專利名稱：：抗體的穩(wěn)定化方法和被穩(wěn)定的溶液狀抗體制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及溶液中抗體的穩(wěn)定化方法和被穩(wěn)定的溶液狀抗體制劑。
背景技術(shù)：
：隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，使用抗體進(jìn)行疾病治療近年來(lái)急速普及。在日本國(guó)也能在醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)提供例如シナヅス、レミケ-ド、リツキサン、ハ-セプチン等各種抗體制劑。當(dāng)將抗體在溶液中長(zhǎng)時(shí)間保存時(shí)，會(huì)發(fā)生化學(xué)分解物的生成、不溶性凝集物的生成、可溶性締合物的生成等。因此為了提供穩(wěn)定而且安全的抗體醫(yī)藥，需要用于抑制這些生成物的方法。當(dāng)以溶液狀態(tài)長(zhǎng)時(shí)間保存抗體時(shí)，會(huì)發(fā)生抗體的二硫鍵或肽鍵的開(kāi)裂等化學(xué)上的分解反應(yīng)。結(jié)果人們擔(dān)心由于品質(zhì)的劣化，引起其活性下降，出現(xiàn)沒(méi)有預(yù)期到的副作用等。蛋白質(zhì)通過(guò)振動(dòng)或熱應(yīng)力等，高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞的分子進(jìn)行凝集，變成不可溶。當(dāng)這些不溶性凝集物注入到靜脈內(nèi)時(shí)，容易引起過(guò)敏性休克嚴(yán)重的副作用(特表平10-502938號(hào)公報(bào))。作為抑制不溶性凝集物生成的方法，已知為了抑制重組人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(recombinanthumankeratinocytegrowthfactor)水溶液由于熱激引起不溶性凝集物的生成，可以向抗體溶液中添加100mmol/L或更高的檸檬酸或0.5％的肝素[JournalofPharmaceuticalScience，vol.83，No.12，1657-1661(1994)]。而作為抑制抗體水溶液由于熱激引起不溶性凝集物生成的方法，已知有使用甘氨酸或組氨酸緩沖液(WO02/13860公報(bào))、添加2％或更高的聚乙烯吡咯烷酮[PharmaceuticalResearch，vol.11，No.5，624-632(1994)]、添加磷酸緩沖液和氯化鈉以及麥芽糖(特表平3-504499號(hào)公報(bào))等方法。另外，已知由于蛋白質(zhì)不同雖然沒(méi)有達(dá)到不溶化，但可形成由2聚體、3聚體等少數(shù)蛋白質(zhì)分子構(gòu)成的可溶性締合物。例如，蛋白質(zhì)為抗體時(shí)，容易形成可溶性的2聚體[Biochemistry，vol.38，13960-13967(1999)]。而如果將抗體的2聚體投入到人體內(nèi)，有引起熱、惡心、低血壓等副作用的危險(xiǎn)性(特表平10-502938號(hào)公報(bào))。作為已知可溶性締合物生成的方法，已知有使液體免疫球蛋白制劑含有作為穩(wěn)定化劑的煙酸衍生物或具有親油性側(cè)鏈的α-氨基酸等(特表平10-502938號(hào)公報(bào))。如上所述，雖然期盼對(duì)于溶液中的抗體的穩(wěn)定化克服化學(xué)分解物的生成、不溶性凝集物生成、可溶性締合物生成的多個(gè)不穩(wěn)定要因，提供穩(wěn)定的抗體制劑的方法，但到目前為止還不了解。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供抑制抗體在溶液中生成可溶性締合物的方法、化學(xué)分解物生成的抑制方法、以及抗體的穩(wěn)定化方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供抑制可溶性締合物生成的溶液狀抗體制劑、以及抑制化學(xué)分解物生成的溶液狀抗體制劑、此外抑制可溶性締合物生成、化學(xué)分解物生成以及不溶性凝集物生成的溶液狀抗體制劑和抗體的可溶性締合物的生成抑制劑、抗體的化學(xué)分解物的生成抑制劑以及抗體穩(wěn)定化劑。本發(fā)明涉及到以下的(1)～(25)內(nèi)容。(1)一種使抗體在溶液中穩(wěn)定的方法，其特征是對(duì)抗體添加甘氨酸和檸檬酸。(2)上述(1)所述的方法，其中使抗體穩(wěn)定的方法是在溶液中抑制抗體生成可溶性締合物和抑制抗體生成化學(xué)分解物的方法。(3)一種抑制抗體在溶液中生成可溶性締合物的方法，其特征是對(duì)抗體添加甘氨酸。(4)一種抑制抗體在溶液中生成化學(xué)分解物的方法，其特征是對(duì)抗體添加檸檬酸。(5)上述(1)～(4)中任一項(xiàng)所述的方法，其中抗體濃度為0.01～150mg/mL。(6)上述(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的方法，其中甘氨酸濃度為10～30mg/mL。(7)上述(1)、(2)和(4)中任一項(xiàng)所述的方法，其中檸檬酸濃度為0.1～50mmol/L。(8)上述(1)～(7)中任一項(xiàng)所述的方法，其中還含有非離子性表面活性劑。