專利名稱：鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法，屬于金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法之一。
背景技術(shù)：
1957年Margoshes和Vallee在研究金屬生物學(xué)作用時，從動物器官分離出一種新的蛋白質(zhì)，它含有豐富的巰基，能螯合大量的金屬離子，此物質(zhì)稱為金屬硫蛋白(英文為Metallothionein，簡稱MT)。人體、動物、植物以及微生物體內(nèi)均含MT，而且其理化特性基本一致。分子量為6500-7000道爾頓，直徑30-50A，分兩個結(jié)構(gòu)域，每個分子含7-12個金屬原子，具有特殊的光吸收。它含有61個氨基酸，其中21個氨基酸為半胱氨酸，這樣每一個MT分子就可以最多結(jié)合七個金屬原子。MT化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以在80℃的水中存活30分鐘，100℃的水中存活3分鐘而不失活，同時抗酶解，它具有廣泛的生物功能，在體內(nèi)主要參與微量元素的貯存、運(yùn)輸和代謝、拮抗電離輻射、清除羥基自由基及重金屬解毒等多種作用。大量的科學(xué)實驗和臨床結(jié)果表明MT在抗電離輻射、紫外線照射、解除金屬毒素、治療消化道潰瘍、心肌梗塞、各種炎癥、各種癌癥、美容護(hù)膚、減輕吸煙及環(huán)境污染對人體的危害及抗過敏等方面均有顯著療效，具有廣譜高效的保健效果和極高的醫(yī)療價值。因此，提高金屬硫蛋白的生產(chǎn)量是大家的共同追求。但是，要提高金屬硫蛋白的生產(chǎn)量，其途徑之一是解決生產(chǎn)工藝，能夠在較短的時間內(nèi)，和操作工序簡單的情況下，將原料中的金屬硫蛋白盡可能的分離出來，并且純度高。目前的生產(chǎn)工藝，主要存在生產(chǎn)工藝復(fù)雜、時間長、成本高和提取率、提純率低的問題。如中國專利申請?zhí)枮镃N200410013212.x一種豬肝金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法，具有以下5個工序，且有的工序又包含了多個分工序。1、誘導(dǎo)。2、宰殺檢測。3、粗提。在這一工序中包括以下分工序(1)將搗碎的新鮮豬肝置于第一容器，加入Tris-HCL溶液攪拌勻漿，(2)冷凍離心，取上清液置于第二容器中，(3)再加入C2H5OH-CHCL攪拌，(4)進(jìn)行第二次冷凍離心，又取上清液置于第三容器中，(5)將第三容器放入70-90℃的水浴鍋中水浴3-8min，并迅速取出冷卻至室溫，(6)進(jìn)行第三次冷凍離心，取上清液置于半透膜中，(7)用磷酸緩沖液透析，半透膜中剩余的溶液為金屬硫蛋白的粗提液。4、純化。在這一工序中又包括超率濃縮、在濃縮液中加入乙醇過夜浸提，然后，再進(jìn)行第四次冷凍離心，去上清液取沉淀物，再用Tris-HCL溶解，進(jìn)行Sephadex G-50柱層析，在柱面加入MT顯色試劑對MT組分著色；用NH4HCO3進(jìn)行洗脫，收集著色的MT段洗脫液；將收集的著色部分再進(jìn)行層析，NH4HCO3進(jìn)行梯度洗脫，自動收集器收集峰尖部分洗脫液，對洗脫液升溫真空冷凍干燥得凍干粉。5、分裝。中國專利號CN92111198.3公開了另一種鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)工藝，包括誘導(dǎo)、粗提、柱層析分離、濃縮脫鹽、分裝凍干5道工序，而且在粗提工序中又包括清洗、加入混合液、勻槳、超聲波破碎、分離去沉淀5道工序。不但工藝復(fù)雜，還因在誘導(dǎo)工序中所用的誘導(dǎo)劑是ZnCL2，所以必須有脫鹽工序，否則將嚴(yán)重影響金屬硫蛋白的提純精度和營養(yǎng)效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是，提供一種工藝簡單、提出率和提純率高的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明為解決以上問題而采取的技術(shù)解決方案是，提供一種由下例工序組成的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法。