專利名稱：抗原生動物的皂角苷類的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于從紫金牛(Myrsinaceae)科植物中分離抗原生動物皂角苷類的方法及該皂角苷類制備藥物的用途，該藥物用于治療感染利什曼原蟲屬原生動物寄生蟲的宿主(人類及動物)，及減輕該宿主中利什曼原蟲病的臨床表現(xiàn)形式及治愈利什曼原蟲病。
利什曼原蟲病有許多不同的疾病表現(xiàn)形式，其嚴(yán)重性及對健康的影響顯著不同。首先，利什曼原蟲病是一種由許多種利什曼原蟲中的任何一種引起的衰弱癥狀，可經(jīng)許多種沙蚊傳染。利什曼原蟲病很多且對大眾健康的重要性遠超過人們先前的認知。要控制利什曼原蟲的感染非常復(fù)雜，因為許多種類的沙蚊是可能的傳染媒介，而許多動物都可作儲病媒的宿主，所以診斷方法(臨床、血清、寄生蟲診斷)的診斷價值往往無效或只能有限度的接受。
利什曼原蟲病的表現(xiàn)形式可為內(nèi)臟型、粘液皮膚型及/或皮膚型，感染生物體的菌株及宿主的免疫狀態(tài)均可影響寄生蟲疾病的臨床表現(xiàn)形式及結(jié)果。治療利什曼原蟲病須要復(fù)雜及長期的全身的治療。治療的目的是治愈人類或動物病患細胞內(nèi)的寄生蟲感染，預(yù)防舊病復(fù)發(fā)，避開不反應(yīng)性的發(fā)生及使住院及總治療費用降至最小。為達此目的，必須在適當(dāng)?shù)钠陂g投用適當(dāng)劑量含量及頻率的適當(dāng)藥物。雖然努力的尋找有效的及耐受性良好的抗利什曼原蟲的藥劑，僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)藥劑可用于病人。目前有兩種五價的銻化合物可經(jīng)深部肌肉內(nèi)注射投用，通常用作為第一線的藥物；葡萄糖甲胺銻酸鹽(GlucantimTM，F(xiàn)armitalia)及葡萄糖酸銻鈉(PentostamTM，Wellcome)。第二線的藥物是兩性霉素(amphothericin)-B(尤其是微脂粒的調(diào)制劑)、戊脒及別嘌呤醇?，F(xiàn)行的治療效果不佳且會對病人引起毒性副作用。此外，其活性范圍不廣。因此仍須要新穎的藥物。本文確認的新穎的活性成分可用于治療利什曼原蟲屬的原生動物寄生蟲引起的病癥。
出乎意料地，分離自紫金牛杜莖山(Maesa)屬的頂花杜莖山(Maesa balansae)及蘭賽蘭特杜莖山(M.Lanceolata)植物的三萜烯皂角苷類具有強大預(yù)防及治療利什曼原蟲的效用。
本發(fā)明是關(guān)于從紫金?？浦参镏蟹蛛x出三萜烯皂角苷類的方法，其中該方法包含以下的步驟(a)用非極性溶劑從干燥的植物部份中去除非極性物質(zhì)，(b)用醇類萃取所述植物部份，及(c)在醇類萃取物中用液-液萃取、過濾及色層分析法進一步的純化皂角苷類。
特定言之，非極性溶劑為鹵化烴，例如二氯甲烷或氯仿；而醇類則為甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇，各視需要地與水預(yù)混合。特別適用者為甲醇∶水(90∶10)混合物或乙醇∶水(70∶30)混合物以供分離內(nèi)含皂角苷類的級份。
醇類萃取物內(nèi)的皂角苷類可用以下的方法進一步的純化(c1)蒸發(fā)干燥萃取物，(c2)用丁醇及水分配殘余物，(c3)蒸發(fā)干燥有機層，(c4)在酮類中清洗殘余物，以及(c5)過濾粗皂角苷混合物。
于步驟(c2)中，水層以用正丁醇萃取數(shù)次較佳。
本發(fā)明也關(guān)于另一種從紫金?？浦参锓蛛x三萜烯皂角苷類的方法，其中該方法包含以下的步驟(a)用醇類萃取干燥的植物部份以及濃縮萃取物，(b)從萃取物中用非極性溶劑進行液-液萃取法去除非極性級份，及(c)進一步的用液-液萃取、過濾及色層分析法純化醇類萃取物中的皂角苷類。
特定的醇類為甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇，各視需要地與水混合，較佳者為乙醇∶水(70∶30)混合物；非極性溶劑為烴，例如己烷。
醇類萃取物中的皂角苷類可進一步的用以下的方法純化(c6)用以水飽和的丁醇來萃取水溶性級份，(c7)蒸發(fā)干燥有機層，(c8)在酮類中清洗殘余物，以及(c9)過濾粗皂角苷混合物，于步驟(c6)中，水層以用正丁醇萃取數(shù)次較佳。
當(dāng)從杜莖山屬植物中分離皂角苷類時，色層分析法可包含使用以下梯度洗脫液系統(tǒng)的反相液相色層分析法A0.5％乙酸銨水溶液B甲醇C乙腈其中在t＝0時，(A∶B∶C)＝(60∶20∶20)及在t＝結(jié)束時，(A∶B∶C)＝(0∶50∶50)，或使用硅膠的正相液相色層分析法。
此類方法產(chǎn)生的混合物基本上是由皂角苷類組成。實驗部份中描述的許多藥理實驗是用此皂角苷類混合物。為了區(qū)別其構(gòu)造，將此混合物用描述于實驗部份的HPLC方法分離成個別的成分。
因此本發(fā)明也關(guān)于以本文描述的方法得到的一種或多種三萜烯皂角苷類的混合物或分離產(chǎn)物。
