專(zhuān)利名稱(chēng)：司登尼亞蛋白小體-司登尼亞鈣蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸、這些多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途、和這些多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。更具體地，本發(fā)明中的多肽是人司登尼亞蛋白小體。本發(fā)明還涉及此多肽活性的抑制。
背景技術(shù)：
司登尼亞鈣蛋白(原稱(chēng)硬骨魚(yú)鈣蛋白和低血鈣蛋白)是一種由有骨魚(yú)類(lèi)內(nèi)分泌腺-司登尼亞小體產(chǎn)生的抗高血鈣的糖蛋白激素。本發(fā)明中的多肽在一級(jí)結(jié)構(gòu)上和魚(yú)類(lèi)中調(diào)節(jié)鈣水平的糖蛋白激素高度同源。
人們對(duì)非人類(lèi)的司登尼亞蛋白小體已有了深入的研究。最近，一個(gè)來(lái)源于Anguillaaustralis的司登尼亞蛋白小體已經(jīng)被純化克隆。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)硬骨魚(yú)的腎臟中含有分泌顆粒-司登尼亞小體。電子顯微鏡指示此分泌顆粒有蛋白性質(zhì)，可能是未知生理生化功能的激素或酶(Butkus，A.et al.Mol.Cell Endocrinol，54123-33(1987))。
從鱒魚(yú)的司登尼亞小體也已經(jīng)分離純化出了一種糖蛋白，它被認(rèn)作是低血鈣蛋白-魚(yú)類(lèi)主要的低血鈣激素。這種蛋白在魚(yú)的幾個(gè)種(特別是歐洲鰻魚(yú)、tilapia金魚(yú)和鯉魚(yú))的司登尼亞小體中含量相當(dāng)大。低血鈣蛋白在實(shí)驗(yàn)條件誘導(dǎo)血鈣濃度增加的情況下典型地從司登尼亞小體中釋放出來(lái)。超微結(jié)構(gòu)觀察顯示誘導(dǎo)血鈣濃度增加后司登尼亞小體的產(chǎn)生低血鈣蛋白的細(xì)胞幾乎完全解體。分離得到的糖蛋白表觀分子量為54kDa(Lafeber F.P.et al.，Gen Comp.Endocrinolo，6919-30(1988))。
另外，最近結(jié)果顯示幾個(gè)硬骨魚(yú)鈣蛋白的合成多肽片段抑制彩虹鱒幼魚(yú)(Salmogairdneri)鈣的吸收。鰻魚(yú)和鮭魚(yú)的硬骨魚(yú)鈣蛋白的氨基端肽段(從氨基酸1到20)在鈣吸收循環(huán)的高點(diǎn)上明顯抑制Ca45的吸收(可達(dá)75％)，雖然此肽段的摩爾有效劑量20至200倍于完整分子。與此相反，鰻魚(yú)的硬骨魚(yú)鈣蛋白的羧基端片段(從氨基酸202-231)對(duì)鈣的吸收沒(méi)有抑制作用(Milliken C.E.et al.，Gen.Comp.Endocrinol，77416-22(1990))。
兩個(gè)鮭魚(yú)司登尼亞鈣蛋白的純化和特性以及用體外和體內(nèi)模型系統(tǒng)檢測(cè)相對(duì)于鈣的激素分泌調(diào)節(jié)的方法也都有了描述。有關(guān)一個(gè)來(lái)自鮭魚(yú)CSλgt10 cDNA文庫(kù)的coho鮭魚(yú)司登尼亞鈣蛋白信使RNA(mRNA)的分子克隆和cDNA序列分析也有了描述。鮭魚(yú)司登尼亞鈣蛋白mRNA長(zhǎng)度大約為2Kda，編碼一個(gè)256個(gè)氨基酸的初級(jí)翻譯產(chǎn)物。前33個(gè)殘基組成了激素的前蛋白區(qū)，而剩下的223個(gè)殘基構(gòu)成了激素的成熟形式。(WagnerG.F.et al.，Mol.Cell Endocrinol，907-15(1992))。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種新的成熟多肽，即司登尼亞鈣蛋白小體，及其片段、類(lèi)似物和衍生物。本發(fā)明中的司登尼亞鈣蛋白小體是人源化的。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼這些多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用重組技術(shù)生產(chǎn)此多肽的方法。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了利用此多肽或編碼此多肽的多核苷酸達(dá)到治療目的的方法，例如，治療電解質(zhì)紊亂引起的腎臟、骨骼和心臟疾病，和過(guò)高的骨吸收引起的紊亂，如骨質(zhì)疏松和Paget氏病。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了抗此多肽的抗體。此抗體可用于導(dǎo)致痙攣、抽搐和其它相關(guān)紊亂癥狀的低血鈣的治療。低血鈣可有大量不同原因引起，包括腎衰竭、甲狀旁腺肥大，嚴(yán)重感染或燒傷(可導(dǎo)致從胞間液和從胰腺不足捕獲鈣元素)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供此多肽的拮抗劑/抑制劑，可用于抑制此多肽的活性，例如，在治療低血鈣癥和骨質(zhì)疏松時(shí)。
本發(fā)明的這些和其它一些方面對(duì)本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)通過(guò)本文的講授后是顯而易見(jiàn)的。
下列附圖是本發(fā)明的實(shí)施方案的示意，而并非是對(duì)權(quán)利要求所限的本發(fā)明的范圍的限制。


圖1顯示預(yù)加工的司登尼亞鈣蛋白小體的cDNA的序列和推導(dǎo)的氨基酸序列。氨基酸序列用標(biāo)準(zhǔn)3字母簡(jiǎn)寫(xiě)碼標(biāo)識(shí)在對(duì)應(yīng)cDNA的下面。