(9)上述(1)～(8)中任一項(xiàng)所述的方法，其中溶液的pH處于4～7范圍內(nèi)。(10)上述(1)～(9)中任一項(xiàng)所述的方法，其中抗體為人源化抗體或人抗體。(11)上述(1)～(10)中任一項(xiàng)所述的方法，其中抗體是抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體GD3和抗CC趨化細(xì)胞激素(chemokine)受體4(以下稱為CCR4)抗體中的任一種抗體。(12)一種可抑制抗體的可溶性締合物生成的溶液狀抗體制劑，其特征是含有甘氨酸和抗體。(13)一種可抑制抗體的化學(xué)分解物生成的溶液狀抗體制劑，其特征是含有檸檬酸和抗體。(14)一種可抑制抗體的可溶性締合物生成、化學(xué)分解物生成以及不溶性凝集物生成的溶液狀抗體制劑，其特征是含有甘氨酸、檸檬酸和抗體。(15)上述(12)～(14)中任一項(xiàng)所述的制劑，其中抗體濃度為0.01～150mg/mL。(16)上述(12)、(14)和(15)中任一項(xiàng)所述的制劑，其中甘氨酸濃度為10～30mg/mL。(17)上述(13)～(15)中任一項(xiàng)所述的制劑，其中檸檬酸濃度為0.1～50mmol/L。(18)上述(12)～(17)中任一項(xiàng)所述的制劑，其中還含有非離子性表面活性劑。(19)上述(12)～(18)中任一項(xiàng)所述的制劑，其中溶液的pH處于4～7范圍內(nèi)。(20)上述(12)～(19)中任一項(xiàng)所述的制劑，其中抗體為人源化抗體或人抗體。(21)上述(12)～(20)中任一項(xiàng)所述的制劑，其中抗體是抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體GD3和抗CCR4抗體中的任一種抗體。(22)一種抑制抗體在溶液中生成可溶性締合物的抑制劑，其特征是作為有效成分含有甘氨酸。(23)一種抑制抗體在溶液中生成化學(xué)分解物的抑制劑，其特征是作為有效成分含有檸檬酸。(24)抗體的穩(wěn)定化劑，其特征是作為有效成分含有甘氨酸和檸檬酸。(25)上述(24)的抗體穩(wěn)定化劑，其中抗體的穩(wěn)定化是在溶液中抑制抗體生成可溶性締合物、抑制抗體生成化學(xué)分解物以及抑制抗體生成不溶性凝集物。在本發(fā)明中使用的抗體中也包括抗體片段。這些抗體和抗體片段可以是多克隆抗體或單克隆抗體中的任一種，優(yōu)選單克隆抗體。另外，在上述抗體或抗體片段中也包括人以外的動(dòng)物的抗體、基因重組抗體以及它們的抗體片段。作為基因重組抗體，如人源化抗體、人抗體等，而作為人源化抗體如人型嵌合抗體、人型CDR移植抗體等。作為人型嵌合抗體指的是由人以外的動(dòng)物抗體的VH和VL以及人抗體的CH和CL構(gòu)成的抗體。作為人型嵌合抗體的CH，只要是屬于人免疫球蛋白(以下表記為hIg)，哪一種都可以，其中hIgG型更好，而且可以使用屬于hIgG型中的hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4亞型中的任一種。作為人型嵌合抗體的CL，只要是屬于hIg的，哪一種都可以，可以使用κ型的或λ型的。另外，作為人以外的動(dòng)物，如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和家兔等。作為人型CDR移植抗體指的是在人抗體的VH和VL的合適的位置移植了人以外的動(dòng)物抗體的VH和VL的CDR的抗體。本發(fā)明的人型CDR移植抗體可以通過(guò)設(shè)計(jì)、構(gòu)建編碼將人以外動(dòng)物的抗體的VH和VL的CDR與任意的人抗體的VH和VL的構(gòu)架區(qū)(以下表記為FR)連接的V區(qū)的cDNA，分別插入到含有編碼人抗體的CH和CL的cDNA的動(dòng)物細(xì)胞用表達(dá)載體后構(gòu)建人型CDR移植抗體表達(dá)載體，導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞使其表達(dá)，進(jìn)行制造。作為人型CDR移植抗體的CH，只要是屬于hIg的，哪一種都可以，其中hIgG型更好，而且可以使用屬于hIgG型中的hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4亞型中的任一種。作為人型CDR移植抗體的CL，只要是屬于hIg的，哪一種都可以，可以使用κ型的或λ型的。所謂人抗體，原來(lái)指的是天然存在于人體內(nèi)的抗體，也包括由由于最近基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)育工程技術(shù)上的進(jìn)步而制造的人抗體噬菌體文庫(kù)以及從產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物得到的抗體等。存在于人體內(nèi)的抗體，例如可以通過(guò)對(duì)人末梢血淋巴細(xì)胞進(jìn)行分離，使EB病毒等感染，進(jìn)行不斷繁殖，克隆，取得產(chǎn)生該抗體的淋巴細(xì)胞，對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，由培養(yǎng)上清可以純化該抗體。人抗體噬菌體文庫(kù)是通過(guò)將由人B細(xì)胞制備的抗體基因插入噬菌體基因中，使Fab、scFv等抗體片段在噬菌體表面表達(dá)的文庫(kù)。