專利名稱：一種氨基化高分子微球制備技術及其應用的制作方法
技術領域：
高分子材料生物診斷技術技術背景高分子微球已廣泛應用于生物醫(yī)學的各個領域，既可作為分離材料用于蛋白質、核酸和細胞等生物物質的分離，也可作為抗原、抗體和酶等物質的固化支持材料應用于采用顆粒增強免疫比濁法對各種物質，特別是蛋白質、多肽和抗體的定量檢測。高分子微球的性能取決于它的粒徑大小、均勻度，以及表面化學基團的性質和數(shù)量。粒徑的大小與免疫定量檢測的靈敏度有關。粒徑越小，靈敏度越高。免疫定量檢測的粒徑一般要求在0.1-0.2μm。微球的均勻度與免疫定量檢測的穩(wěn)定性和精密度(CV值)有關。均勻度越好，穩(wěn)定性和精密度就越高。當粒徑小到一定程度以后，就只有通過改變微球表面的化學基團的性質和數(shù)量來進一步提高免疫定量檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。高分子微球的表面一般接入羧基、醛基和氨基等幾種化學基團。氨基化微球因其便于與抗體等蛋白質交聯(lián)，并且交聯(lián)的穩(wěn)定性較好而被廣泛采用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利涉及一種氨基化高分子微球的制備技術及其在免疫比濁定量檢測中的應用。氨基化高分子微球的制備方案是先在合成聚苯乙烯(polystyrene，PS)種子微粒，種子微粒再與氨基化單體進行化學反應，在PS種子微粒的表面接上氨基基團。合成的氨基化高分子微球在雙功能分子——戊二醛的作用下與抗體等帶有氨基的分子交聯(lián)，形成穩(wěn)定的交聯(lián)產(chǎn)物，可用于抗原、抗體和其他蛋白的免疫定量檢測。與其他微球的合成方法相比，本發(fā)明技術合成氨基化高分子微球簡化了微球的制備步驟，省卻了合成聚苯乙烯微球的中間過程，直接在種子微粒的表面連接氨基基團，合成的粒徑更小，單位質量的微球表面積增大，氨基基團更豐富，而且原材料的消耗也大為減少。因此，進一步提高了免疫比濁定量檢測靈敏度，降低了生產(chǎn)成本。
具體實施例方式本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達到(1)材料與試劑單體苯乙烯(Styrene，St)、氨基官能團單體(Aminoethylmethacrylatehydrochloride，AEMH)、乳化劑(Hexadecyltrimethylammonium bromide，HDTAB)、引發(fā)劑(2，2’-azobisisobutyramidine dihydrochloride，AIBA或2，2’-azobisdimethylenisobutyramidine dihydrochloride，ADIBA)、終止劑(對苯二酚Hydroquinone)。
(2)氨基化聚苯乙烯微球的制備配方見下表表1聚苯乙烯種子微粒(PS Seed)的合成

表2氨基化聚苯乙烯微球的合成

(3)操作步驟A按表1配方在氮氣保護下制備聚苯乙烯種子微粒乳液。反應溫度為70℃，攪拌速率為250rpm，反應時間為12h；B取出75g種子微粒乳液加入150g水，氮氣保護下，以0.98g/min的速率加入苯乙烯單體，在室溫下以200rpm的速率攪拌1h；C升溫至70℃。待溫度恒定后，以2.08g/min的速率加入引發(fā)劑ADIBA(溶液形式2.0g溶于800g二次蒸餾去離子水中)，反應時間為4h；D取出400g聚苯乙烯種子微粒，加入500g水、乳化劑HDTAB 0.337g、苯乙烯20g和氨基化單體AEMH 0.2g，轉速200rpm下攪拌1h。溫度恒定70℃后，加入引發(fā)劑0.1g。反應時間為4h；E最后加入20ml對苯二酚結束反應。