特定而言，本發(fā)明是關(guān)于得自杜莖山屬的三萜烯皂角苷類，其是用以下的梯度洗脫液系統(tǒng)的色層分析法包含反相液相色層分析法加以分離A0.5％乙酸銨水溶液B甲醇C乙腈其中在t＝0時，(A∶B∶C)＝(60∶20∶20)及在t結(jié)束時，(A∶B∶C)＝(0∶50∶50)，且其中該皂角苷具有以下的特性化合物1MW＝1532，λmax＝228.6毫微米，λmax2＝273.3毫微米；tR＝8.97化合物2MW＝1510，λmax＝223.9毫微米，λmax2＝274.5毫微米；tR＝9.39化合物3MW＝1532，λmax＝279.2毫微米，λmax2＝223.9毫微米；tR＝9.68化合物4MW＝1510，λmax＝280.4毫微米，λmax2＝222.7毫微米；tR＝10.09化合物5MW＝1574，λmax＝276.8毫微米，λmax2＝225.0毫微米；tR＝10.87；及化合物6MW＝1552，λmax＝279.2毫微米，λmax2＝223.9毫微米；tR＝11.37。
相對保留時間tR為使用Hypersil BDS C-18，3微米，100×4毫米的管柱時與尿嘧啶保留時間的比值，其是為10次測量的平均值。
具體地說，本發(fā)明是關(guān)于三萜烯皂角苷類，其分子式為 其中R2為-O(C＝O)C6H5或-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3，R3為(E)或(Z)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，及R4為氫或-(C＝O)CH3；更明確的說，在化合物1中，R2為-O(C＝O)C6H5，R3為(Z)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4為氫；在化合物2中，R2為-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3、R3為(Z)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4為氫；在化合物3中，R2為-O(C＝O)C6H5，R3為(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4為氫；在化合物4中，R2為-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3、
R3為(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4為氫；在化合物5中，R2為-O(C＝O)C6H5，R3為(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4為-(C＝O)CH3；在化合物6中，R2為-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3、R3為(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4為-(C＝O)CH3；用于本發(fā)明藥物組合物及治療方法中的較佳化合物為本發(fā)明的化合物3及4，尤其是化合物3。
明確的說，本發(fā)明是關(guān)于使用一種或多種三萜烯皂角苷類于制備藥物組合物的用途，該藥物組合物用以治療被利什曼原蟲品系感染的宿主的利什曼原蟲病，其中皂角苷的分子式為(I) 其立體異構(gòu)物形式或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的加成鹽，其中R1為氫、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、經(jīng)苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基、單糖類基團或寡糖類基團；R2為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R3為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4為氫、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、-(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基；R5為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、COOH；或R5及R2形成式-C(＝O)-O-的二價基；R6及R7為氫；或共同形成一條鍵；或R5及R6形成下式的二價基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O-(c)，其中R13為氫，C1-6烷基或-(C＝O)C1-5烷基R8α及R8β是各自獨立為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、CH(OCH3)2、CH＝NOH、COOH；或R8β及R3形成式-C(＝O)-O-的二價基；或R8β及R5形成式-CH2O-CHOH的二價基；R9為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R10為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R11為氫、羥基或O-C(＝O)C1-5烷基；或R10及R11形成二價的式-CH2O-基；及R12為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、CH＝NOH、或COOH。
