專利名稱：制備b類皂角苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備B類皂角苷的方法，并且特別涉及一種將B類皂角苷從含有A類皂角苷、B類皂角苷、異黃酮和低聚糖的胚軸提取物中分離并收集B類皂角苷的方法。更特別地，本發(fā)明涉及一種通過以下方式制備具有極低的A類皂角苷含量的B類皂角苷的方法將胚軸提取物加熱；在含有低級脂族醇的溶液存在下酸性沉淀；用含水的低級脂族醇洗滌；在低級脂族醇中溶解處理；用吸附劑例如硅藻土處理；和用低級脂族醇提取處理，該方法使得能夠有效地大規(guī)模生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
大豆胚軸含有A類皂角苷、異黃酮等以及B類皂角苷，并且通常公知的是該胚軸含有作為異黃酮的黃豆苷原、染料木黃酮、黃豆黃素等；這些的糖苷即黃豆苷、染料木苷、黃豆黃苷(glycitin)等；這些糖苷的丙二酰酯和乙酰酯；等等(參見非專利文獻1)。
術(shù)語“A類皂角苷”是用于指代各自含有大豆皂草精醇(soyasapogenol)A作為糖苷配基的大豆皂角苷A1-A6及其乙?；问降耐ㄓ眯g(shù)語，而術(shù)語“B類皂角苷”是用于指代各自含有大豆皂草精醇B作為糖苷配基的大豆皂角苷I-V和指代在大豆皂角苷I-V的C-22羥基位置具有2，3-二氫-2，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮(DDMP)的化合物的通用術(shù)語(參見非專利文獻2和3)。
另外，大豆皂角苷I和V還分別被稱作大豆皂角苷Bb和大豆皂角苷Ba(參見非專利文獻3)。
例如，專利文獻1披露了一種通過以下方式獲得大豆皂角苷的方法用甲醇將大豆原料粉末處理以得到提取物；用正丁醇和水將該提取物分開；然后通過柱色譜由丁醇層將提取物精制。
專利文獻2描述了一種方法，其包括將大豆提取物吸附到ODS柱上；將其洗提；引入色譜以收集皂角苷級分；和將預期的大豆皂角苷分離。
然而，通過這些方法得到的大豆皂角苷具有低的純度并且含有許多外來物質(zhì)(例如大豆異黃酮)。Shimoyamada等(參見非專利文獻4)報導了通過以下方式增強了將大豆皂角苷I轉(zhuǎn)移到正丁醇相中的能力用70％乙醇將大豆胚軸提??；在減壓下將提取物濃縮；將殘余物溶解在正丁醇-水(1∶1)中；和控制pH。然而，該文獻沒有提及將大豆異黃酮轉(zhuǎn)移到正丁醇相中和能夠?qū)類皂角苷轉(zhuǎn)移到正丁醇相和水相中，以致于該文獻被認為沒有披露將高純度的B類皂角苷精制的方法。
專利文獻1JP昭61-7285專利文獻2JP平6-100583非專利文獻1S.Kudou、Y.Fleury、D.Welti、D.Magnolato、T.Uchida、K.Kitamura和K.Okubo，Agric.Biol.Chem.，55，2227-2233(1991)。
非專利文獻2M.Shiraiwa、K.Harada和K.Okubo，Agric.Biol.Chem.，55，911-917(1991)。
非專利文獻3Y.Yoshiki、S.Kudou和K.Okubo，Biosci.Biotechnol.Biochem.，62，2291-2299(1998)。
非專利文獻4M.Shimoyamada、K.Okubo、M.Yoshikoshi、Y.Yoshiki和K.Watanabe，F(xiàn)ood Sci.Technol.，Int.，1，112-114(1995)。
發(fā)明公開本發(fā)明解決的問題 關(guān)鍵問題是建立一種制備作為具有抑制肝損害作用的三萜烯化合物ME3738(大豆皂草精醇B的甲基衍生物，參見JP3279574B和Klein C.等，Eur.J.Immunol.，33，2251-2261(2003))的原料的大豆皂角苷B的方法，該方法能夠以低的價格大規(guī)模生產(chǎn)。然而，在上述通過色譜而將大豆皂角苷B分離/精制的方法中，吸附在將被使用的多種載體上的大豆皂角苷B的數(shù)量少，以致于該方法需要大量載體用于色譜、復雜的步驟和高的生產(chǎn)成本以由原材料(大豆、大豆胚軸和脫脂的大豆)制備大量精制的大豆皂角苷B(每年幾十噸)，并且并不實際。
解決問題的方式 本發(fā)明的發(fā)明人在該背景上進行了廣泛的研究并且建立了一種能夠以低成本大規(guī)模生產(chǎn)的由大豆脫脂的胚軸提取物獲得具有極低的A類皂角苷含量的B類皂角苷的方法，由此完成了本發(fā)明。