它由原料清洗，原料破碎，勻漿，過濾和提取工序組成，其特點(diǎn)是，在提取工序中采用的是真空蒸餾，然后進(jìn)行冷凝，冷凍分離和真空冷凍干燥，在真空蒸餾工序中蒸餾釜內(nèi)的溫度為35℃-60℃，冷凍分離工序中的溫度為-10℃到-90℃。這里的原料清洗，主要目的是去掉原料中的雜質(zhì)，因此可以用純蒸餾水進(jìn)行反復(fù)清洗；也可以先用生理鹽水進(jìn)行消毒清洗，再用純蒸餾水進(jìn)行多次清洗，以便去掉生理鹽水和原料中的雜質(zhì)。這里的原料破碎，是將清洗好的原料進(jìn)行破碎，以便用于下道工序的勻漿，使其與溶液充分混合。因此，原則上，破碎后的原料越細(xì)越好。破碎可以用傳統(tǒng)的破碎機(jī)進(jìn)行破碎，并過60-200目篩，也可以用超聲波粉碎處理。這里的勻漿是將粉碎好的原料與容劑充分混合，所用容劑是乙醇溶液，乙醇的含量在60％-85％之間。乙醇溶液與原料的重量比是2-4∶1。這里的過濾是用離心機(jī)過濾或用濾布進(jìn)行自然過濾，保留液體，去調(diào)殘渣。然后將液體放入蒸餾釜內(nèi)進(jìn)行蒸餾，并保證蒸餾釜處于真空狀態(tài)，蒸餾后的氣體經(jīng)冷凝器后轉(zhuǎn)換為液體，并用容器收集，然后將盛有收集液體的容器放入冷凍器內(nèi)進(jìn)行冷凍分離，保留沉淀物，并將液體(主要是乙醇)回收再利用。再對沉淀物進(jìn)行真空冷凍干燥，得鋅金屬硫蛋白產(chǎn)品，其含量在95％以上。
本發(fā)明一種較好的實施方式是，真空蒸餾工序中蒸餾釜內(nèi)的溫度為38℃-55℃，溫度過高不利于鋅金屬硫蛋白的活性，溫度偏低則影響蒸餾速度，在這一溫度范圍內(nèi)，更能保證蒸餾速度和鋅金屬硫蛋白的活性。冷凍分離工序中的溫度為-20℃到-85℃，并保持2-36小時，溫度越低，鋅金屬硫蛋與乙醇的分離速度越快，所以冷凍分離所用的時間最少，反之冷凍分離所用的時間較多。
本發(fā)明第二種較好的實施方式是，在冷凍分離和真空冷凍干燥工序之間，又增加了層析分離工序，以便分離鋅金屬硫蛋白的不同組分。在這里，可以將鋅金屬硫蛋白分離出MT-1、MT-2兩種組分，或分離出MT-1、MT-2和MT-3三種組分，MT-1、MT-2和MT-3是MT的同分異構(gòu)體，為MT的三種亞組分。在這里用傳統(tǒng)的層析分離法即可。
本發(fā)明第三種較好的實施方式是，真空蒸餾工序中蒸餾釜內(nèi)的溫度為38℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-20℃，并保持24小時。
本發(fā)明第四種較好的實施方式是，真空蒸餾工序中蒸餾釜內(nèi)的溫度為50℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-85℃，并保持2小時。
本發(fā)明第五種較好的實施方式是，真空蒸餾工序中蒸餾釜內(nèi)的溫度為55℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-50℃，并保持4小時。
由于本發(fā)明所給出技術(shù)解決方案，僅包括原料清洗，原料破碎，勻漿，過濾和提取工序，并且在提取工序中采用的是真空蒸餾，然后進(jìn)行冷凝，冷凍分離和真空冷凍干燥，在真空蒸餾工序中蒸餾釜內(nèi)的溫度為35℃-60℃，冷凍分離工序中的溫度為-10℃到-90℃。與現(xiàn)有技術(shù)相比，一是提取工序只有一道，避免了現(xiàn)有技術(shù)粗提和精提兩道工序；二是冷凍分離只有一次，而現(xiàn)有技術(shù)為四次；三是提出速度快，其速度比現(xiàn)有生產(chǎn)工藝速度提高2-4倍；四是提出率比現(xiàn)有技術(shù)高20％-40％，不但能提取兔、羊、豬、牛肝臟中的金屬硫蛋白，還能提取兔、羊、豬、牛肉內(nèi)所含的金屬硫蛋白；五是提取純度比現(xiàn)有技術(shù)提高4％以上。
具體實施例方式下面給出本發(fā)明的實施例，用來進(jìn)一步說明技術(shù)解決方案。其原料以兔肝臟中的肝、腎、心為主。兔肉，以及豬、羊、牛的肝臟或肉的加工過程與其相同。
實施例1取新鮮的含鋅金屬硫蛋白的兔肝臟5Kg，在原料清洗工序中用蒸餾水反復(fù)進(jìn)行清洗，去除一切雜質(zhì)。
在原料破碎工序中，將洗凈的兔肝臟放入粉碎機(jī)中破碎，并過60-200目篩后，放到容器中。