較佳的式(1)化合物中R1為氫、-(C＝O)C1-5烷基、或寡糖類基團；R3為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4為氫、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基；R5為CH2OH、CH2O-C(＝O)CH3、CHO；及R6及R7共同形成一條鍵；或R5及R6形成下式的二價基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O- (c)，其中R13為氫，C1-6烷基或-(C＝O)C1-5烷基；及
R7為氫；R8a為CH3；R8β為CH3、CH2OH、CHO、CH(OCH3)2、CH＝NOH、COOH；或R8β及R3形成式-C(＝O)-O-的二價基；或R8β及R5形成式-CH2O-CHOH的二價基；R10為CH3、CH2OH；R11為氫、羥基或O-C(＝O)C1-5烷基；或R10及R11形成式-CH2O-的二價基；及R12為CH3、CH2OH、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、或CH＝NOH。
特佳的式(1)化合物中R1為氫或寡糖類基團；R2為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R3為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4為氫、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基；經(jīng)苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基；R5為CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、COOH；及R6及R7共同形成一條鍵；或R5及R6形成下式的二價基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O-(c)，其中R13為氫；及R7為氫；R8a及R8β均為CH3；R9為CH3；R10為CH3；R11為氫；及R12為CH3。
式(I)化合物可用已知技藝的方法相互轉(zhuǎn)換。尤其感興趣的方法是堿性介質(zhì)中的皂化反應(yīng)、酸性介質(zhì)中的酯基轉(zhuǎn)換作用、及寡糖類部分的酶降解以產(chǎn)生糖苷配基，即式(I)化合物中R1為氫。
本發(fā)明也關(guān)于減輕人類及動物由利什曼原蟲屬的原生動物寄生蟲感染引起的利什曼原蟲病的臨床表現(xiàn)形式、及治愈病癥的方法，該方法包含對感染的宿主投用治療量有效的式(I)化合物 其立體異構(gòu)物的形式或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的加成鹽，其中R1為氫、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、經(jīng)苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基、單糖類基團或寡糖類基團；R2為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C1-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R3為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4為氫、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、-(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基；R5為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、COOH；或R5及R2形成式-C(＝O)-O-的二價基；R6及R7為氫；或共同形成一條鍵；或R5及R6形成下式的二價基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O- (c)，其中R13為氫，C1-6烷基或-(C＝O)C1-5烷基