即是說，根據(jù)權(quán)利要求1的本發(fā)明涉及一種制備B類皂角苷的方法，特征在于包括以下步驟(1)通過在酸性條件下將低級脂族醇或含水的低級脂族醇加入到包含提取的大豆皂角苷的級分中而形成沉淀物的步驟；(2)將在前一步驟中得到的沉淀物用含水的低級脂族醇洗滌并且將它們?nèi)芙庠诘图壷宕贾械牟襟E；(3)將在前一步驟中得到的溶液濃縮、向其中加入水、在酸性條件下形成沉淀物和將產(chǎn)生的沉淀物吸附/收集在載體上的步驟；和(4)將在前一步驟中得到的載體用脂溶性溶劑洗滌并且用低級脂族醇將它們提取的步驟。
進一步地，根據(jù)權(quán)利要求2的本發(fā)明涉及一種制備精制的B類皂角苷的方法，特征在于必要時將在根據(jù)權(quán)利要求1的步驟(4)中得到的提取物濃縮以形成B類皂角苷的固體產(chǎn)物。
此外，根據(jù)權(quán)利要求3的本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，特征在于包含提取的大豆皂角苷的級分是包含得自于大豆脫脂的胚軸提取物的大豆皂角苷的提取物。
根據(jù)權(quán)利要求4的本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求2的方法，特征在于其進一步包括以下步驟采用含水的低級脂族醇對根據(jù)權(quán)利要求2的精制的B類皂角苷進行漿洗或者將該皂角苷溶解在低級脂族醇中、向其中加入水并且進行固-液分離。
根據(jù)權(quán)利要求5的本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項的方法，特征在于所得的B類皂角苷固體產(chǎn)物的純度為50％或更大。
根據(jù)權(quán)利要求6的本發(fā)明涉及一種制備B類皂角苷的方法，特征在于包括以下步驟(1)通過在酸性條件下將低級脂族醇或含水的低級脂族醇加入到包含提取的大豆皂角苷的級分中而形成沉淀物的步驟；(2)將在前一步驟中得到的沉淀物用含水的低級脂族醇洗滌并且將它們?nèi)芙庠诘图壷宕贾械牟襟E；(3)必要時在酸性條件下處理通過將在前一步驟中得到的溶液濃縮而得到的固體產(chǎn)品以形成沉淀物的步驟；和(4)將在前一步驟中得到的固體產(chǎn)品或沉淀物用脂溶性溶劑洗滌并且將它們干燥的步驟。
根據(jù)權(quán)利要求7的本發(fā)明涉及一種制備B類皂角苷的方法，特征在于包括以下步驟(1)將低級脂族醇或含水的低級脂族醇加入到包含提取的大豆皂角苷的級分中、在酸性條件下進行固-液分離并且收集固體部分的步驟；和(2)將在前一步驟中得到的固體部分溶解在含水的低級脂族醇中并且將產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)除去的步驟。
根據(jù)權(quán)利要求8的本發(fā)明涉及一種制備B類皂角苷的方法，特征在于包括以下步驟(1)將低級脂族醇或含水的低級脂族醇加入到包含提取的大豆皂角苷的級分中、在酸性條件下進行固-液分離并且收集固體部分的步驟；(2)將在前一步驟中得到的固體部分溶解在含水的低級脂族醇中并且將產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)除去的步驟；(3)必要時在酸性條件下處理通過將在前一步驟中得到的溶液濃縮而得到的固體產(chǎn)品以形成沉淀物的步驟；和
(4)將在前一步驟中得到的固體產(chǎn)品或沉淀物用脂溶性溶劑洗滌并且將它們干燥的步驟。
發(fā)明效果 本發(fā)明提供了一種由胚軸提取物有效并且穩(wěn)定地制備具有極低的A類皂角苷含量的B類皂角苷的方法。
本發(fā)明的方法是一種不需要使用帶有多種載體的柱色譜而制備B類皂角苷的方法，并且使得能夠以低成本大規(guī)模生產(chǎn)這些物質(zhì)。
B類皂角苷被期望用作具有抑制肝損害作用的大豆皂草精醇B的甲基衍生物的商業(yè)化原料。
實施本發(fā)明的最好方式 在下文中，將詳細描述根據(jù)本發(fā)明的由大豆脫脂的胚軸提取物制備具有極低的A類皂角苷含量的B類皂角苷的方法。
首先將描述權(quán)利要求1中所描述的方法。首先，用低級脂族醇或含水的低級脂族醇從大豆脫脂的胚軸提取物中提取大豆皂角苷。將用于該步驟的低級脂族醇的濃度沒有特別限制，但優(yōu)選為60-100％。將被使用的低級脂族醇包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇等，并且沒有特別限制，但在不僅將大豆皂角苷而且將被用于食品等的組分從提取的產(chǎn)物中分離的情況下，優(yōu)選乙醇。
