專利名稱：固相多肽合成特利加壓素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特利加壓素的制備方法，具體涉及固相多肽合成特利加壓素的制備方法。
背景技術(shù)：
特利加壓素，英文名為Terlipressin，結(jié)構(gòu)式 分子式為C52H74N16O15S2，分子量為1227.4。特利加壓素臨床用于治療嚴(yán)重急性食管靜脈曲張破裂出血，嚴(yán)重急性胃、十二指腸潰瘍出血，急性糜爛性胃炎或出血性胃炎，胰、膽和腸屢的輔助治療以及糖尿病酮癥酸中毒的輔助治療。
目前，特利加壓素為人工合成的三甘氨酸-賴氨酸-加壓素，是合成的血管加壓素類似物，本身無活性，在體內(nèi)經(jīng)氨基肽酶作用，脫去其N末端的3個(gè)甘氨酰殘基后，緩慢地轉(zhuǎn)化為有活性的賴氨酸加壓素，用于治療肝硬化門脈高壓引起的急性食道靜脈曲張出血，是一種安全有效的治療急性靜脈曲張出血的藥物。
特利加壓素最早由Ferring公司開發(fā)，于1977年首先在荷蘭作為止血藥上市，商品名為Glypressin。之后又以商品名Glypressine在法國、德國、英國上市，用于治療消化道靜脈曲張出血，劑型皆為凍干粉針劑，規(guī)格為1mg/支。我國于1999年進(jìn)口Ferring公司的該品種，有兩種劑型，凍干粉針劑和注射液。目前的特利加壓素的制備方法均為液相合成法，如捷克斯洛伐克專利(CZP281589)公開的方法，采用固相合成方法中的Boc路線，以Boc-Gly-氯甲基樹脂(DVB1％，0.9mmol/g)為起始原料，依次接上Boc-Lys(Tos)、Boc-Pro、Boc-Cys(Bzl)、Boc-Asn、Boc-Gln、Boc-Phe、Boc-Tyr(Z)、Boc-Cys(Bzl)、Boc-Gly、Boc-Gly、Z-Gly，再經(jīng)氨解、鈉氨、氧化等反應(yīng)制得特利加壓素，接肽收率僅為75％。由于該工藝三廢較嚴(yán)重，收率也較低，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，不具備規(guī)模生產(chǎn)能力，工藝復(fù)雜，成本高，環(huán)境污染嚴(yán)重，質(zhì)量較差，不能滿足臨床的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種固相多肽合成特利加壓素的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的方法包括如下步驟以Rink Amide樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈采用Boc-Gly-OH；然后加入切肽試劑進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀，獲得還原型粗品；加入堿性物質(zhì)，在pH為7.5-10.0的條件下通空氣氧化，獲得氧化型粗品；最后采用C18柱進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
按照本發(fā)明優(yōu)選的方案以Rink Amide樹脂，包括Rink Amide MBHA樹脂或Rink AmideAM樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈采用Boc-Gly-OH的方法包括如下步驟(1)Rink Amide樹脂的預(yù)處理將Rink Amide樹脂(0.93mmol/g)用DMF浸泡，使樹脂充分溶脹，氮?dú)獯蹈?，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯等チ鶜溥拎ぃ謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(A)；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為10～50％；六氫吡啶的DMF溶液中，Rink Amide樹脂的重量濃度為5～20％；(2)Fmoc-Gly-樹脂的制備將步驟(1)的(A)加入Fmoc-Gly-OH(MW297.3)、TBTU或HBTU(MW321)、HOBT(MW153.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF，20～30℃接肽反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，(A)的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Gly-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹脂的4～12倍；(3)Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(2)的Fmoc-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑?