R8α及R8β是各自獨立為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、CH(OCH3)2、CH＝NOH、COOH；R8β及R3形成式-C(＝O)-O-的二價基；R8β及R5形成式-CH2O-CHOH-的二價基；R9為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R10為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R11為氫、羥基或O-C(＝O)C1-5烷基；或R10及R11形成式-CH2O-的二價基；及R12為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、CH＝NOH、或COOH。
為了治療利什曼原蟲病，式(I)化合物可以以內(nèi)含常見的非毒性醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體、輔助劑及載劑的劑量單位配方以口服的、局部、非經(jīng)腸的、吸入噴灑方式或直腸投用。本文中非經(jīng)腸的方式包括對感染利什曼原蟲生物體的患者進行皮下注射、靜脈、肌肉、胸腔內(nèi)注射、動脈注射、或灌流方法。
內(nèi)含活性成分的藥物組合物可為適于口服的形式，例如片劑、糖錠劑、錠劑、水溶性或油狀的溶液或懸浮液、可分散的粉末或顆粒、乳狀液、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑?？诜慕M合物可依據(jù)任何制備生產(chǎn)藥物組合物的已知技藝的方法制備，此組合物可含一種或多種藥劑，其是選自增甜劑、調(diào)味劑、著色劑及保存劑以產(chǎn)生醫(yī)藥學(xué)上精致的及美味的制品。含活性成分的藥片可與非毒性的醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑預(yù)先混合，賦形劑是制造藥片適當(dāng)?shù)那野?但非限于)惰性稀釋劑、造粒及崩解劑、及潤滑劑。片劑可為未涂覆的或用已知的技藝涂覆以延緩胃腸道中的崩解及吸附，因而提供長期的長效作用；蓋住不佳的味料或口感；或改進外觀及辨視性。
含活性物質(zhì)的含水懸浮液可與適于制作懸浮水溶液的賦形劑預(yù)先混合。此賦形劑為懸浮劑、分散或濕化劑。該懸浮水溶液也可含一種或多種防腐劑，油狀的懸浮液可用適當(dāng)?shù)闹参镉突虻V物油(例如液體石蠟)懸浮活性成分調(diào)制妥。油狀的懸浮液可含增稠劑、增甜劑、及調(diào)味劑制作成可口的口服制劑。此類組合物中可添加可接受的抗氧化劑保存。
經(jīng)添加水后適于制備懸浮水溶液的可分散的粉末及顆粒的活性成分可與分散或濕化劑、懸浮劑及一種或多種防腐劑預(yù)先混合。
本發(fā)明藥物組合物也可為水包油(o/w)或油包水(w/o)乳狀液的形式。油相可為內(nèi)含適當(dāng)?shù)娜榛瘎┘翱寡趸瘎┑尼t(yī)藥學(xué)上適當(dāng)?shù)闹参镉汀⒒ㄉ?、或礦物油。水相可含乳化劑、增稠劑及防腐劑。乳狀液也可含增甜劑、著色劑及調(diào)味劑。
糖漿及酏劑可與增甜劑調(diào)制。此調(diào)制劑也可含鎮(zhèn)痛劑、保存劑及風(fēng)味劑及著色劑。
藥物組合物可為滅菌的可注射制劑形式，例如滅菌的可注射水溶性或含油的、非毒性非經(jīng)腸的可接受的稀釋劑或溶劑的溶液或懸浮液。適用的可接受的載劑及溶劑為水、林格氏溶液及等張的氯化鈉溶液。此外，滅菌、固定的油類也常見作為溶劑或懸浮液基質(zhì)。此目的中可使用任何混合的固定的油類，包括合成的單-或二甘油酯、脂肪酸及其他適當(dāng)?shù)淖⑸涮砑觿?。懸浮液可依?jù)已知的技藝使用適當(dāng)?shù)姆稚⒒驖窕瘎┘皯腋┱{(diào)制。
式(I)化合物也可以栓劑或其他調(diào)制劑，例如直腸投藥的溶液或懸浮液的藥物形式投用。制備栓劑時是將藥物與適當(dāng)?shù)姆谴碳ば再x形劑混合，后者在常溫下為固體、但在直腸溫度下則以液體形式釋放藥物。
式(I)化合物的每日劑量在寬范圍內(nèi)變化，例如1.0至2,000毫克。較佳者，藥物組合物中式(I)化合物與載體，是以內(nèi)含5、10、25、50、100、150、250或500毫克的活性成分對待治療病人投用適當(dāng)劑量的次分劑量給藥。有效量的藥物一般含約0.01毫克至約50毫克/公斤體重的劑量。較佳者，介于約0.1毫克至約7毫克/公斤體重的范圍。
但是，應(yīng)該理解，任何特定病人的特定劑量水平需視各種因素而定，包括使用的特定的化合物的活性、年齡、體重、一般的健康狀況、性別、飲食、投藥時間、投藥路徑、分泌速率、藥物組合及器官系統(tǒng)受影響的嚴(yán)重性及治療的需求。