將低級脂族醇(例如乙醇)從提取液中蒸出并且將水加入到殘余物中，隨后加熱處理以由此使實際的皂角苷分解成大豆皂角苷。在該過程中，加熱溫度優(yōu)選為80-100℃，特別優(yōu)選為90-95℃。同時，加熱時間沒有特別限制并且可以是用于將實際的皂角苷分解成大豆皂角苷所需的時間，合適的時間通常為6-24小時，優(yōu)選20-24小時。
隨后，將低級脂族醇或者水和低級脂族醇加入到該熱處理的溶液中。將用于該過程的低級脂族醇沒有特別限制，但優(yōu)選為甲醇或乙醇，并且加入量相對于通過加入水而得到的溶液而言為10-30％。將酸加入由此制得的稀釋溶液中以調(diào)節(jié)pH。將用于該過程的酸沒有限制，但優(yōu)選為鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸等。
用酸調(diào)節(jié)的pH為0.5-3.5，優(yōu)選為1.0-2.5。在pH調(diào)節(jié)之后，必要時將溶液攪拌。將通過該步驟產(chǎn)生的沉淀物進行固-液分離方法例如過濾、潷析或離心分離，以由此收集沉淀物(固體產(chǎn)品)。
將所得的沉淀物用含水的低級脂族醇洗滌，并且將洗滌的沉淀物溶解在低級脂族醇中同時通過過濾等將產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)除去。將用于該過程的低級脂族醇優(yōu)選為甲醇、乙醇等。
隨后，將濾液濃縮并且將水加入濃縮物中，隨后用酸調(diào)節(jié)pH。將用于該過程的酸沒有特別限制，但優(yōu)選使用鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸等。用酸調(diào)節(jié)的pH為0.5-3.5，優(yōu)選為1.0-2.5。
將在酸性條件下產(chǎn)生的沉淀物吸附在載體(具有吸附能力的物質(zhì)例如某些類型的硅藻土，優(yōu)選Radiolite 600、800、900等)上。此后，通過離心分離、過濾等，優(yōu)選通過籃式離心分離將載體分離并且收集。
隨后，將載體用有機溶劑洗滌。用于洗滌的有機溶劑沒有限制，但使用的溶劑通常為脂溶性溶劑，優(yōu)選乙酸乙酯。在該過程中，必要時加入水。在用乙酸乙酯等洗滌之后，通過加入低級脂族醇例如甲醇進行提取。
如權(quán)利要求2中所述，將所得的提取物濃縮以由此得到精制的B類皂角苷(純度50％或更大)的固體產(chǎn)品(優(yōu)選粉末、晶體等)。
如上所述，可以獲得具有極低的A類皂角苷含量的B類皂角苷。此外，為了提高所得的B類皂角苷的純度，進行以下步驟如權(quán)利要求4中所述，采用含水的低級脂族醇(優(yōu)選甲醇等)對皂角苷進行漿洗或者將皂角苷溶解在低級脂族醇中，然后通過加入水而重新沉淀，隨后采用離心分離等固-液分離，由此得到較高純度的B類皂角苷。
在描述于權(quán)利要求6的方法中，正如在描述于權(quán)利要求1的以上方法的情形那樣，在酸性條件下由包含提取的大豆皂角苷的級分形成沉淀物，然后用含水的低級脂族醇洗滌，并且將洗滌的沉淀物溶解在低級脂族醇中。用于這些操作的低級脂族醇等與上述的相同。
隨后，將沉淀物的低級脂族醇溶液濃縮以得到固體產(chǎn)品。如果需要，則在酸性條件下將固體產(chǎn)品處理以由此形成沉淀物。用于該過程的酸沒有特別限制，但如同上述情形中那樣優(yōu)選使用鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸等。調(diào)節(jié)的pH為0.5-3.5，優(yōu)選為1.0-2.5。
用脂溶性溶劑，優(yōu)選乙酸乙酯將固體產(chǎn)品或沉淀物洗滌一次或幾次，隨后干燥。可以采用真空干燥器等來進行干燥。如上所述，可以得到高純度的B類皂角苷。
同時，在描述于權(quán)利要求7的方法中，首先將低級脂族醇或含水的低級脂族醇加入到包含提取的大豆皂角苷的級分中，并且在酸性條件下進行固-液分離，隨后收集固體部分。將所得的固體部分溶解在含水的低級脂族醇中，并且將該過程中產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)除去以由此得到預期的B類皂角苷。注意的是用于這些操作的低級脂族醇等與上述的相同。