以對(duì)固定了抗原的基質(zhì)的結(jié)合活性作為指標(biāo)，由該文庫(kù)回收在表面表達(dá)具有所期望的抗原結(jié)合活性的抗體片段的噬菌體。該抗體片段還可以通過(guò)基因工程手法變換為由2條完全的H鏈和2條完全的L鏈構(gòu)成的人抗體分子。產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物指的是基因整合到細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)物。具體來(lái)說(shuō)，例如向小鼠ES細(xì)胞導(dǎo)入人抗體基因，將該ES細(xì)胞移植到小鼠初期胚胎后，通過(guò)使其發(fā)育可以制作產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。由產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作人抗體的制作方法是通過(guò)通常的在人以外的動(dòng)物中進(jìn)行的雜交瘤制作方法取得產(chǎn)生人抗體的雜交瘤，通過(guò)進(jìn)行培養(yǎng)使人抗體在培養(yǎng)上清中生成蓄積的方法。作為在本發(fā)明中使用的抗體片段如包括Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、diabody、dsFv和CDR的肽等。Fab是在用蛋白質(zhì)水解酶木瓜蛋白酶對(duì)IgG型抗體分子進(jìn)行處理后得到的片段中(在H鏈的第224位氨基酸殘基切斷)，H鏈的N末端側(cè)約一半與整個(gè)L鏈通過(guò)二硫鍵結(jié)合的分子量約5萬(wàn)的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。本發(fā)明中使用的Fab可以用蛋白質(zhì)水解酶木瓜蛋白酶對(duì)抗體進(jìn)行處理后獲得。或者將編碼該抗體的Fab的DNA插入到原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體，通過(guò)將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物使其表達(dá)，可以制造Fab。F(ab’)2在用蛋白質(zhì)水解酶木瓜蛋白酶對(duì)IgG型抗體分子進(jìn)行處理后得到的片段中(H鏈在第234位氨基酸殘基被切斷)，比Fab通過(guò)鉸鏈區(qū)的二硫鍵結(jié)合的產(chǎn)物稍大的分子量約10萬(wàn)的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。本發(fā)明中使用的F(ab’)2可以用蛋白質(zhì)水解酶木瓜蛋白酶對(duì)抗體進(jìn)行處理后獲得。或者是使下述的Fab’形成硫醚鍵或二硫鍵可以制作。Fab’是上述F(ab’)2鉸鏈區(qū)的二硫鍵被切斷后的分子量約5萬(wàn)的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。本發(fā)明中使用的Fab’可以通過(guò)用還原劑二硫蘇糖醇對(duì)F(ab’)2進(jìn)行處理后得到。或?qū)⒕幋a該抗體的Fab’片段的DNA插入到原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體，通過(guò)將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物使其表達(dá)，進(jìn)行制造。scFv是1條VH和1條VL用適當(dāng)?shù)倪B接肽(以下表記為P)連接的VH-P-VL或VL-P-VH多肽、具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。本發(fā)明中使用的scFv可以通過(guò)取得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA，將該DNA插入到原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體，通過(guò)將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物使其表達(dá)，進(jìn)行制造。Diabody是scFv二聚體化的抗體片段，是具有二價(jià)抗原結(jié)合活性的抗體片段。二價(jià)的抗原結(jié)合活性可以是同一的，也可以做成一方不同的抗原結(jié)合活性。本發(fā)明中使用的diabody可以通過(guò)取得編碼抗體的VH和VL的cDNA，將編碼scFv的DNA按照連接肽氨基酸序列的長(zhǎng)度在8個(gè)殘基或更少那樣進(jìn)行構(gòu)建，將該DNA插入到原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體，通過(guò)將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物使其表達(dá)，進(jìn)行制造。dsFv指的是使VH和VL中的各1個(gè)氨基酸殘基置換為半胱氨酸后的多肽借助于該半胱氨酸殘基間的二硫鍵結(jié)合的產(chǎn)物。