圖2顯示人司登尼亞鈣蛋白(上行)和從Oncorhynchus kisutch分離得到的司登尼亞鈣蛋白(下行)的多肽序列的比較。在Oncorhynchus kisytch來(lái)源的司登尼亞鈣蛋白的204位氨基酸之后，二者之間不存在明顯的序列同源性。從Oncorhynchus kisutch分離得到的司登尼亞鈣蛋白的全序列長(zhǎng)度為256個(gè)氨基酸。
圖3顯示細(xì)菌表達(dá)和純化后的人司登尼亞鈣蛋白多肽的帶型。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的成熟多肽，或1994年1月25日ATCC保藏號(hào)為No.75652的保藏克隆的cDNA編碼的成熟多肽的分離的核酸(多核苷酸)。圖1的多核苷酸序列包含由前15個(gè)核苷酸組成的前序列。此多核苷酸序列編碼一個(gè)247個(gè)氨基酸的翻譯產(chǎn)物，其中前33個(gè)氨基酸可能代表此蛋白的前蛋白原區(qū)。這樣，前蛋白原區(qū)切除后就形成一個(gè)214個(gè)氨基酸的成熟活性多肽。
本發(fā)明的多核苷酸是從人早期肺cDNA文庫(kù)中分離出來(lái)的。它包含一個(gè)編碼247個(gè)氨基酸的前多肽原的開(kāi)放閱讀框架。此多肽和來(lái)自Anguilla australis的司登尼亞鈣蛋白之間有高度同源性，在一個(gè)195氨基酸的部分重疊區(qū)中有119個(gè)氨基酸完全相同(61％)。它還和來(lái)自O(shè)ncorhynchus kisutch的司登尼亞鈣蛋白之間有很高的同源性，在一個(gè)204氨基酸的部分重疊區(qū)中有118個(gè)氨基酸完全相同(57％)。
本發(fā)明中的多核苷酸可以以RNA的形式，也可以以DNA的形式提供，其中的DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈的或單鏈的，如果是單鏈的則可以是編碼鏈或非編碼鏈(反義鏈)。編碼此成熟多肽的編碼序列可能和圖1所示的編碼序列相同，也可能和保藏克隆中的相同，或者可能是因?yàn)檫z傳密碼的冗余性和簡(jiǎn)并性而形成的一個(gè)不同的編碼序列，但此編碼序列編碼和圖1的DNA或保藏克隆所編碼的同樣的成熟多肽。
編碼圖1的成熟多肽或保藏cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可能包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和諸如前導(dǎo)序列或分泌序列或蛋白原序列的附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)和諸如內(nèi)含子或成熟多肽的5和/或3′端非編碼區(qū)的非編碼序列。
因此，術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”限定為包括此多肽編碼序列的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述的多核苷酸的變異體，其編碼具有圖1推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽或保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類(lèi)似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可能是此多核苷酸天然發(fā)生的等位突變體或此多核苷酸的非天然發(fā)生的突變體。
因此，本發(fā)明包括編碼圖1所示的相同成熟多肽或其可溶形式或由保藏克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及這些多核苷酸的變異體，所述變異體編碼圖1的多肽或由保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類(lèi)似物。這些核苷酸變異體包括缺失變異體、置換變異體和增加或插入變異體。
如上所述，多核苷酸可以具有為圖1所示的編碼序列的天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列，或保藏克隆的編碼序列的天然發(fā)生的等位基因變異體的編碼序列。如本領(lǐng)域所公知的，等位基因變異體是多核苷酸的另一種形式，其可以置換、缺失或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸，但基本上不改變所編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還包括多核苷酸，其中成熟多肽的編碼序列可以在同一讀框內(nèi)與有助于多肽從宿主細(xì)胞表達(dá)和分泌的多核苷酸融合，例如前導(dǎo)序列，其是用于控制多肽從細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌序列。具有前導(dǎo)序列的多肽是一種前蛋白(preprotein)，前導(dǎo)序列可以由宿主細(xì)胞切下以形成多肽的成熟形式。多核苷酸還可編碼一種蛋白原(proprotein)，其是成熟蛋白加上另外的5’氨基酸殘基。具有序列原(prosequence)的成熟蛋白為蛋白原并是蛋白質(zhì)的非活性形式，一旦序列原被切掉，則保留一活性成熟蛋白。