實驗部份從頂花杜莖山分離三萜烯皂角苷類將以空氣干燥的頂花杜莖山的粉末樹葉(3公斤)依序用氯仿萃取去除非極性材料，然后用甲醇∶水(9∶1)萃取。將醇系萃取物在減壓下蒸發(fā)，殘余物用正丁醇(經(jīng)水飽和)及水分配。蒸發(fā)有機層至干燥。殘余物用丙酮清洗及過濾。內(nèi)含皂角苷類不溶于丙酮的部份(10克)用反相BPLC(靜相為RP-18 HS BDS Hyperprep 100，8微米；200克，管柱5公分)使用以下的梯度洗脫液系統(tǒng)純化A0.5％乙酸銨水溶液，B甲醇及C乙腈流速為80毫升/分鐘，235毫微米下以UV-偵測。使用的梯度洗脫液系統(tǒng)為(t＝0分鐘)A∶B∶C(60∶20∶20)至(t＝50分鐘)A∶B∶C(0∶50∶50)得到純皂角苷混合物(5克)，包括六種化合物。
用相同的管柱在相同的條件下使用上述的梯度溶劑系統(tǒng)進行分離六種皂角苷類。依洗脫的次序得到以下的化合物化合物1MW＝1532，λmax＝223.3毫微米；可進一步的純化，使用固定溶劑組成的溶劑系統(tǒng)A∶B∶C(33∶64∶03)；產(chǎn)率230毫克。
化合物2MW＝1510，λmax＝209.2毫微米；梯度洗脫系統(tǒng)(t＝0分鐘)A∶B∶C(42∶29∶29)至(t＝終止時)A∶B∶C(24∶38∶38)；產(chǎn)率110毫克。
化合物3MW＝1532，λmax＝222.1毫微米；固定溶劑組成的溶劑系統(tǒng)A∶B∶C(40∶30∶30)；產(chǎn)率1,000毫克。
化合物4MW＝1510，λmax＝202.2毫微米；固定溶劑組成的溶劑系統(tǒng)A∶B∶C(59∶00∶41)；產(chǎn)率1,000毫克。
化合物5MW＝1574，λmax＝203.4毫微米；及固定溶劑組成的溶劑系統(tǒng)A∶B∶C(32∶34∶34)；產(chǎn)率220毫克。
化合物6MW＝1552，λmax＝216.3毫微米；固定溶劑組成的溶劑系統(tǒng)A∶B∶C(32∶34∶34)，回收(4次)；產(chǎn)率230毫克。
評估抗利什曼原蟲的活性以下實驗例所使用的測試藥物PX內(nèi)含分離自頂花杜莖山的皂角苷類混合物。
1.活體外抗利什曼原蟲的活性活體外生長利什曼原蟲生物體的方法及篩選方法可參見國際文獻。測試方法可有彈性，且依據(jù)特定目的及測試化合物的特性調(diào)整。簡言之，使用以下活體外的方法將源自實驗室嚙齒動物或巨噬細胞系的初級腹膜的巨噬細胞種入多孔組織培養(yǎng)容器內(nèi)，并使其吸附約24小時。添加適當(dāng)感染比例的無鞭毛體利什曼原蟲(取自感染無鞭毛體的供體動物的目標(biāo)組織或感染鞭毛體的培養(yǎng)組織)或前鞭毛體利什曼原蟲及各種稀釋濃度的藥物或測試化合物。測試藥物是溶于可耐活體外測試系統(tǒng)的適當(dāng)溶劑(DMSO水、醇類、及等類似功能的溶劑)并添加在組織培養(yǎng)液中。在37℃下5％CO2中進行培養(yǎng)5-15天。未感染的對照組培養(yǎng)細胞也進行處理以測定選擇性指數(shù)。并包括以參考藥物處理的培養(yǎng)細胞以測定測試藥物的相對藥效。藥品活性是用染色方法測定總寄生蟲荷載的百分比降低或與未處理的對照培養(yǎng)組比較巨噬細胞感染的數(shù)目。用顯微鏡記讀，測定EC50值(50％抑制的有效濃度)。降低的百分比及EC50值可作為活體外抗利什曼原蟲活性的指標(biāo)并可顯著的發(fā)現(xiàn)臨床上有用的藥劑。
表I活體外初級小鼠巨噬細胞抗利什曼原蟲的活性
nd未測定2.活體中抗利什曼原蟲的活性活體中維持利什曼原蟲生物體的方法及動物模式載于國際文獻。Balb-C小鼠及黃金倉鼠為經(jīng)初步分離、維持及使用人造感染模式的較佳實驗室動物。測試方法可有彈性且可依據(jù)特定目的及測試化合物的特性調(diào)整。簡言之，使用以下的活體中方法內(nèi)臟型的利什曼原蟲品系將Balb-C小鼠或年輕的倉鼠用源自感染供體動物的目標(biāo)器官(一般而言為脾臟)或活體外培養(yǎng)的寄生蟲形式的無鞭毛體(約106至107)經(jīng)靜脈感染。動物用不同劑量含量(劑量范圍0.1至80毫克/公斤的100％DMSO或任何其他可接受的載劑)的測試化合物治療，使用不同投藥路徑及治療流程。在感染后不同時間(治療地)內(nèi)、并發(fā)感染(預(yù)防性地)或感染前(殘存的活性)即開始進行治療。在預(yù)防性的研究設(shè)計中，測試藥物在人為感染利什曼原蟲前或在感染的同時進行第一次投藥。治療的研究設(shè)計中，人為感染利什曼原蟲后數(shù)周進行首次投用測試藥物(早期治療＝首次出現(xiàn)臨床癥候時；晚期的治療＝臨床癥狀完全呈現(xiàn)或轉(zhuǎn)變成慢性時)。藥品活性的評估是測定肝或任何其他相關(guān)的目標(biāo)組織/器官中總寄生蟲含量，并與未經(jīng)治療的對照組動物中組織/器官的含量比較。無鞭毛體的平均數(shù)目是用印染的抹片或載玻片以定量或以半定量的方式計算。降低的百分比即可作為抗利什曼原蟲活性的指標(biāo)并據(jù)以顯著的發(fā)掘具有臨床用途的藥劑。最低的活性劑量(LAD)的定義為在初級目標(biāo)器官/組織中降低寄生蟲含量至少80％的最低劑量。表II活體中小鼠及倉鼠抗內(nèi)臟型利什曼原蟲的抗利什曼原蟲活性