在勻漿工序中，將粉碎好的原料與容劑攪拌，達(dá)到充分混合，所用容劑是乙醇溶液，乙醇的含量在60％-85％之間。乙醇溶液與原料的重量比是2-4∶1，乙醇的主要作用是將原料中的鋅金屬硫蛋白浸出來，使其進(jìn)入溶液中。
在過濾工序中，將勻漿用離心機(jī)過濾，保留液體，去掉殘渣?；?qū)驖{放置到濾布中進(jìn)行自然過濾，取其濾液。
在提取工序中，先對液體進(jìn)行真空蒸餾，然后冷凝，再冷凍分離，最后進(jìn)行真空冷凍干燥。首先將過濾后的液體放入蒸餾釜內(nèi)進(jìn)行蒸餾，并保證蒸餾釜處于真空狀態(tài)，蒸餾釜內(nèi)的溫度為35℃-60℃；蒸餾后的氣體直接流入冷凝器，并轉(zhuǎn)換為液體，在冷凝器出口用容器收集；然后將盛有收集液體的容器放入溫度為-10℃到-90℃的冷凍器內(nèi)進(jìn)行冷凍分離，并保持2-36小時，保留沉淀物，并將液體(主要是乙醇)回收以便重復(fù)利用；最后對沉淀物進(jìn)行真空冷凍干燥，真空冷凍干燥技術(shù)為目前常用的技術(shù)，可得30g-35g鋅金屬硫蛋白產(chǎn)品，其含量在95％以上。
實施例2。取新鮮的含鋅金屬硫蛋白的兔肝臟5Kg，在原料清洗工序中，先用生理鹽水清洗消毒、去雜質(zhì)，然后再用蒸餾水反復(fù)清洗，去除生理鹽水和一切雜質(zhì)。
在原料破碎工序中，將洗凈的兔肝臟放入超聲波粉碎機(jī)中破碎，并將破碎后的原料放到容器中。
在勻漿工序中，將粉碎好的原料與容劑攪拌，達(dá)到充分混合，所用容劑是乙醇溶液，乙醇的含量為65％。乙醇溶液與原料的重量比是2∶1。
在過濾工序中，將勻漿用離心機(jī)過濾，保留液體，去調(diào)殘渣。或?qū)驖{放置到濾布中進(jìn)行自然過濾，取其濾液。
在提取工序中，先對液體進(jìn)行真空蒸餾，然后冷凝，再冷凍分離，最后進(jìn)行真空冷凍干燥。將過濾后的液體放入蒸餾釜內(nèi)進(jìn)行蒸餾，并保證蒸餾釜處于真空狀態(tài)，蒸餾釜內(nèi)的溫度為38℃±2℃；蒸餾后的氣體直接流入冷凝器，并轉(zhuǎn)換為液體，在冷凝器出口用容器收集；然后將盛有收集液體的容器放入溫度為-20℃的冷凍器內(nèi)進(jìn)行冷凍分離，并保持24小時，保留沉淀物，并將液體(主要是乙醇)回收以便重復(fù)利用；最后對沉淀物進(jìn)行真空冷凍干燥，得34g鋅金屬硫蛋白產(chǎn)品，其含量在95％以上。由于蒸餾釜內(nèi)的溫度偏低，所以所用時間偏長。
實施例3。原料清洗工序、原料破碎工序、過濾工序與實施例2相同。
在勻漿工序中，所用乙醇溶液的乙醇含量為75％。乙醇溶液與原料的重量比是2.5∶1。
在提取工序中，處于真空狀態(tài)的蒸餾釜溫度為50℃±2℃；冷凍分離所用冷凍器的溫度為-30℃的冷凍器內(nèi)進(jìn)行，并保持6小時，保留沉淀物，并將液體(主要是乙醇)回收以便重復(fù)利用。
將主要成分是鋅金屬硫蛋白的沉淀物進(jìn)行層析分離。在層析分離工序中，按沉淀物與蒸餾水1∶3-4.5比例混合。然后將溶液放入SephardexG-50柱進(jìn)行層析，MT-1留在柱內(nèi)，MT-2流到柱外的容器中，然后用碳酸氫氨對柱內(nèi)的MT-1進(jìn)行沖洗，并將沖洗液保存到另一個容器中，分別對MT-1溶液、MT-2溶液進(jìn)行冷凍分離，取沉淀物，并對其真空冷凍干燥既可得MT-1和MT-2。
由于蒸餾釜內(nèi)的溫度較高，故所用時間較短。又因冷凍分離所用冷凍器的溫度為-30℃，保持這種狀態(tài)僅6小時就可。增加層析分離工序后，可以將鋅金屬硫蛋白的組分進(jìn)一步分離成MT-1和MT-2。
實施例4。原料清洗工序、原料破碎工序、過濾工序、層析分離工序、真空冷凍干燥與實施例3相同。
在勻漿工序中，所用乙醇溶液的乙醇含量為85％。乙醇溶液與原料的重量比是4∶1。
在提取工序中，處于真空狀態(tài)的蒸餾釜溫度為50℃±2℃；冷凍分離所用冷凍器的溫度為-85℃的冷凍器內(nèi)進(jìn)行，并保持2小時，保留沉淀物，并將液體(主要是乙醇)回收以便重復(fù)利用。然后經(jīng)層析分離和真空冷凍干燥可得MT-1-1HE MT-2。
與實施例3相比，所用時間更短。
實施例5。原料清洗工序、原料破碎工序、過濾工序、層析分離工序、真空冷凍干燥工序與實施例3相同。