在描述于權(quán)利要求8的方法中，如同描述于權(quán)利要求7的以上方法的情形那樣，在酸性條件下將包含提取的大豆皂角苷的級分進行固-液分離，收集固體部分并且然后將其溶解在含水的低級脂族醇中，隨后除去該過程中產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)。隨后，將所得溶液濃縮以得到固體產(chǎn)品。必要時在酸性條件下將固體產(chǎn)品處理以由此形成沉淀物。該處理與描述于權(quán)利要求6的以上方法相同。
用脂溶性溶劑，優(yōu)選乙酸乙酯將由此得到的固體產(chǎn)品或沉淀物洗滌一次或幾次，隨后干燥。如上所述，可以采用真空干燥器等來進行干燥。由此可以得到高純度的B類皂角苷。
順便提及，下面將描述在上述操作中包含在大豆脫脂的胚軸中的異黃酮的性狀。當將酸加入熱處理溶液的稀釋液中以調(diào)節(jié)pH隨后固-液分離時，大部分異黃酮被轉(zhuǎn)移到液體中。同時，當將沉淀物洗滌時，殘余的異黃酮被轉(zhuǎn)移到洗液中。此外，當將洗滌的沉淀物溶解在低級脂族醇中時，少量異黃酮與皂角苷一起也被轉(zhuǎn)移到可溶性部分中。當將該可溶性部分濃縮隨后用酸調(diào)節(jié)pH時，異黃酮從皂角苷中分離并且被轉(zhuǎn)移到可溶性部分中。隨后，當將吸附有皂角苷的載體用有機溶劑洗滌時，極少量的殘余異黃酮被轉(zhuǎn)移到可溶性部分中并且從皂角苷中分離。
實施例 在下文中將特別通過實施例來描述本發(fā)明的方法，但本發(fā)明并不限于這些實施例。
注意的是分析大豆皂角苷、大豆皂草精醇和異黃酮的方法如下。同時，大豆皂草精醇A和B的含量以大豆皂草精醇A和B的重量表示，其是在酸性條件下提取/精制期間通過各種樣品的甲醇分析得到的A和B類皂角苷的糖苷配基部分。
大豆皂角苷分析方法高效液相色譜(HPLC)條件檢測器UV 210nm柱L-柱ODS，250×4.6nm，5μm恒溫槽40℃流動相CH3CN∶0.05％TFA水溶液＝40∶60流速1.0mL/min標準制劑如下制備大豆皂角苷Ba和Bb在減壓下將通過用60％乙醇溶液將大豆脫脂的胚軸處理而獲得的提取產(chǎn)物干燥，通過ODS柱色譜將所得的固體內(nèi)容物精制并且通過HPLC分析，并且收集面積百分比為98％或更大的所得樣品作為標準制劑。
大豆皂草精醇分析方法(一般而言，將通過將糖部分從大豆皂角苷中除去而得到的糖苷配基部分稱作大豆皂草精醇)準確稱量300mg樣品，并且將12mL 10％的氯化氫-甲醇加入其中，隨后在油浴中在85℃下伴隨著加熱而回流1小時。隨后將10mL水和45mL乙醇加入反應液，并且用25％NaOH和2.5％NaOH將溶液調(diào)節(jié)至pH4-7，然后用80％乙醇將體積調(diào)節(jié)至100mL，由此制得樣品溶液。同時，分別準確稱量(各自約10mg)大豆皂草精醇A和B(標準制劑)，并且在使用之前用乙醇將每一種的體積調(diào)節(jié)至100mL。在以下條件下通過HPLC分析樣品和標準溶液。
HPLC條件檢測器UV 210nm柱L-柱ODS，250×4.6nm，5μm恒溫槽40℃流動相CH3CN∶H2O∶MeOH＝60∶30∶10流速1.0mL/min標準制劑通過硅膠柱色譜從大豆餅和大豆粉中精制大豆皂草精醇B和A并且通過HPLC分析，并且收集面積百分比為98％或更大的所得樣品作為標準制劑。
異黃酮分析方法(根據(jù)日本健康食品和營養(yǎng)食品協(xié)會(Japan Health Food & Nutrition Food Association)的方法分析異黃酮，并且通過HPLC測量三種大豆異黃酮)。將黃豆苷的標準制劑用于測量，并且將除了黃豆苷之外的異黃酮通過將各自異黃酮的定量系數(shù)相乘而轉(zhuǎn)化。異黃酮的HPLC條件和定量系數(shù)在下面示出。
HPLC條件檢測器UV 254nm柱ODS柱5μm 250×4.6mm Develosil ODS-7恒溫槽35℃流動相0.1％乙酸水溶液/乙腈混合溶液(85∶15→65∶35，50分鐘線性梯度)流速1.0mL/min注射體積10μL [表1]大豆異黃酮的定量系數(shù)
實施例1在用60％乙醇從大豆脫脂的胚軸提取物中提取大豆皂角苷之后，將乙醇從所得溶液中蒸出并且將水加入所得殘余物中，隨后在90-93℃下加熱16.5小時。