表III活體外及活體中抗內(nèi)臟型幼兒利什曼原蟲的活性
皮膚型及粘膜皮膚型利什曼原蟲品系Balb-C小鼠或年輕的倉鼠經(jīng)真皮內(nèi)或皮下的用源自感染供體動物的目標(biāo)器官(一般而言為損害的皮膚)或活體外培養(yǎng)的寄生蟲形式的無鞭毛體(約106至107)感染。動物用不同劑量含量(毫克/公斤的100％DMSO或任何其他可接受的載劑)的測試化合物治療，使用不同的投藥路徑及治療流程。在感染前(預(yù)防性地)，感染后不同的時間(治療地)即開始進行治療。預(yù)防性的研究設(shè)計中，測試藥物在人為感染利什曼原蟲前或在感染的同時進行第一次投藥。治療的研究設(shè)計中，人為感染利什曼原蟲后數(shù)周進行首次投用測試藥物(早期治療＝當(dāng)首次出現(xiàn)皮膚損傷時；晚期的治療＝當(dāng)皮膚損傷完全呈現(xiàn)或轉(zhuǎn)變成慢性時)。藥品活性的評估是測定相關(guān)的目標(biāo)組織/器官中損害的嚴(yán)重性(第一參數(shù))或相關(guān)的目標(biāo)組織/器官中的寄生蟲含量(第二參數(shù))，并與未治療的對照組動物比較。損害大小是使用J.El-On.及A.D.Hamburger[Trans.Roy.Soc.Trop.Med.Hyg.，81，734-737(1987)]的方法定量的評估。降低的百分比即可作為抗利什曼原蟲活性的指標(biāo)并據(jù)以顯著的發(fā)掘具有臨床用途的藥劑。最低的活性劑量(LAD)的定義為在初級目標(biāo)器官/組織中預(yù)防損害的發(fā)展，停止損害進一步的演化或?qū)p害引發(fā)臨床治療的最低劑量。
表IV活體中小鼠及倉鼠抗皮膚型及粘膜皮膚型利什曼原蟲品系的抗利什曼原蟲的活性A.預(yù)防性的治療預(yù)防性研究的設(shè)計是在進行人為的利什曼原蟲感染之前立即第一次投用測試藥物
*使用的公式為〔垂直的直徑×水平的直徑〕/2(毫米2)
*使用的公式為〔垂直的直徑×水平的直徑〕/2(毫米2)
*使用的公式為〔垂直的直徑×水平的直徑〕/2(毫米2)B.治病性的治療在治病的研究設(shè)計中，人為感染利什曼原蟲品系后數(shù)周(一般而言為首次出現(xiàn)臨床癥候時)進行首次投用測試藥物。
*使用的公式為〔垂直的直徑×水平的直徑〕/2(毫米2)**治療起始
*使用的公式為〔垂直的直徑×水平的直徑〕/2(毫米2)**治療起始
*使用的公式為〔垂直的直徑×水平的直徑〕/2(毫米2)**治療起始表V活體中PX混合物抗不同的利什曼原蟲品系的抗利什曼原蟲活性
*內(nèi)臟型以肝臟中無鞭毛體含量及皮膚型以損害大小為基準(zhǔn)計
權(quán)利要求
1.一種從紫金牛(Myrsinaceae)科植物中分離三萜烯皂角苷類的方法，其中該方法包含以下的步驟(a)用酒精萃取干燥的植物部分及濃縮萃取物，(b)從萃取物中用非極性溶劑以液-液萃取法去除非極性級份，及(c)進一步的從醇類萃取物中用液-液萃取法、過濾及色層分析法純化皂角苷類。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中的醇類為甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇，各視需要地與水混合。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中醇類萃取物的皂角苷類用以下的方法進一步的純化(c6)用水飽和的丁醇萃取水溶性級份，(c7)蒸發(fā)有機層至干，(c8)于酮類中清洗殘余物，及(c9)過濾粗皂角苷混合物。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中皂角苷類是分離自頂花杜莖山(Maesa balansae)品種的植物，色層分析法包含硅膠的正相液態(tài)色層分析法或使用以下梯度洗脫液系統(tǒng)的反相液態(tài)色層分析法A0.5％乙酸銨水溶液B甲醇C乙腈其中t＝0時，(A∶B∶C)＝(60∶20∶20)以及當(dāng)及t＝結(jié)束時，(A∶B∶C)＝(0∶50∶50)。
5.三萜烯皂角苷，它可通過權(quán)利要求1至4中任一項的方法得到。
6.如權(quán)利要求5的三萜烯皂角苷，其中該皂角苷是分離自頂花杜莖山品系的植物，色層分析法包含使用以下梯度洗脫液系統(tǒng)的反相液態(tài)色層分析法A0.5％乙酸銨水溶液B甲醇C乙腈其中t＝0時，(A∶B∶C)＝(60∶20∶20)及t＝結(jié)束時，(A∶B∶C)＝(0∶50∶50)，其中該皂角苷有以下的特性化合物1MW＝1532，λmax＝228.6毫微米，λmax2＝273.3毫微米；化合物2MW＝1510，λmax＝223.9毫微米，λmax2＝274.5毫微米；化合物3MW＝1532，λmax＝279.2毫微米，λmax2＝223.9毫微米；化合物4MW＝1510，λmax＝280.4毫微米，λmax2＝222.7毫微米；化合物5MW＝1574，λmax＝276.8毫微米，λmax2＝225.0毫微米；或化合物6MW＝1552，λmax＝279.2毫微米，λmax2＝223.9毫微米。