在勻漿工序中，所用乙醇溶液的乙醇含量為80％。乙醇溶液與原料的重量比是3.5∶1。
在提取工序中，處于真空狀態(tài)的蒸餾釜溫度為55℃±2℃；冷凍分離所用冷凍器的溫度為-50℃的冷凍器內(nèi)進(jìn)行，并保持4小時，保留沉淀物，并將液體(主要是乙醇)回收以便重復(fù)利用。然后再經(jīng)層析分離、真空冷凍干燥即可得MT-1和MT-2。
同理，根據(jù)本發(fā)明給出的技術(shù)解決方案，還可以給出多個實施例。
權(quán)利要求
1.一種鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法，它由原料清洗，原料破碎，勻漿，過濾和提取工序組成，其特征是，在提取工序中采用的是真空蒸餾，然后進(jìn)行冷凝，冷凍分離和真空冷凍干燥，在真空蒸餾工序中蒸餾釜內(nèi)的溫度為35℃-60℃，冷凍分離工序中的溫度為-10℃到-90℃。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法，其特征是，在真空蒸餾工序中，蒸餾釜內(nèi)的溫度為38℃-55℃，冷凍分離工序中的溫度為-20℃到-85℃，并保持2-36小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法，其特征是，在冷凍分離和真空冷凍干燥工序之間，又增加了層析分離工序，以便分離鋅金屬硫蛋白的不同組分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法，其特征是，在真空蒸餾工序中，蒸餾釜內(nèi)的溫度為38℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-20℃，并保持24小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法，其特征是，在真空蒸餾工序中，蒸餾釜內(nèi)的溫度為38℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-20℃，并保持24小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法，其特征是，在真空蒸餾工序中，蒸餾釜內(nèi)的溫度為50℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-85℃，并保持2小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法，其特征是，在真空蒸餾工序中蒸餾釜內(nèi)的溫度為50℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-85℃，并保持2小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法，其特征是，在真空蒸餾工序中，蒸餾釜內(nèi)的溫度為55℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-50℃，并保持4小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法，其特征是，在真空蒸餾工序中，蒸餾釜內(nèi)的溫度為55℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-50℃，并保持4小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法，屬于金屬硫蛋白的生產(chǎn)方法之一。它由原料清洗，原料破碎，勻漿，過濾和提取工序組成，其特點(diǎn)是，在提取工序中采用的是真空蒸餾，然后進(jìn)行冷凝，冷凍分離和真空冷凍干燥，在真空蒸餾工序中蒸餾釜內(nèi)的溫度為35℃－60℃，冷凍分離工序中的溫度為－10℃到－90℃。具有加工方法簡單，周期短，提出率和提純率高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C07K1/14GK1803840SQ20061004234
公開日2006年7月19日 申請日期2006年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月24日
發(fā)明者黃世寬 申請人:黃世寬