隨后，將2000mL水和800mL乙醇加入到2000mL該熱處理的溶液(固含量36.2％、大豆皂角苷Ba5.53g、大豆皂角苷Bb18.81g、大豆皂草精醇A內(nèi)容物17.40g、大豆皂草精醇B內(nèi)容物13.77g、黃豆苷13.76g、黃豆黃苷8.26g和染料木苷4.50g)中，然后用6N-鹽酸將混合物調(diào)節(jié)至pH2.5并且攪拌3小時，隨后離心分離以收集沉淀物。在該過程中，將大豆皂角苷Ba0.28g、大豆皂角苷B2.41g、大豆皂草精醇A內(nèi)容物13.11g、大豆皂草精醇B內(nèi)容物1.64g、黃豆苷11.67g、黃豆黃苷6.77g和染料木苷3.45g轉(zhuǎn)移到4265mL濾液(固含量12.8％)中。
將通過離心分離得到的沉淀物用7000mL 10％甲醇洗滌。6910mL的洗液(固含量1.88％)不合大豆皂角苷Ba、大豆皂角苷Bb和大豆皂草精醇B，而大豆皂草精醇A內(nèi)容物3.81g、黃豆苷1.68g、黃豆黃苷0.89g和染料木苷0.49g被轉(zhuǎn)移到其中。
隨后，將洗滌的沉淀物溶解在2000mL甲醇中，并且通過過濾將產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)除去。將大豆皂角苷Ba5.69g、大豆皂角苷Bb17.30g、大豆皂草精醇A內(nèi)容物3.71g、大豆皂草精醇B內(nèi)容物12.35g、黃豆苷0.23g、黃豆黃苷0.11g和染料木苷0.44g轉(zhuǎn)移到2930mL濾液(固含量2.95％)中。
將濾液中的甲醇層濃縮，并且向900mL濃縮物中加入1500mL水，隨后用1N-鹽酸將pH調(diào)節(jié)至2.5。將所得沉淀物吸附在硅藻土(Radiolite 800)上，并且通過離心分離收集硅藻土。1820mL的濾液(固含量0.28％)不含大豆皂角苷Ba，而大豆皂角苷Bb0.04g、大豆皂草精醇A內(nèi)容物0.61g、大豆皂草精醇B內(nèi)容物0.08g、黃豆苷0.15g、黃豆黃苷0.07g和染料木苷0.16g被轉(zhuǎn)移到其中。
隨后，將載有被吸附物的硅藻土用3000mL甲醇洗滌。3840mL的洗液(固含量0.06％)不含大豆皂角苷Ba和大豆皂角苷Bb，并且大豆皂草精醇A內(nèi)容物0.11g、大豆皂草精醇B內(nèi)容物0.05g、黃豆苷0.05g、黃豆黃苷0.02g和染料木苷0.08g被轉(zhuǎn)移到其中。
通過將2000mL甲醇加入硅藻土中而進行提取。將大豆皂角苷Ba5.50g、大豆皂角苷Bb16.52g、大豆皂草精醇A內(nèi)容物2.03g和大豆皂草精醇B內(nèi)容物13.45g轉(zhuǎn)移到2480mL所得的提取液(固含量3.15％)中。將2060mL甲醇提取液濃縮，并且將乙酸乙酯和水加入其中，隨后粉化，由此得到15.17g精制的皂角苷。
將所得的精制皂角苷通過高效液相色譜進行分析，并且發(fā)現(xiàn)含有大豆皂角苷Bb(45.7％)和大豆皂角苷Ba(24.8％)以及具有對于B類皂角苷為70.5％的純度。
為了在將B和A類皂角苷轉(zhuǎn)化成作為各自皂角苷的糖苷配基部分的大豆皂草精醇B和A之后確定所含有的B和A類皂角苷的比例，伴隨著加熱將所得的精制皂角苷在10％鹽酸/甲醇中回流1小時以將它們轉(zhuǎn)化成大豆皂草精醇，隨后通過HPLC分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所含有的大豆皂草精醇B和A的比例分別為34.5％和3.9％。
測量結(jié)果示于表2中。在該表中，縮寫B(tài)a、Bb、Soya A和Soya B分別表示大豆皂角苷Ba、大豆皂角苷Bb、大豆皂草精醇A和大豆皂草精醇B。
[表2]
實施例2將45g通過根據(jù)實施例1的方法得到的B類皂角苷(大豆皂角苷B的純度約60％，所含的大豆皂草精醇B的比例29.8％，所含的大豆皂草精醇A的比例4.2％)懸浮于甲醇(675mL)和水(675mL)的混合溶液中，并且伴隨著加熱在40℃下將懸浮液攪拌并且離心分離。
將所得的沉淀物進一步懸浮于甲醇(225mL)和水(225mL)的混合溶液中，并且將懸浮液離心分離。進一步重復相同的操作，由此得到27.5g具有較高純度的精制皂角苷(大豆皂角苷B的純度約82％，所含的大豆皂草精醇B的比例40.8％，所含的大豆皂草精醇A的比例0.54％)。
實施例3將69.9g通過根據(jù)實施例1的方法得到的B類皂角苷(大豆皂角苷B的純度約47％，所含的大豆皂草精醇B的比例23.5％，所含的大豆皂草精醇A的比例5.6％)溶解在1050mL甲醇中，并且在攪拌下將1050mL水緩慢滴加同時將溫度保持在40℃，隨后離心分離，由此得到27.5g具有較高純度的精制皂角苷(大豆皂角苷B的純度約88％，所含的大豆皂草精醇B的比例44.0％，所含的大豆皂草精醇A的比例0.53％)。