加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MW468.5)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，步驟(2)的Fmoc-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(4)Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Por-OH(MW337.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Por-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(5)Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(4)的Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑猾@得Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(4)的Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(6)Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(5)的Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW596.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(5)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(7)Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(6)的Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞?br> 加入Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW610.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(6)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(8)Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(7)的Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞?br> 加入Fmoc-Phe-OH(FW387.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(7)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Phe-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(9)Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(8)的Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞?br> 加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(MW403.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑猾@得Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(8)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(10)Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(9)的Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞?br> 加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(FW585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(9)的樹脂重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(11)Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(10)的Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞?br> 加入Fmoc-Gly-OH(FW297.3)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(10)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Gly-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(12)Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(11)的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞?br> 加入Fmoc-Gly-OH(FW297.3)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，20～30℃接肽反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑猾@得Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(11)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Gly-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～20ml/g；(13)Boc-Gly-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備在步驟(12)獲得的樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞?br> 加入Boc-Gly-OH(FW175.2)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，將混合物20～30℃接肽反應(yīng)0.5～1.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，再用甲醇洗滌，干燥，得保護(hù)12肽樹脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(12)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，Boc-Gly-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹脂的4～12倍；按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，加入切肽試劑進(jìn)行切肽包括如下步驟將上述保護(hù)的12肽樹脂加入切肽試劑(TFA/TIS/EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml)，20～35℃反應(yīng)1.5～2.5小時(shí)，過濾，濾液加乙醚沉淀，獲得還原型粗品；保護(hù)的12肽樹脂在切肽試劑中的重量體積比為5～20ml/g；
按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，還原型粗品氧化(二硫鍵的形成)的方法包括如下步驟將還原型粗品溶于水中，在攪拌下緩慢加入0.5～1.5mol/L的氨水，調(diào)節(jié)pH至7.5-10.0，過濾，收集濾液；按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，純化包括如下步驟濾液經(jīng)C18柱純化，流動(dòng)相0.1MNH4Ac∶乙腈(9∶1)；流速為100-650ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；用HPLC跟蹤收集所需要的流出液，然后采用常規(guī)的方法凍干，獲得目標(biāo)產(chǎn)物?？偸章始s為21％。
由上述公開的技術(shù)方案可見，本發(fā)明的方法，采用Rink Amide樹脂(包括Rink AmideMBHA樹脂、Rink AmideAM樹脂)為起始原料，步接肽收率≥99％，最后一個(gè)肽鏈采用Boc-Gly-OH，簡(jiǎn)化了工藝，降低了生產(chǎn)成本，采用切肽試劑(TFA/EDT/H2O/TIS)進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用劇毒的氟化氫，三廢污染少，切肽收率高達(dá)92％，采用弱堿性氧化(pH7.5-10.0)的方法，氧化收率高，反應(yīng)時(shí)間短，采用C18(或C8)柱進(jìn)行分離純化，避免使用三氟乙酸，減少三廢，純化收率高達(dá)25％，每步接肽收率均在99％以上；切肽后收率為92％，分離純化收率為25％，總收率約為21％。由此可見，本發(fā)明的方法生產(chǎn)成本低，工藝簡(jiǎn)單，收率高，便于工業(yè)化實(shí)施。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例和前述過程中所采用的原料列表如下

<p>表9

加108.9g(585.7，186mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈桑珼MF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加111.0g(596.7，186mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加113.6g(610.7，186mmol)Fmoc-Gln(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加72.1g(FW387.4，186mmol)Fmoc-Phe-OH，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈桑珼MF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加75.0g(403.4，186mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、無水甲醇DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加108.9g(FW585.7，186mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、無水甲醇DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加55.3g(FW297.3，186mmol)Fmoc-Gly-OH，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、無水甲醇DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加55.3g(FW297.3，186mmol)Fmoc-Gly-OH，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Boc-Gly-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、無水甲醇DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加32.6g(FW175.2，186mmol)Boc-Gly-OH，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 再用無水甲醇洗滌三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，稱重，得保護(hù)12肽樹脂。
切肽保護(hù)的12肽樹脂轉(zhuǎn)移到切肽瓶中，冷卻下，邊攪拌邊加入切肽試劑(TFA/TIS/EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml)，25℃攪拌2小時(shí)。過濾，抽干，濾液加無水乙醚沉淀。
氧化(二硫鍵的形成)將還原型特利加壓素粗品溶于純化水中，在攪拌下緩慢加入1mol/L氨水，調(diào)節(jié)PH至7.5-10.0，攪拌過夜(HPLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程)，過濾。