7.一種下式的三萜烯皂角苷 其中R2為-O(C＝O)C6H5或-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3，R3為(E)或(Z)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，及R4為氫或-(C＝O)CH3。
8.如權(quán)利要求7的化合物，其中在化合物1中，R2為-O(C＝O)C6H5，R3為(Z)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4為氫；在化合物2中，R2為-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3、R3為(Z)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4為氫；在化合物3中，R2為-O(C＝O)C6H5R3為(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4為氫；在化合物4中，R2為-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3、R3為(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4為氫；在化合物5中，R2為-O(C＝O)C6H5，R3為(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4為-(C＝O)C3；在化合物6中，R2為-O(C＝O)C(CH3)＝CHCH3、R3為(E)-O(C＝O)CH＝CH-C6H5，R4為-(C＝O)CH3。
9.一種藥物組合物，其內(nèi)含醫(yī)藥學(xué)上可接受的賦形劑及如權(quán)利要求5、6、7或8項中所定義的三萜烯皂角苷作為活性成分。
10.如權(quán)利要求7的組合物，其是調(diào)制成供非經(jīng)腸投藥之用。
11.一種或多種三萜烯皂角苷類用于制備藥物組合物的用途，該藥物組合物是用于治療宿主感染利什曼原蟲屬(Leishmania)的利什曼原蟲病，其中皂角苷為下式 及其立體異構(gòu)物的形式或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的加成鹽，其中R1為氫、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、經(jīng)苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基、單糖類基團或寡糖類基團；R2為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R3為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4為氫、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、-(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基；R5為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、COOH；或R5及R2形成式-C(＝O)-O-的二價基；R6及R7為氫；或共同形成一條鍵；或R5及R6形成下式的二價基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O-(c)，其中R13為氫，C1-6烷基或-(C＝O)C1-5烷基；R8α及R8β是各自獨立為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、CH(OCH3)2、CH＝NOH、COOH；R8β及R3形成式-C(＝O)-O的二價基；R8β及R5形成式-CH2O-CHOH-的二價基；R9為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R10為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R11為氫、羥基或O-C(＝O)C1-5烷基；或R10及R11形成式-CH2O-的二價基；及R12為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、CH＝NOH、或COOH。