F合成的氨基化高分子微球可用超速離心方法或超濾方法濃縮和純化。采用離心方法濃縮和純化的操作步驟是將微球懸液移入離心管中，50000-100000×g 4℃離心10-20分鐘，傾去上清液。加0.1mM甘氨酸緩沖液(PH值7.4)洗滌兩次，離心去上清，最后加0.1mM甘氨酸緩沖液重懸，調整至濃度為10％，于4-8℃保存。采用超濾方法進行濃縮和純化的操作步驟是選用濾膜孔徑為100KD的濾膜包或帶有濾膜的離心管，蠕動泵加壓過濾或1000-15000×g 4℃離心10-20分鐘，0.1mM甘氨酸緩沖液(PH值7.4)洗滌兩次，去上清，最后加0.1mM甘氨酸緩沖液重懸，調整至濃度為10％，于4-8℃保存。
G制備的氨基化高分子微球可在戊二醛(一般作用濃度為0.125％)作用下，與抗體或抗原等各種蛋白質進行交聯(lián)，即可獲得交聯(lián)有蛋白的微球，可作為檢測試劑采用免疫比濁法對目的蛋白進行定量檢測。
H氨基化高分子微球免疫比濁檢測試劑可應用于臨床上對各種體液蛋白和生物醫(yī)學研究中對各種目的蛋白進行定量檢測。檢測的操作步驟如下將交聯(lián)有抗體等蛋白的微球加入到180μl反應液(PH7.4磷酸緩沖液，含6％聚乙二醇(PEG6000))至終濃度為0.05-0.1％，加入待測標本液20μl，37℃孵育10分鐘，于全自動生化分析儀(或半自動生化分析儀、紫外分光光度計)340nm波長出測定緩沖液的吸光度值(OD值)。以梯度稀釋的標準蛋白所測得的OD值繪制標準曲線，可推算出待測標本目的蛋白的含量。
本技術直接在聚苯乙烯種子微粒的表面連接氨基基團來制備氨基化微球。與以往的微球合成技術相比，省去了合成聚苯乙烯微球的中間環(huán)節(jié)，因而制備的氨基化微球一般較小，粒徑在0.1-0.2μm之間，微球的均質性較好，非常適合采用免疫透射比濁法對各種體液蛋白和體外蛋白進行定量檢測。
采用本技術制備的氨基化聚苯乙烯微球也可作為親和純化的介質應用于抗原、抗體和其他蛋白的分離和純化，以及體外對各種生物活性分子進行定位標記。
權利要求
1.一種氨基化高分子微球的制備技術及其在蛋白質定量檢測中的應用，其特征是以苯乙烯作為種子微粒合成的材料，以氨基官能團單體(Aminoethylmethacrylate hydrochloride，AEMH)作為氨基基團的供體，采用聚苯乙烯種子微粒表面直接連接氨基基團的方法合成氨基化高分子微球。
2.氨基化高分子微球與抗原、抗體等蛋白質交聯(lián)后，作為免疫比濁法檢測試劑應用于臨床上對各種體液蛋白和生物醫(yī)學研究中對各種標本中的蛋白進行定量檢測。
3.合成的氨基化高分子微球在雙功能交聯(lián)劑(如戊二醛等化學物質)作用下與抗原、抗體等各種蛋白多肽分子交聯(lián)。
4.交聯(lián)有抗體等蛋白分子的氨基化高分子微球也可作為純化介質應用于蛋白質的分離純化，作為標記試劑應用于生物分子的定位標記。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種氨基化高分子微球的制備技術及其在免疫比濁定量檢測中的應用的方法。實施方式是先合成聚苯乙烯(PS)種子微粒，種子微粒再與氨基化單體進行化學反應，在PS種子微粒的表面接上氨基基團形成氨基化高分子微球。本方法合成的氨基化高分子微球在戊二醛等交聯(lián)劑的作用下能與抗體等蛋白質交聯(lián)，形成穩(wěn)定的交聯(lián)產(chǎn)物，可作為免疫比濁檢測試劑應用于抗原、抗體和其他蛋白的定量檢測，也可作為親和純化介質應用于蛋白質、核酸等生物分子的分離純化和定位標記。
文檔編號C07K1/00GK1923864SQ20051009678
公開日2007年3月7日 申請日期2005年9月3日 優(yōu)先權日2005年9月3日
發(fā)明者王虹 申請人:廣東虹業(yè)抗體科技有限公司