置換為半胱氨酸的氨基酸殘基可以根據(jù)Reiter等人給出的方法(ProteinEngineering，7，697-704，1994)，根據(jù)抗體的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)進(jìn)行選擇。本發(fā)明中使用的dsFv可以通過(guò)取得編碼抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入到原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體，通過(guò)將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物使其表達(dá)，進(jìn)行制造。含有CDR的肽構(gòu)成中含有VH或VL中的至少1個(gè)區(qū)域或多個(gè)區(qū)域的CDR。含有多個(gè)CDR的肽可以直接或借助于適當(dāng)?shù)倪B接肽結(jié)合。本發(fā)明中使用的含有CDR的肽可以通過(guò)構(gòu)建編碼抗體的VH和VL的CDR的DNA，將該DNA插入到原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體，將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物使其表達(dá)，可以制造。另外，含有CDR的肽也可以通過(guò)Fmoc法(笏基甲氧羰基法)、tBoc法(t-丁氧羰基法)等化學(xué)合成法進(jìn)行制造。適用于本發(fā)明的抗體哪一種都可以，作為具體例子，如抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體GD3的單克隆抗體、抗CCR4的單克隆抗體等。作為抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體GD3的單克隆抗體，可舉出如小鼠單克隆抗體KM-641(專利3006943號(hào))、人型嵌合抗體KM-871(特開(kāi)平5-304989)、人型CDR移植抗體KM-8871(WO01/23432)等。作為抗CCR4的單克隆抗體，可舉出如抗人型嵌合抗體KM2760(WO01/64754)、抗CCR4人型CDR移植抗體KM8761(WO03/18635)等。在本發(fā)明中所謂化學(xué)分解物指的是抗體的二硫鍵或肽鍵開(kāi)裂后的產(chǎn)物。具體來(lái)說(shuō)，如單克隆抗體的H鏈或L鏈的一部分或整個(gè)脫落的產(chǎn)物。另外也包含上述的Fab片段、Fab片段的H鏈和L鏈進(jìn)一步開(kāi)裂的產(chǎn)物。在本發(fā)明中所謂不溶性凝集物指的是由于高級(jí)結(jié)構(gòu)變化等引起分子表面的疏水性增大，水溶性顯著降低的分子進(jìn)行集合，造成不溶化的產(chǎn)物。因此通過(guò)不溶性凝集物的生成，溶液狀抗體制劑的濁度增大。在本發(fā)明中所謂可溶性締合物指的是雖然抗體分子之間進(jìn)行締合，但抗體分子高級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有變化，或高級(jí)結(jié)構(gòu)變化比較輕微，在水溶液中沒(méi)有析出的程度下維持該締合物的水溶性的產(chǎn)物。因此可溶性締合物的生成不會(huì)使制劑的濁度增大。通常進(jìn)行締合的抗體分子數(shù)比較少，一般為2～4聚體。本發(fā)明的溶液狀抗體制劑的制造法只要是按照一般的溶液狀制劑的制造進(jìn)行的方法，并沒(méi)有特別限定，具體來(lái)說(shuō)，可以預(yù)先制備抗體和添加劑的溶液，通過(guò)將它們混合進(jìn)行制造。另外將抗體或添加劑原料直接添加到溶劑中，通過(guò)使它們?nèi)芙庖部梢灾圃?。本發(fā)明的抗體在溶液中的穩(wěn)定化方法、抑制溶液中的可溶性締合物生成的方法以及抑制溶液中的化學(xué)分解物生成的方法中，作為抗體濃度只要是在0.01～150mg/mL范圍內(nèi)都可以，優(yōu)選0.1～50mg/mL、更優(yōu)選1～20mg/mL。本發(fā)明的抗體在溶液中的穩(wěn)定化方法、抑制溶液中的可溶性締合物生成的方法中，添加的甘氨酸的含量，作為甘氨酸濃度只要是在10～30mg/mL范圍內(nèi)都可以，優(yōu)選20～25mg/mL、更優(yōu)選22～23mg/mL。作為添加的甘氨酸的形態(tài)如甘氨酸、甘氨酸鹽酸鹽等藥學(xué)上容許的甘氨酸的鹽類等。本發(fā)明的抗體在溶液中的穩(wěn)定化方法、抑制溶液中的可溶性締合物生成的方法中，添加的檸檬酸的含量，作為檸檬酸濃度只要是在0.1～50mmol/L范圍內(nèi)都可以，優(yōu)選0.5～20mmol/L、更優(yōu)選1～10mmol/L。作為添加的檸檬酸的形態(tài)如檸檬酸、檸檬酸鈉等藥學(xué)上容許的檸檬酸的鹽類等。本發(fā)明的抗體在抗體溶液中的穩(wěn)定化方法起到了抑制抗體在溶液中的可溶性締合物生成以及抑制抗體在溶液中的化學(xué)分解物生成以及抑制抗體在溶液中的不溶性凝集物的效果。作為本發(fā)明制劑中抗體的濃度，只要是在0.01～150mg/mL范圍內(nèi)都可以，優(yōu)選0.1～50mg/mL、更優(yōu)選1～20mg/mL。本發(fā)明中甘氨酸的含量，作為甘氨酸濃度只要是在10～30mg/mL范圍內(nèi)都可以，優(yōu)選20～25mg/mL、更優(yōu)選22～23mg/mL。