實施例4在用60％乙醇從大豆脫脂的胚軸提取物中提取大豆皂角苷之后，將乙醇從所得溶液中蒸出并且將水加入所得殘余物中，隨后在90-93℃下加熱16.5小時。
隨后，將700mL水和280mL乙醇加入到700mL該熱處理的溶液(固含量36.2％、大豆皂角苷Ba1.94g、大豆皂角苷Bb6.58g、大豆皂草精醇A內(nèi)容物6.09g、大豆皂草精醇B內(nèi)容物4.81g、黃豆苷4.82g、黃豆黃苷2.89g和染料木苷1.58g)中，然后用6N-鹽酸將混合物調(diào)節(jié)至pH2.5并且攪拌2小時，隨后離心分離以由此收集沉淀物(大豆皂角苷B8.52g)。另一方面，證實大豆皂角苷Ba85mg和大豆皂角苷Bb729mg被轉(zhuǎn)移到1525mL濾液中。
實施例5將在實施例4中得到的沉淀物(大豆皂角苷B4.25g)用1400mL 10％乙醇洗滌。大豆皂角苷Ba、大豆皂角苷Bb和大豆皂草精醇B沒有被轉(zhuǎn)移到1340mL所得的洗液中。另一方面，將洗滌的沉淀物溶解在695mL 70％乙醇中，并且通過過濾將產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)除去。注意到136mg大豆皂角苷B(產(chǎn)率3.2％)被轉(zhuǎn)移到不溶性物質(zhì)中。
大豆皂角苷Ba0.99g和大豆皂角苷Bb3.13g被轉(zhuǎn)移到652mL濾液(固含量15.9％)中(回收率96.9％)。
將95mL濾液(大豆皂角苷Ba145mg、大豆皂角苷Bb457mg)濃縮至24mL，并且將所得的沉淀物用5mL和10mL乙酸乙酯洗滌兩次，隨后將沉淀物離心分離。此后進行干燥，由此得到487mg精制的皂角苷(純度72.2％，大豆皂角苷Ba107mg和大豆皂角苷Bb245mg)。
將B類皂角苷和A類皂角苷轉(zhuǎn)化成大豆皂草精醇B和大豆皂草精醇A(其糖苷配基部分)，然后測量皂角苷含量。即，伴隨著加熱將所得的精制皂角苷在10％鹽酸/甲醇中回流1小時以將其轉(zhuǎn)化成皂草精醇，隨后通過高效液相色譜進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所含的皂草精醇B和A的比例分別為35.7％和1.7％。
實施例6在用60％乙醇從大豆脫脂的胚軸提取物中提取大豆皂角苷之后，將乙醇從所得溶液中蒸出并且將水加入所得殘余物中，隨后在90-93℃下加熱16.5小時。
隨后，將2000mL水和800mL乙醇加入到2000mL該熱處理的溶液(固含量36.2％、大豆皂角苷Ba5.53g、大豆皂角苷Bb18.81g、大豆皂草精醇A內(nèi)容物17.40g、大豆皂草精醇B內(nèi)容物13.77g、黃豆苷13.76g、黃豆黃苷8.26g和染料木苷4.50g)中，然后用6N-鹽酸將混合物調(diào)節(jié)至pH2.5并且攪拌3小時，隨后離心分離以收集沉淀物(大豆皂角苷B23.43g)。同時，證實大豆皂角苷Ba90mg、大豆皂角苷Bb821mg、大豆皂草精醇A內(nèi)容物12.39g和大豆皂草精醇B內(nèi)容物1.62g被轉(zhuǎn)移到4196mL濾液中。
實施例7將在實施例6中得到的沉淀物(大豆皂角苷B11.73g)用3500mL10％乙醇洗滌。大豆皂角苷Ba和大豆皂角苷Bb沒有被轉(zhuǎn)移到3500mL所得的洗液中，而大豆皂草精醇B55mg和大豆皂草精醇A681mg被轉(zhuǎn)移到其中。同時，將洗滌的沉淀物溶解在2750mL 70％乙醇中，并且通過過濾將產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)除去。注意到282mg大豆皂角苷B(產(chǎn)率2.3％)被轉(zhuǎn)移到不溶性物質(zhì)中。
大豆皂角苷Ba2.80g、大豆皂角苷Bb8.78g、大豆皂草精醇B6.45g和大豆皂草精醇A1.97g(回收率95.0％)被轉(zhuǎn)移到2940mL濾液中。
將610mL濾液(大豆皂角苷Ba581mg、大豆皂角苷Bb1.82g)濃縮至100mL，并且加入100mL水，隨后用1N-鹽酸調(diào)節(jié)至pH2.5。將混合物離心分離，并且將所得沉淀物用40mL乙酸乙酯洗滌，隨后將沉淀物離心分離。此后進行干燥，由此得到2.91g精制的皂角苷(純度63.0％，大豆皂角苷Ba489mg、大豆皂角苷Bb1.34g)。
