tC120
aaagaaagtgcatca_ceigacaagggatgttctcaaacagcattttaMgatttaaaggga180
acccttggaaagctcctggatgagcgattggtgacccttttgcaagaggtggacaccatt240
gaacaggaggiccattaaacc3ctageitggictgccagaagctcatagaacacggagtcaac300
ELCtgC柳ggacttagtccg卿aggtgaaatcgccatgcttggtggtgtggg卿卿g360
aatgagaaactgtggagctttaccaaaaaggcctcgcacattcagttggacagcttacca420
geiagtacctttactggttgatgtgccttgtttatctgctcagttggeitgactcaattctt480
aacatagtgsttttaagcstgga織gtagcatctcgccc3ccagt3C3g540
teictsgageiaacctggaggcatcattgtacgatggtgt犯ggtggatgat600
gactttacagcccaagattacaggctccagtttcgtaaatgtacttcaaatcattttgag660
gatgtatatgtaggttctgaaactgaattcatagtattgccaacgttgat720
taccagttcagagtctgcgcccgaggagatggccgacaggagtggagtccttggagtgtc780
ccccagataggtcattccacattggtgcctC3tg3gtgg3cagctggttttgaggggtac840
3gtCtg￡LgC3gtcgaagaaatatagcacttcgggiacgattctgaatcatcgggtgttctc900
tactcc3gagctccgacttaUtctgtgggcagacattaaca_ttcaga_gttgaaactgtg960
ggacagccagacagaaga^tagcataggagtgtgtgcagtggatEitgac1020
tctctgcagcgggatcaagctgtgtgcattagtac犯atggtgcagt"ttttgtcaatgga1080
caaatcagttacccgcagttacttctgggtccactgtcacgtttgacatt1140
g肪gCCgtg3ctctaggaaccaccagtaataatga鄉(xiāng)tggacacttcaagcttcgagta1200
actataagttcaaeitaatagagaagtggtttttgactggttacttgatcagtcttgtggt1260
tctctttactttggatgctcatttttctatcctggatggaaagtgttagtgttttag1317
<210〉 3
<211> 21
〈212〉 ■ <213>人工序列
〈220〉 <223〉
〈400> 3
gguacagucu gagcagucga a 21
<210〉 4
〈211〉 21
<212> 薩 〈213〉人工序列
〈220〉 <223>
<400> 4
uucgacugcu cagacuguac c 21
<210> 5
〈211〉 53
<212> DNA 〈213〉人工序列
<220> <223〉
<400> 5ggtacagtct gagcagtcga aagctttcga ctgctcagac tgtacccttt ttg 53
<210> 6
〈211〉 57
<212> 腿 〈213〉人工序列
<220> 〈223〉
〈400〉 6
ccatgtcaga ctcgtcagct ttcgaaagct gacgagtctg acatgggaaa aacttaa 5權(quán)利要求
1、I型細(xì)胞因子受體樣分子，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有將細(xì)胞阻抑于G0/G1期，降低S期細(xì)胞比例功能的蛋白質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的I型細(xì)胞因子受體樣分子，其特征在于所述蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中的SEQ ID NO: l所示。
3、 編碼權(quán)利要求1或2所述I型細(xì)胞因子受體樣分子的基因。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因的cDNA是下述核苷酸序 列之一1) 序列表中SEQ ID NO: 2的DNA序列;2) 編碼序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列；3) 與序列表中SEQ ID NO: 2限定的DNA序列具有90X以上同源性且具有將細(xì)胞 阻抑于G0/G1期，降低S期細(xì)胞比例功能的核苷酸序列；4) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5、 含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
6、 抑制權(quán)利要求3或4所述I型細(xì)胞因子受體樣分子基因表達(dá)的小干擾RNA，是 正義鏈為序列表中SEQ ID NO: 3的核苷酸序列，反義鏈為序列表中SEQ ID NO: 4的 核苷酸序列的雙鏈RNA序列。
7、 一種體外調(diào)控細(xì)胞從G1期進(jìn)入到S期的方法，是將權(quán)利要求3或4所述的I 型細(xì)胞因子受體樣分子基因或?qū)?quán)利要求6所述的抑制I型細(xì)胞因子受體樣分子基因 表達(dá)的小干擾RNA的編碼基因?qū)胨拗骷?xì)胞，宿主細(xì)胞被阻抑于G0/G1期或G0/G1期 阻抑被解救，細(xì)胞進(jìn)入到S期。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述I型細(xì)胞因子受體樣分子基 因小干擾RNA的編碼基因，其有義鏈為序列表中的SEQ ID NO: 5或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下 與序列表中SEQ ID NO: 5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列，反義鏈為序列表中的 SEQ ID NO: 6或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列表中SEQ ID NO: 6限定的DNA序列雜交的核 苷酸序列；所述宿主細(xì)胞為293T細(xì)胞、CAP1、 Cos7、 CAM、 BEL-7402或H印G2細(xì)胞。
9、 權(quán)利要求1或2所述的I型細(xì)胞因子受體樣分子在制備抑制腫瘤增殖藥物中 的應(yīng)用。
10、權(quán)利要求3或4所述的I型細(xì)胞因子受體樣分子基因在制備抑制腫瘤增殖藥 物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)I型細(xì)胞因子受體樣分子及其編碼基因。該I型細(xì)胞因子受體樣分子是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有將細(xì)胞阻抑于G0/G1期，降低S期細(xì)胞比例功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的I型細(xì)胞因子受體樣分子及其編碼基因既可作為潛在的腫瘤診斷標(biāo)記使用，也可以其為活性成分制備成I型神經(jīng)纖維瘤、胰腺腫瘤及其它相關(guān)腫瘤的治療性藥物，將在醫(yī)學(xué)及制藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C07K14/715GK101195657SQ200610164890
公開(kāi)日2008年6月11日 申請(qǐng)日期2006年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日
發(fā)明者力 劉, 云 張, 帆 楊, 王樹(shù)蕙 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所