作為添加的甘氨酸的形態(tài)如甘氨酸、甘氨酸鹽酸鹽等藥學(xué)上容許的甘氨酸的鹽類等。本發(fā)明中檸檬酸的含量，作為檸檬酸濃度只要是在0.1～50mmol/L范圍內(nèi)都可以，優(yōu)選0.5～20mmol/L、更優(yōu)選l～10mmol/L。作為添加的檸檬酸的形態(tài)如檸檬酸、檸檬酸鈉等藥學(xué)上容許的檸檬酸的鹽類等。本發(fā)明的制劑除了上述的抗體、甘氨酸、檸檬酸之外，還可以含有非離子性表面活性劑，合適的表面活性劑如山梨糖醇酐脂肪酸酯類、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯類、聚氧乙烯聚氧丙二醇類、聚氧乙烯固化蓖麻油類、聚乙二醇脂肪酸醚類、甘油脂肪酸酯類、蔗糖脂肪酸酯類等。特別合適的如聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(聚山梨醇酯20)、聚氧化乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(聚山梨醇酯80)等。作為非離子性表面活性劑的濃度，只要是藥學(xué)上容許的范圍沒(méi)有特別限制，優(yōu)選0.01～10mg/mL范圍內(nèi)，更優(yōu)選0.05～1mg/mL、最優(yōu)選0.1～0.3mg/mL。本發(fā)明的制劑希望將pH控制在合適的值內(nèi)。作為合適的pH值，優(yōu)選pH4～7，更優(yōu)選pH5～6。對(duì)于pH，可以使用例如鹽酸、硫酸、磷酸、檸檬酸、醋酸、乳酸、酒石酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀等作為醫(yī)藥品容許的各種pH調(diào)節(jié)劑。另外在本發(fā)明的制劑中也可以添加象以下例舉的作為醫(yī)藥品容許的添加劑。作為等滲劑，如氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等無(wú)機(jī)鹽類，葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇等糖和糖醇類，甘油、葡聚糖、丙二醇、聚乙二醇、尼克酰胺等。作為鎮(zhèn)痛劑，如肌醇、三氯叔丁醇、丙二醇、苯甲醇、利多卡因、硫酸鎂等。作為保存劑，對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯等對(duì)羥基苯甲酸酯類、苯甲酸、乙醇、依地酸四鈉、檸檬酸、水楊酸、山梨糖醇、山梨酸、甘油、三氯叔丁醇、苯酚、丙二醇、苯甲醇等。作為粘稠劑，海藻酸鈉、黃膠原樹(shù)膠、甘油、明膠、葡聚糖、糊精、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素等纖維素烷基醚類、聚乙二醇、聚乙烯醇等。作為抗氧化劑，如異抗壞血酸、二丁基羥甲苯、丁基羥茴香醚、巰基乙酸鈉、α-生育酚、乙酸生育酚、L-抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、依地酸鈉等。本發(fā)明的制劑的理想給予方式是注射，也可以使用經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻、經(jīng)肺、經(jīng)口等給予方式。作為特別理想的注射給予方法，如向靜脈內(nèi)、皮下組織內(nèi)或肌肉內(nèi)注射的方法。另外使用合適的給予裝置可以向例如腫瘤、炎癥等病變部位直接給藥。另外本發(fā)明的制劑可以在使用時(shí)將制劑稀釋后使用。作為稀釋液如生理鹽水、糖液等輸液等。被稀釋的制劑可以通過(guò)點(diǎn)滴、注射器泵等一邊控制速度一邊向生體內(nèi)給藥。本發(fā)明的溶液狀抗體制劑可以通過(guò)例如無(wú)菌過(guò)濾等一般的手法進(jìn)行滅菌后，在無(wú)菌環(huán)境下封入到安瓶、小玻璃瓶、注射器等注射劑容器中，作為注射劑使用。另外當(dāng)將溶液狀抗體組合物封入容器中時(shí)，也可以使用氮?dú)饣驓鍤獾榷栊詺怏w對(duì)容器空間部的氣體進(jìn)行置換。以下給出實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明。但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例限定。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1樣品制劑的制備分別制備第1表所示的處方1～5的溶液組合物，無(wú)菌過(guò)濾后，注入玻璃小瓶中，用橡皮塞、鋁蓋密封，做成樣品制劑。這些操作都是在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行的?？贵w使用特開(kāi)平5-304989所述方法制造的抗神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的人型嵌合抗體KM-871。第1表實(shí)施例2穩(wěn)定性試驗(yàn)將實(shí)施例1制備的各個(gè)樣品制劑于40℃下保存1個(gè)月后，就以下的試驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。(1)內(nèi)容液的目視觀察在白色熒光燈下對(duì)各樣品制劑的內(nèi)容液邊緩慢攪拌邊用目視進(jìn)行觀察，判定有無(wú)混濁。