因此，例如，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼一成熟蛋白，或編碼一具有序列原的蛋白或一具有序列原和前序列(前導(dǎo)序列)的蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸還可以具有在讀框內(nèi)與標(biāo)記序列融合的編碼序列，其可用于純化本發(fā)明的多肽。標(biāo)記序列可以是，例如，由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)記物用于在細(xì)菌宿主中純化與該標(biāo)記物融合的成熟多肽，或者，例如，當(dāng)使用哺乳動(dòng)物宿主如COS-7細(xì)胞時(shí)，標(biāo)記序列可以是血凝素標(biāo)記物(HA)。HA標(biāo)記物相應(yīng)于由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et al.，Cell，37767(1984))。
本發(fā)明還涉及可與上述序列雜交的多核苷酸，條件是序列間具有至少50％、優(yōu)選70％的同一性。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指雜交僅發(fā)生在序列間具有至少95％、優(yōu)選97％同一性的情況下。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼基本上保持了由圖1的cDNA或保藏的cDNA編碼的成熟多肽的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。
本文所指的保藏物將根據(jù)國(guó)際承認(rèn)的用于專(zhuān)利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的規(guī)定期限保藏。這些保藏僅為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供方便，而不是對(duì)根據(jù)35U.S.C 112索取保藏物的許可。保藏物中所含的多核苷酸的序列以及該序列編碼的多肽的氨基酸序列引入本文作參考，并且在與本文的序列描述有抵觸時(shí)，其是參照。制造、使用或銷(xiāo)售保藏物需經(jīng)許可，而本文不授予這種許可。
本發(fā)明還涉及具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA編碼的氨基酸序列的司登尼亞小體多肽，以及該多肽的片段、類(lèi)似物和衍生物。
當(dāng)指圖1的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類(lèi)似物”是指基本上保持這些多肽的相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。因此，類(lèi)似物包括蛋白原，其可通過(guò)裂解蛋白原部分而激活以生產(chǎn)有活性的成熟多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
圖1的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類(lèi)似物可以是(i)其中的一或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基取代(優(yōu)選由保守的氨基酸殘基取代)，并且這種取代的氨基酸殘基可以由遺傳密碼編碼，也可不是由遺傳密碼編碼，或者(ii)其中的一或多個(gè)氨基酸殘基包括一取代基，或者(iii)其中的成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物例如為增加多肽的半壽期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加的氨基酸與成熟多肽融合，例如前導(dǎo)序列或分泌序列或用于純化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。這種片段、衍生物和類(lèi)似物被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)而理解的范圍。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選地以分離的形式提供，并優(yōu)選純化至均一性。
術(shù)語(yǔ)“分離的”是指從其原始環(huán)境(例如，若其是天然存在的則是天然環(huán)境)中脫離的物質(zhì)。例如，存在于活體動(dòng)物中的天然發(fā)生的多核苷酸或多肽不是分離的，但從一些或所有共存物質(zhì)中分離的相同的多核苷酸或DNA或多肽則是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或多肽可以是某種組合物的一部分，并且如果這種載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分，則其還是分離的。
本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞，以及用重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