同時，將大豆皂角苷Ba9.6mg、大豆皂角苷Bb246mg、大豆皂草精醇B167mg和大豆皂草精醇A284mg轉(zhuǎn)移到在產(chǎn)生的沉淀物中得到的廢母液中。
將B類皂角苷和A類皂角苷轉(zhuǎn)化成大豆皂草精醇B和大豆皂草精醇A(其糖苷配基部分)，然后測量皂角苷含量。即，伴隨著加熱將所得的精制皂角苷在10％鹽酸/甲醇中回流1小時以將其轉(zhuǎn)化成皂草精醇，隨后通過高效液相色譜進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所含的皂草精醇B和A的比例分別為36.1％和4.5％。結(jié)果示于表3中。
[表3]
實施例8將在實施例4中得到的沉淀物(大豆皂角苷B4.27g)用1400mL 30％乙醇洗滌。大豆皂角苷Ba21mg和大豆皂角苷Bb150mg被轉(zhuǎn)移到1395mL所得的洗液中。將洗滌的沉淀物溶解在490mL 70％乙醇中，并且通過過濾將產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)除去。大豆皂角苷Ba0.97g和大豆皂角苷Bb2.91g被轉(zhuǎn)移到440mL濾液(固含量19.1％)中(回收率91.0％)。同時，249mg大豆皂角苷B(產(chǎn)率5.8％)被轉(zhuǎn)移到所產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)中。
實施例9將70mL在實施例8中得到的濾液(大豆皂角苷Ba154mg、大豆皂角苷Bb463mg)濃縮至24mL，并且將所得的沉淀物用5mL和10mL乙酸乙酯洗滌兩次。隨后將沉淀物離心分離并且干燥，由此得到171mg精制的皂角苷(純度81.9％，大豆皂角苷Ba51mg、大豆皂角苷Bb90mg，回收率21％)。
將B類皂角苷和A類皂角苷轉(zhuǎn)化成大豆皂草精醇B和大豆皂草精醇A(其糖苷配基部分)，然后測量皂角苷含量。即，伴隨著加熱將所得的精制皂角苷在10％鹽酸/甲醇中回流1小時以將其轉(zhuǎn)化成皂草精醇，隨后通過高效液相色譜進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所含的皂草精醇B和A的比例分別為39.8％和0.6％。
實施例10將在實施例6中得到的沉淀物(大豆皂角苷B11.70g)用3500mL30％乙醇洗滌。大豆皂角苷Ba36mg和大豆皂角苷Bb313mg被轉(zhuǎn)移到3550mL所得的洗液中。將洗滌的沉淀物溶解在2660mL 70％乙醇中，并且通過過濾將產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)除去。大豆皂角苷Ba2.83g、大豆皂角苷Bb8.65、大豆皂草精醇B5.90g和大豆皂草精醇A0.91g被轉(zhuǎn)移到2160mL濾液中(回收率94.5％)。同時，359mg大豆皂角苷B(產(chǎn)率3.0％)被轉(zhuǎn)移到所產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)中。
將470mL在該過程中得到的濾液(大豆皂角苷Ba616mg、大豆皂角苷Bb1.88g)濃縮至100mL，并且加入100mL水，隨后用1N-鹽酸調(diào)節(jié)至pH2.5。將混合物離心分離，并且將所得的沉淀物用40mL乙酸乙酯洗滌。隨后將沉淀物離心分離并且干燥，由此得到2.50g精制的皂角苷(純度73.5％，大豆皂角苷Ba518mg、大豆皂角苷Bb1.32g，回收率69.5％)。
將B類皂角苷和A類皂角苷轉(zhuǎn)化成大豆皂草精醇B和大豆皂草精醇A(其糖苷配基部分)，然后測量皂角苷含量。即，伴隨著加熱將所得的精制皂角苷在10％鹽酸/甲醇中回流1小時以將其轉(zhuǎn)化成皂草精醇，隨后通過高效液相色譜進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所含的皂草精醇B和A的比例分別為40.6％和2.2％。所得結(jié)果示于表4中。
[表4]
實施例11將200mL水和80mL乙醇加入到實施例1中所示的2000mL熱處理溶液的200mL等分試樣中，將混合物用6N-鹽酸調(diào)節(jié)至pH2.5并且攪拌2小時，隨后離心分離，由此收集沉淀物。將使用700mL表5中示出的洗滌溶劑將所得沉淀物洗滌的步驟重復兩次，并且將沉淀物溶解在200mL表5中所示的提取溶劑中，隨后過濾以除去所產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)。將濾液濃縮并且干燥，測量大豆皂角苷B的含量。大豆皂角苷B的回收率和大豆皂角苷B的純度示于表5中。