(2)濁度測(cè)定將樣品制劑的內(nèi)容液采集到石英微量杯中，通過(guò)紫外分光光度計(jì)(日立U-3300型)測(cè)定波長(zhǎng)400nm的吸光度(O.D.400)。(3)凝膠過(guò)濾HPLC就樣品制劑的內(nèi)容液在以下條件下通過(guò)HPLC進(jìn)行分析。(HPLC條件)柱子TSKgelG3000SWXL(東曹)移動(dòng)相含有0.3mol/L氯化鈉的0.5mol/L磷酸鹽緩沖液測(cè)定波長(zhǎng)280nm流速1mL/min注入量40μL裝置LC-10A系統(tǒng)(島津制作所)在HPLC圖上，從未變化物峰開(kāi)始洗脫到高分子量側(cè)的成分的峰面積的總和作為可溶性締合物峰面積，通過(guò)以下式(1)算出可溶性締合物含量。在HPLC圖上，從未變化物峰開(kāi)始洗脫到低分子量側(cè)的成分的峰面積的總和作為化學(xué)分解物峰面積，通過(guò)以下式(2)算出化學(xué)分解物含量。第2表給出了(1)內(nèi)容液的目視觀察和(2)濁度(O.D.400)測(cè)定的結(jié)果。在第2表中，濁度(O.D.400)的值表示從測(cè)定值減去初期值，表示保存期間(40℃、1個(gè)月)中的增加量。第2表<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="768">40℃、保存1個(gè)月有無(wú)混濁(目視觀察)O.D.400的增加量處方1無(wú)0.002處方2無(wú)0.000處方3無(wú)0.002處方4無(wú)0.002處方5無(wú)0.002</table></tables>在所有的處方(處方1～5)中，內(nèi)容液的目視觀察結(jié)果沒(méi)有看到混濁。另外在所有的處方中幾乎看不到濁度(0.D.400)的增大。在第3表示出凝膠過(guò)濾HPLC的結(jié)果。第3表的值表示從測(cè)定值減去初期值，表示保存期間(40℃、1個(gè)月)中的增加量。第3表對(duì)處方1(磷酸)與處方2和3(檸檬酸)進(jìn)行比較，化學(xué)分解物的增加量與處方2和處方3比處方1少。以上表明通過(guò)向溶液中添加檸檬酸，可以降低化學(xué)分解物的增加。另外對(duì)處方2和處方4進(jìn)行比較，可溶性締合物的增加量處方4比處方2少，表明通過(guò)向溶液中添加甘氨酸，可以降低可溶性締合物的增加。另外在處方4中再添加了聚山梨醇酯80的處方5中，也可維持溶液的穩(wěn)定性。實(shí)施例3不溶性凝集物抑制效果的確認(rèn)1(樣品調(diào)制)分別制備第4表所示的處方7～11的溶液組合物，用孔徑0.2μm的過(guò)濾膜過(guò)濾，注入玻璃制試管中。將試管口用硅樹(shù)脂制的塞進(jìn)行密封，作為樣品制劑?？贵w使用特開(kāi)平5-304989中公開(kāi)的抗神經(jīng)節(jié)苷脂GD3的人型嵌合抗體KM-871。第4表實(shí)施例4不溶性凝集物抑制效果的確認(rèn)1(穩(wěn)定性試驗(yàn))將實(shí)施例3制備的各個(gè)樣品制劑于70℃下保存270秒后，就以下的試驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。(1)內(nèi)容液的目視觀察在白色熒光燈下對(duì)各樣品制劑的內(nèi)容液邊緩慢攪拌邊用目視進(jìn)行觀察，判定有無(wú)混濁。(2)濁度測(cè)定將樣品制劑的內(nèi)容液采集到石英微量杯中，通過(guò)紫外分光光度計(jì)(日立U-3300型)測(cè)定波長(zhǎng)400nm的吸光度(O.D.400)。(1)內(nèi)容液的目視和(2)濁度(O.D.400)測(cè)定的結(jié)果如第5表所示。第5表處方7目視觀察結(jié)果有明顯白濁，濁度(O.D.400)也表現(xiàn)出高值。而對(duì)在處方8、處方9、處方10和處方11中內(nèi)容液的目視觀察結(jié)果沒(méi)有看到混濁，確認(rèn)濁度(O.D.400)值也比處方7顯著低。實(shí)施例5不溶性凝集物抑制效果的確認(rèn)2(樣品制劑)分別制備第6表所示的處方12～16的溶液組合物，用孔徑0.2μm的過(guò)濾膜過(guò)濾，注入玻璃制試管中。將試管口用硅樹(shù)脂制的塞進(jìn)行密封，作為樣品制劑?？贵w使用WO03/18635公開(kāi)的抗CCR4人型CDR移植抗體KM8761。第6表實(shí)施例6不溶性凝集物抑制效果的確認(rèn)2(穩(wěn)定性試驗(yàn))將實(shí)施例5制備的各個(gè)樣品制劑于70℃下保存210秒后，就以下的試驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。(1)內(nèi)容液的目視觀察在白色熒光燈下對(duì)各樣品制劑的內(nèi)容液邊緩慢攪拌邊用目視進(jìn)行觀察，判定有無(wú)混濁。(2)濁度測(cè)定將樣品制劑的內(nèi)容液采集到石英微量杯中，通過(guò)紫外分光光度計(jì)(日立U-3300型)測(cè)定波長(zhǎng)400nm的吸光度(O.D.400)。(1)內(nèi)容液的目視和(2)濁度(O.D.400)測(cè)定的結(jié)果如第7表所示。第7表處方12目視觀察結(jié)果有明顯白濁，濁度(O.D.400)也表現(xiàn)出高值。