宿主細(xì)胞用本發(fā)明的載體遺傳工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所述的載體可以是克隆載體或表達(dá)載體。載體可以是質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等。遺傳工程化的宿主細(xì)胞可以在改良的傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，改良培養(yǎng)基是為了激活啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增司登尼亞基因。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是先前用于選擇用來(lái)表達(dá)的宿主細(xì)胞的條件，其對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明的多核苷酸可通過(guò)重組技術(shù)用于生產(chǎn)多肽，因此，例如，該多核苷酸可以包括在任一種表達(dá)載體中特別是載體或質(zhì)粒中以表達(dá)多肽。這些載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；酵母質(zhì)粒；衍生于質(zhì)粒和噬菌體DNA的結(jié)合體的載體；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和擬狂犬病毒。然而，也可使用任何其它載體，只要其在宿主中可復(fù)制和生存。
如上所述，可通過(guò)多種程序?qū)⒑线m的DNA序列插入載體，通常，通過(guò)本領(lǐng)域公知的程序?qū)NA序列插入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。這些和其它程序?qū)儆诒绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員的范疇。
可通過(guò)各種程序?qū)⒑线m的DNA序列插入載體，一般地，該DNA序列通過(guò)本領(lǐng)域已知的程序插入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。這些程序和其它程序被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的范疇。
表達(dá)載體中的DNA序列與合適的表達(dá)調(diào)控序列(啟動(dòng)子)連接以指導(dǎo)mRNA合成，作為這些啟動(dòng)子的代表性例子，可提及的有LTR或SV40啟動(dòng)子，E.coli lac或trp啟動(dòng)子，λ噬菌體PL啟動(dòng)子和其它公知用于控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或者病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還含有一用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還可包括用于擴(kuò)增表達(dá)的合適的序列。
另外，表達(dá)載體優(yōu)選含有一個(gè)用于為選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞提供表型標(biāo)記的基因，如對(duì)于真核細(xì)胞培養(yǎng)為二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，而在E.coli中例如為四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
可采用含有如上所述合適DNA序列以及合適啟動(dòng)子或調(diào)控序列的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主以使宿主表達(dá)蛋白質(zhì)。
作為合適的宿主的例子，可以提及的有細(xì)菌細(xì)胞，如E.coli、鏈霉菌、鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅和Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物細(xì)胞等。選擇合適的宿主細(xì)胞被視為屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)而理解的范圍。
更具體地，本發(fā)明還包括重組構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含一或多種上述序列。該構(gòu)建體包括載體，如質(zhì)粒或病毒載體，在該載體中以正向或反向插入本發(fā)明的序列。在這一實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選方面，該構(gòu)建體還包括調(diào)節(jié)序列，包括例如，與所述序列連接的啟動(dòng)子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知大量的合適的載體和啟動(dòng)子，它們是可商購(gòu)的。以下舉出載體的例子，細(xì)菌的載體pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBs，pD10，phagescript，PsiX174，pBluescript SK，Pbsks，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)；pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核載體pWLNEO，pSV2cat，pOG44，pXT1，PSG(Stratagene)，pSVK3，PBPV，PMSG，PSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它質(zhì)粒或載體，只要其可在宿主中復(fù)制和生存即可。
啟動(dòng)子區(qū)可以使用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)的載體或其它帶有選擇性標(biāo)記的載體選自任何所需基因，兩個(gè)合適的載體是pKK232-8和pCM7。特別提到的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，lambda PR，PL和trp真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR，和鼠金屬硫蛋白-I。選擇合適的載體和啟動(dòng)子屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平范疇。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