純化濾液經(jīng)C18柱(10×30cm)純化，流動(dòng)相0.1MNH4Ac∶乙腈(9∶1)；流速為300ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；用HPLC跟蹤收集所需要的流出液，然后凍干，獲得目標(biāo)產(chǎn)物，總收率約為21％。
權(quán)利要求
1.一種固相多肽合成特利加壓素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟以Rink Amide樹脂，包括Rink Amide MBHA樹脂或Rink AmideAM樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈采用Boc-Gly-OH；然后加入切肽試劑進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀，獲得還原型粗品；加入堿性物質(zhì)，在pH為7.5-10.0的條件下通空氣氧化，獲得氧化型粗品；最后采用C18或C8柱進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以Rink Amide樹脂，包括Rink AmideMBHA樹脂或Rink AmideAM樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈采用Boc-Gly-OH的方法包括如下步驟(1)Rink Amide樹脂，包括Rink Amide MBHA樹脂或Rink AmideAM樹脂的預(yù)處理將Rink Amide樹脂用DMF浸泡，使樹脂充分溶脹，氮?dú)獯蹈?，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯等チ鶜溥拎?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，Rink Amide樹脂的重量濃度為5～15ml/g；(2)Fmoc-Gly-樹脂的制備將步驟(1)的預(yù)處理的樹脂加入Fmoc-Gly-OH(MW297.3)、TBTU或HBTU(MW321)、HOBT(MW153.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF，反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(1)的預(yù)處理的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Gly-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，步驟(1)的預(yù)處理的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(3)Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(2)的Fmoc-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MW468.5)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH的重量體積濃度為5～15ml/g；六氫吡啶的DMF溶液中，步驟(2)的Fmoc-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(4)Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Por-OH(MW337.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Por-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(5)Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(4)的Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(4)的Fmoc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(6)Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(5)的Fmoc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW596.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；然后獲得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(5)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(7)Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(6)的Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液。脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加入Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW610.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(6)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(8)Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(7)的Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤隖moc-Phe-OH(FW387.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(7)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Phe-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(9)Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(8)的Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(MW403.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF。接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(8)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(10)Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(9)的Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(FW585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(9)的樹脂重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(11)Fmoc-Gly-Cys(Trt)-TytBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(10)的Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Gly-OH(FW297.3)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(10)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Gly-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(12)Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備將步驟(11)的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂加入六氫吡啶的DMF溶液.脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Gly-OH(FW297.3)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂；NMM和DMF中，步驟(11)的樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Gly-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(13)Boc-Gly-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Lys(Boc)-Gly-樹脂的制備在步驟(12)獲得的樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液.脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Boc-Gly-OH(FW175.2)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，將混合物接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑儆眉状枷礈?，干燥，得保護(hù)的12肽樹脂；NMM和DMF中，步驟(12)的樹脂的重量體積濃度為5～20ml/g，Boc-Gly-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，接肽反應(yīng)溫度為15～40℃，時(shí)間為0.5～3小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，脫帽反應(yīng)溫度為15～35℃，時(shí)間為10～60分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，NMM和DMF中，TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍；，HOBT的摩爾數(shù)為樹脂的2～6倍，NMM的摩爾數(shù)為樹脂的4～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為10～50％。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，加入切肽試劑進(jìn)行切肽包括如下步驟將上述保護(hù)的12肽樹脂加入切肽試劑(TFA/TIS/EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml)，15～35℃反應(yīng)1.5～2.5小時(shí)，過濾，濾液加乙醚沉淀，獲得還原型粗品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，保護(hù)的12肽樹脂在切肽試劑中的重量體積比為5～20ml/g。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還原型粗品氧化的方法包括如下步驟將還原型粗品溶于水中，在攪拌下加入0.5～1.5mol/L的氨水，調(diào)節(jié)pH至7.5-10.0，過濾，收集濾液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，純化包括如下步驟將權(quán)利要求9獲得的濾液經(jīng)C18或C8柱純化，流動(dòng)相0.1MNH4Ac∶乙腈(9∶1)；流速為100-650ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；用HPLC跟蹤收集所需要的流出液，然后采用常規(guī)的方法凍干，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固相多肽合成特利加壓素的制備方法，包括如下步驟以RinkAmide樹脂(包括Rink Amide MBHA樹脂、Rink AmideAM樹脂)為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈采用Boc－Gly－OH；然后加入切肽試劑進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀，獲得還原型粗品，加入堿性物質(zhì)，在pH為7.5－10.0的條件下通空氣氧化，獲得氧化型粗品，最后采用C18(或C8)柱進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明的方法，生產(chǎn)成本低，工藝簡(jiǎn)單，環(huán)境污染低，收率高，便于工業(yè)化實(shí)施。
文檔編號(hào)C07K1/04GK1865282SQ20051002592
公開日2006年11月22日 申請(qǐng)日期2005年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月18日
發(fā)明者周達(dá)明 申請(qǐng)人:周達(dá)明