而對(duì)在處方13、處方14、處方15和處方16中內(nèi)容液的目視觀察結(jié)果沒(méi)有看到混濁，確認(rèn)濁度(O.D.400)值也比處方12顯著低。實(shí)施例7可溶性締合物以及化學(xué)分解物抑制效果的確認(rèn)(樣品調(diào)制)分別制備第8表所示的處方17～21的溶液組合物，無(wú)菌過(guò)濾后，注入玻璃小瓶中，用橡皮塞、鋁蓋密封，做成樣品制劑。這些操作都是在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行的。體使用WO03/18635公開(kāi)的抗CCR4人型CDR移植抗體KM8761。第8表實(shí)施例8可溶性締合物以及化學(xué)分解物抑制效果的確認(rèn)(穩(wěn)定性試驗(yàn))將實(shí)施例8制備的各樣品制劑于40℃下保存1個(gè)月后，就內(nèi)容液在以下條件下通過(guò)凝膠過(guò)濾HPLC進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)穩(wěn)定性。(HPLC條件)柱子TSKgelG3000SWXL(東曹)移動(dòng)相含有0.3mol/L氯化鈉的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液測(cè)定波長(zhǎng)280nm流速1mL/min注入量40μL裝置LC-10A系統(tǒng)(島津制作所)在HPLC圖上，從未變化物峰開(kāi)始洗脫到高分子量側(cè)的成分的峰面積的總和作為可溶性締合物峰面積，通過(guò)以下式(1)算出可溶性締合物含量。在HPLC圖上，從未變化物峰開(kāi)始洗脫到低分子量側(cè)的成分的峰面積的總和作為化學(xué)分解物峰面積，通過(guò)以下式(2)算出化學(xué)分解物含量。第9表給出了凝膠過(guò)濾HPLC的結(jié)果。結(jié)果表示從測(cè)定值減去初期值，表示保存期間(40℃、1個(gè)月)中的增加量。第9表<tablesid="table9"num="009"><tablewidth="770">40℃、保存1個(gè)月的增加量可溶性締合物(％)化學(xué)分解物(％)處方170.110.96處方18-0.020.44處方190.020.47處方20-0.050.35處方210.050.38</table></tables>可溶性締合物以及化學(xué)分解物的任一個(gè)中，對(duì)處方17、處方18、處方19、處方20以及處方21比較的結(jié)果可知具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。實(shí)施例9制劑的穩(wěn)定性確認(rèn)(樣品調(diào)制)分別制備第10表所示的處方22的溶液組合物，實(shí)施無(wú)菌過(guò)濾后，注入玻璃制小瓶中，用橡皮塞、鋁蓋進(jìn)行密封，作為樣品制劑。這些操作全部在無(wú)菌的環(huán)境下進(jìn)行?？贵w使用WO03/18635公開(kāi)的抗CCR4人型CDR移植抗體KM8761。第10表<tablesid="table10"num="010"><tablewidth="766">抗體濃度(mg/mL)添加物pH處方224檸檬酸2mmol/L甘氨酸22.5mg/mL聚山梨醇酯800.2mg/mL5.5</table></tables>實(shí)施例10制劑的穩(wěn)定性確認(rèn)(40℃保存)將實(shí)施例9制備的各樣品制劑于40℃下保存1個(gè)月后，就內(nèi)容液在以下條件下通過(guò)濾膠過(guò)濾HPLC進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)穩(wěn)定性。(HPLC條件)柱子TSKgelG3000SWxL(東曹)移動(dòng)相含有0.3mol/L氯化鈉的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液測(cè)定波長(zhǎng)280nm流速1mL/min注入量40μL裝置LC-10A系統(tǒng)(島津制作所)在HPLC圖上，從未變化物峰開(kāi)始洗脫到高分子量側(cè)的成分的峰面積的總和作為可溶性締合物峰面積，通過(guò)以下式(1)算出可溶性締合物含量。在HPLC圖上，從未變化物峰開(kāi)始洗脫到低分子量側(cè)的成分的峰面積的總和作為化學(xué)分解物峰面積，通過(guò)以下式(2)算出化學(xué)分解物含量。第11表給出了凝膠過(guò)濾HPLC的結(jié)果。結(jié)果表示從測(cè)定值減去初期值，表示保存期間(40℃、1個(gè)月)中的增加量。第11表<tablesid="table11"num="011"><tablewidth="766">40℃、保存1個(gè)月的增加量可溶性締合物(％)化學(xué)分解物(％)處方22-0.020.46</table></tables>確認(rèn)含有檸檬酸和甘氨酸的處方22在可溶性締合物和化學(xué)分解物任一方面都具有優(yōu)越的穩(wěn)定性。實(shí)施例11制劑的穩(wěn)定性確認(rèn)(70℃保存)將實(shí)施例9制備的制劑的內(nèi)容液用孔徑0.2μm的過(guò)濾膜過(guò)濾，注入玻璃制試管中。將試管口用栓塞進(jìn)行密封，作為樣品。于70℃下保存210秒后就以下試驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。