可以用傳統(tǒng)的方式使用宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體以生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物?；蛘撸部赏ㄟ^(guò)常規(guī)的肽合成儀合成生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
在合適的啟動(dòng)子的控制下，可以在哺乳細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達(dá)成熟蛋白質(zhì)，也可采用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)使用由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體衍生的RNA生產(chǎn)這種蛋白質(zhì)。原核和真核宿主使用的合適的克隆和表達(dá)載體見(jiàn)Sambrook，et al，Molecular ClonningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，該書(shū)引入本文作參考。
高等真核生物對(duì)編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄可通過(guò)在載體中插入一增強(qiáng)子序列而得以增加，增強(qiáng)子是約10-300bp的順式作用的DNA因子，其作用于啟動(dòng)子以增加其轉(zhuǎn)錄。其例子包括位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)(100-270bp處)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子，以及腺病毒增強(qiáng)子。
通常，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)和允許宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記，如E.coli的氨芐青霉素抗性基因和釀酒酵母的TRP1基因，以及衍生于高表達(dá)基因的啟動(dòng)子以指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。這種啟動(dòng)子可以衍生于編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或熱休克蛋白的操縱子。在合適的階段，雜合結(jié)構(gòu)序列裝配上翻譯起始和終止序列，以及優(yōu)選地，裝配一能指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)入周質(zhì)空間或胞外培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列。任選地，雜合序列可以編碼一包括N-末端鑒別肽的融合蛋白質(zhì)，以賦予所需的特征，如表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定性和純化簡(jiǎn)便性。
用于細(xì)菌的表達(dá)載體的構(gòu)建是通過(guò)將編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列與合適的翻譯起始和終止信號(hào)一起插入帶有功能啟動(dòng)子的可操縱閱讀相而完成。載體包括一或多種表型選擇標(biāo)記及一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)以確證載體保持在宿主中，并且，如果需要，可以在宿主中擴(kuò)增。合適的用于轉(zhuǎn)化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏桿菌以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各菌種，當(dāng)然，也可采用其它菌。
作為代表性而非限制性的例子，有用的細(xì)菌表達(dá)載體可以包括衍生于包含熟知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳因子的商購(gòu)質(zhì)粒的選擇標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)，這些商購(gòu)質(zhì)粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacma Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。這些pBR322“骨架”部分與合適的啟動(dòng)子及待表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列結(jié)合。
轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株并將宿主菌株培養(yǎng)至合適的細(xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度改變或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選定的啟動(dòng)子，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間。