12.如權(quán)利要求11的用途，其中R1為氫、-(C＝O)C1-5烷基、或寡糖類基團；R3為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4為氫、C1-5烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基；R5為CH2OH、CH2O-C(＝O)CH3、CHO；及R6及R7共同形成一條鍵；或R5及R6形成下式的二價基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O- (c)，其中R13為氫，C1-6烷基或-(C＝O)C1-5烷基；及R7為氫；R8β為CH3、CH2OH、CHO、CH(OCH3)2、CH＝NOH、COOH；R8a為CH3；R8β及R3形成式-C(＝O)-O-的二價基；或R8β及R5形成式-CH2O-CHOH的二價基；R10為CH3、CH2OH；R11為氫、羥基或O-C(＝O)C1-5烷基；或R10及R11形成式-CH2O-的二價基；及R12為CH3、CH2OH、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、或CH＝NOH。
13.如權(quán)利要求12的用途，其中R1為氫或寡糖類基團；R2為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R3為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4為氫、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基；經(jīng)苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基；R5為CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、COOH；及R6及R7共同形成一條鍵；或R5及R6形成下式的二價基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O-(c)，其中R13為氫；及R7為氫；R8a及R8β均為CH3；R9為CH3；R10為CH3；R11為氫；及R12為CH3。
14.一種減輕人類及動物由利什曼原蟲屬的原生動物寄生蟲感染引起的利什曼原蟲病的臨床表現(xiàn)形式、及治愈病癥的方法，該方法包含對感染的宿主投用治療有效量的以下式的化合物 其立體異構(gòu)物的形式或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的加成鹽，其中R1為氫、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、經(jīng)苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基、單糖類基團或寡糖類基團；R2為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R3為氫、羥基、-O(C＝O)C1-5烷基、-O(C＝O)C2-5烯基、-O(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-O(C＝O)C2-5烯基；R4為氫、C1-6烷基、-(C＝O)C1-5烷基、-(C＝O)C2-5烯基、-(C＝O)C6H5、或經(jīng)苯基取代的-(C＝O)C2-5烯基；R5為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、COOH；或R5及R2形成式-C(＝O)-O-的二價基；R6及R7為氫；或共同形成一條鍵；或R5及R6形成下式的二價基-CH2-O- (a)，-CH(OR13)-O-(b)，-C(＝O)-O- (c)，其中R13為氫，C1-6烷基或-(C＝O)C1-5烷基R8α及R8β是各自獨立為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、CH(OCH3)2、CH＝NOH、COOH；R8β及R3形成式-C(＝O)-O-的二價基；R8β及R5形成式-CH2O-CHOH-的二價基；R9為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R10為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)C1-5烷基、CHO、COOH；R11為氫、羥基或O-C(＝O)C1-5烷基；或R10及R11形成式-CH2O-的二價基；及R12為CH3、CH2OH、CH2OCH3、CH2O-C(＝O)CH3、CHO、CH＝NOH、或COOH。
全文摘要
自紫金牛科的植物中可分離出下式(Ⅰ)的皂角苷類、其立體異構(gòu)物形式或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的加成鹽,其中R
文檔編號A61K31/7028GK1331601SQ99814876
公開日2002年1月16日 申請日期1999年12月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者L·J·R·M·梅斯, N·A·G·格蒙普雷茨, L·E·M·范普伊維爾德, M·范特里, T·恩戈克尼恩, N·G·M·德金佩 申請人:詹森藥業(yè)有限公司