[表5]

工業(yè)實用性 本發(fā)明提供一種能夠以低成本大規(guī)模生產(chǎn)制備大豆皂角苷B的方法。大豆皂角苷B是被用作大豆皂草精醇B原料的一種物質(zhì)，并且可用于制備具有抑制肝損害作用的大豆皂草精醇B的甲基衍生物。
權(quán)利要求
1.一種制備B類皂角苷的方法，特征在于包括以下步驟(1)通過在酸性條件下將低級脂族醇或含水的低級脂族醇加入到包含提取的大豆皂角苷的級分中而形成沉淀物的步驟；(2)將在前一步驟中得到的沉淀物用含水的低級脂族醇洗滌并且將它們?nèi)芙庠诘图壷宕贾械牟襟E；(3)將在前一步驟中得到的溶液濃縮、向其中加入水、在酸性條件下形成沉淀物和將產(chǎn)生的沉淀物吸附/收集在載體上的步驟；和(4)將在前一步驟中得到的載體用脂溶性溶劑洗滌并且用低級脂族醇將它們提取的步驟。
2.一種制備精制的B類皂角苷的方法，特征在于必要時將在根據(jù)權(quán)利要求1的步驟(4)中得到的提取物濃縮以形成B類皂角苷的固體產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，特征在于包含提取的大豆皂角苷的級分是包含得自于大豆脫脂的胚軸提取物的大豆皂角苷的提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，特征在于進一步包括以下步驟采用含水的低級脂族醇對根據(jù)權(quán)利要求2的精制的B類皂角苷進行漿洗或者將該皂角苷溶解在低級脂族醇中、向其中加入水和進行固-液分離。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項的方法，特征在于所得的B類皂角苷固體產(chǎn)物的純度為50％或更大。
6.一種制備B類皂角苷的方法，特征在于包括以下步驟(1)通過在酸性條件下將低級脂族醇或含水的低級脂族醇加入到包含提取的大豆皂角苷的級分中而形成沉淀物的步驟；(2)將在前一步驟中得到的沉淀物用含水的低級脂族醇洗滌并且將它們?nèi)芙庠诘图壷宕贾械牟襟E；(3)必要時在酸性條件下處理通過將在前一步驟中得到的溶液濃縮而得到的固體產(chǎn)品以形成沉淀物的步驟；和(4)將在前一步驟中得到的固體產(chǎn)品或沉淀物用脂溶性溶劑洗滌并且將它們干燥的步驟。
7.一種制備B類皂角苷的方法，特征在于包括以下步驟(1)將低級脂族醇或含水的低級脂族醇加入到包含提取的大豆皂角苷的級分中、在酸性條件下進行固-液分離并且收集固體部分的步驟；和(2)將在前一步驟中得到的固體部分溶解在含水的低級脂族醇中并且將產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)除去的步驟。
8.一種制備B類皂角苷的方法，特征在于包括以下步驟(1)將低級脂族醇或含水的低級脂族醇加入到包含提取的大豆皂角苷的級分中、在酸性條件下進行固-液分離并且收集固體部分的步驟；(2)將在前一步驟中得到的固體部分溶解在含水的低級脂族醇中并且將產(chǎn)生的不溶性物質(zhì)除去的步驟；(3)必要時在酸性條件下處理通過將在前一步驟中得到的溶液濃縮而得到的固體產(chǎn)品以形成沉淀物的步驟；和(4)將在前一步驟中得到的固體產(chǎn)品或沉淀物用脂溶性溶劑洗滌并且將它們干燥的步驟。
全文摘要
本發(fā)明旨在建立一種以低成本大規(guī)模制備作為肝炎治療劑ME3738(大豆皂草精醇B的甲基衍生物)的原料的大豆皂角苷B的方法。提供了一種制備B類皂角苷的方法，特征在于包括以下步驟(1)在酸性條件下將低級脂族醇或含水的低級脂族醇加入到包含提取的大豆皂角苷的級分中以形成沉淀物；(2)將在前一步驟中得到的沉淀物用低級脂族醇或含水的低級脂族醇洗滌并且將洗滌的沉淀物溶解在低級脂族醇中；(3)將在前一步驟中得到的溶液濃縮，在酸性條件下加入水以形成沉淀物，并且將產(chǎn)生的沉淀物吸附/收集在載體上；和(4)將在前一步驟中得到的載體用脂溶性溶劑洗滌并且用低級脂族醇將它們提取。
文檔編號C07H15/256GK1938327SQ200580010148
公開日2007年3月28日 申請日期2005年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月30日
發(fā)明者長谷川俊文, 吉川瑛一, 加藤清隆, 高木史郎, 木村昌昭 申請人:明治制果株式會社