(1)內(nèi)容液的目視觀察在白色熒光燈下對(duì)各樣品制劑的內(nèi)容液邊緩慢攪拌邊用目視進(jìn)行觀察，判定有無(wú)混濁。(2)濁度測(cè)定將樣品制劑的內(nèi)容液采集到石英微量杯中，通過(guò)紫外分光光度計(jì)(日立U-3300型)測(cè)定波長(zhǎng)400nm的吸光度(O.D.400)。(1)內(nèi)容液的目視和(2)濁度(O.D.400)測(cè)定的結(jié)果如第12表所示。第12表確認(rèn)含有檸檬酸和甘氨酸的處方22在不溶性凝集物方面具有優(yōu)越的穩(wěn)定性。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明可以提供抗體在溶液中的穩(wěn)定化方法和穩(wěn)定的溶液狀抗體制劑。權(quán)利要求1.一種使抗體在溶液中穩(wěn)定的方法，其特征是對(duì)抗體添加甘氨酸和檸檬酸。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中使抗體穩(wěn)定的方法是在溶液中抑制抗體生成可溶性締合物和抑制抗體生成化學(xué)分解物的方法。3.一種抑制抗體在溶液中生成可溶性締合物的方法，其特征是對(duì)抗體添加甘氨酸。4.一種抑制抗體在溶液中生成化學(xué)分解物的方法，其特征是對(duì)抗體添加檸檬酸。5.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的方法，其中抗體濃度為0.01～150mg/mL。6.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其中甘氨酸濃度為10～30mg/mL。7.權(quán)利要求1、2和4中任一項(xiàng)所述的方法，其中檸檬酸濃度為0.1～50mmol/L。8.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的方法，其中還含有非離子性表面活性劑。9.權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的方法，其中溶液的pH處于4～7范圍內(nèi)。10.權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)所述的方法，其中抗體為人源化抗體或人抗體。11.權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)所述的方法，其中抗體是抗神經(jīng)節(jié)苷脂GD3抗體和抗CC趨化細(xì)胞激素受體4(以下稱為CCR4)抗體中的任一種抗體。12.一種可抑制抗體可溶性締合物生成的溶液狀抗體制劑，其特征是含有甘氨酸和抗體。13.一種可抑制抗體化學(xué)分解物生成的溶液狀抗體制劑，其特征是含有檸檬酸和抗體。14.一種可抑制抗體可溶性締合物生成、化學(xué)分解物生成以及不溶性凝集物生成的溶液狀抗體制劑，其特征是含有甘氨酸、檸檬酸和抗體。15.權(quán)利要求12～14中任一項(xiàng)所述的制劑，其中抗體濃度為0.01～150mg/mL。16.權(quán)利要求12、14和15中任一項(xiàng)所述的制劑，其中甘氨酸濃度為10～30mg/mL。17.權(quán)利要求13～15中任一項(xiàng)所述的制劑，其中檸檬酸濃度為0.1～50mmol/L。18.權(quán)利要求12～17中任一項(xiàng)所述的制劑，其中還含有非離子性表面活性劑。19.權(quán)利要求12～18中任一項(xiàng)所述的制劑，其中溶液的pH處于4～7范圍內(nèi)。20.權(quán)利要求12～19中任一項(xiàng)所述的制劑，其中抗體為人源化抗體或人抗體。21.權(quán)利要求12～20中任一項(xiàng)所述的制劑，其中抗體是抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體GD3和抗CCR4抗體中的任一種抗體。22.一種抑制抗體在溶液中生成可溶性締合物的抑制劑，其特征是作為有效成分含有甘氨酸。23.一種抑制抗體在溶液中生成化學(xué)分解物的抑制劑，其特征是作為有效成分含有檸檬酸。24.抗體的穩(wěn)定化劑，其特征是作為有效成分含有甘氨酸和檸檬酸。25.權(quán)利要求24的抗體的穩(wěn)定化劑，其中抗體的穩(wěn)定化是在溶液中抑制抗體生成可溶性締合物、抑制抗體生成化學(xué)分解物以及抑制抗體生成不溶性凝集物。全文摘要本發(fā)明提供在溶液中抑制抗體生成可溶性締合物的方法、抑制抗體化學(xué)分解物生成的方法、以及抗體的穩(wěn)定化方法。另外，本發(fā)明還提供抑制可溶性締合物被生成的溶液狀抗體制劑、以及抑制化學(xué)分解物生成的溶液狀抗體制劑以及抑制可溶性締合物生成、化學(xué)分解物生成和不溶性凝集物生成的溶液狀抗體制劑，以及抗體的可溶性締合物生成的抑制劑、抗體的化學(xué)分解物生成的抑制劑以及抗體穩(wěn)定化劑。文檔編號(hào)C07K16/46GK1856507SQ20048002718公開(kāi)日2006年11月1日申請(qǐng)日期2004年10月1日優(yōu)先權(quán)日2003年10月1日發(fā)明者上野裕司,柏下隆,石原淳,中倉(cāng)政司,山內(nèi)恭子申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社