典型地，細(xì)胞由離心收集，用物理或化學(xué)方法破碎，保留得到的粗提物以進(jìn)一步純化。
用于表達(dá)蛋白質(zhì)的微生物細(xì)胞可用任何常規(guī)方法破碎，如凍-融循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破碎，或使用細(xì)胞裂解試劑。
也可使用各種哺乳細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系，以及其它能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK細(xì)胞系。哺乳類(lèi)表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)，合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，以及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5’旁側(cè)非轉(zhuǎn)錄序列?？墒褂迷醋許V40病毒基因組的DNA序列，例如SV40起點(diǎn)、早期啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接體和多腺苷酸化位點(diǎn)以提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳因子。
可通過(guò)硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陽(yáng)離子或陰離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析等方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化司登尼亞蛋白小體。優(yōu)選的是在純化過(guò)程中存在低濃度(約0.1-5mM)的鈣離子(Price，et al.，J.Biol.Chem.，244917(1969))。如果需要，可使用蛋白質(zhì)重折疊步驟以完成成熟蛋白的構(gòu)型，最后，可采用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行最后的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成過(guò)程的產(chǎn)物，或者通過(guò)重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，通過(guò)培養(yǎng)細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳類(lèi)細(xì)胞)而生產(chǎn)。根據(jù)在重組生產(chǎn)過(guò)程中采用的宿主，本發(fā)明的多肽可以用哺乳類(lèi)或其它真核類(lèi)的碳水化合物糖基化或是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可以包括一起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明中的多肽可以用于大量電解質(zhì)類(lèi)疾病的治療。動(dòng)脈高血壓的一個(gè)原因是由于Na-K泵缺乏或抑制造成的不正常的Na+穿過(guò)血管平滑細(xì)胞細(xì)胞壁的運(yùn)輸，另外一個(gè)原因是如同已經(jīng)在人的幾種形式的高血壓中描述的那樣的Na+通透性提高。最后的結(jié)果是細(xì)胞內(nèi)Na+提高，使細(xì)胞對(duì)血管收縮因子更加敏感。因?yàn)镃a++跟隨著Na+，推測(cè)正是由于細(xì)胞內(nèi)Ca++的積累而非本身Na+的積累引起交感神經(jīng)刺激敏感性增加。相應(yīng)地，因?yàn)樗镜悄醽喌鞍仔◇w可以發(fā)揮降血鈣因子的功能，所以它可以幫助降低這種增加的細(xì)胞內(nèi)Ca++，降低或防止高血壓。另外，高血鈣還與心率不齊，昏迷和心跳驟停有關(guān)。因此，司登尼亞蛋白小體可以通過(guò)降低自由鈣的濃度來(lái)發(fā)揮其對(duì)這類(lèi)紊亂的治療價(jià)值。
高血壓還直接與腎臟紊亂有關(guān)。相應(yīng)地，過(guò)高或過(guò)低的電解質(zhì)濃度可以引起腎臟功能失調(diào)，直接導(dǎo)致其它更為嚴(yán)重的紊亂。作為例子，鈣-磷失衡可以引起肌肉和骨骼疼痛，骨骼脫礦化作用和包括大腦、眼睛、心肌和血管的各種器官的鈣化。因此，本發(fā)明中的多肽可以用來(lái)緩解由于鈣-磷失衡引起的紊亂。腎臟功能失調(diào)導(dǎo)致血液中不正常的高濃度磷酸鹽，用本發(fā)明中的多肽可以將其降至正常濃度。
本發(fā)明中的多肽對(duì)某些骨骼疾病的治療也是很有用的。如，鈣濃度過(guò)高引起受影響的骨骼中纖維瘤的發(fā)育。
高血鈣的起因可能也是包括甲狀旁腺肥大癥，維生素D過(guò)多癥，通過(guò)破壞骨骼升高血清鈣濃度的腫瘤，肉樣瘤病，甲狀腺腫大，腎上腺機(jī)能不全，腎臟疾病引起的血清白蛋白下降，過(guò)量的GI鈣吸收和血漿蛋白濃度提高的大量不同的紊亂。因此，司登尼亞蛋白小體在降低高血鈣和其相關(guān)紊亂方面是有效的。
司登尼亞蛋白小體對(duì)與不正常電解質(zhì)濃度和體液失衡有關(guān)的其它紊亂的治療也是有用的，如偏頭痛。
根據(jù)本發(fā)明，此多肽也可以用于體內(nèi)表達(dá)，即經(jīng)常被稱(chēng)為“基因治療”的方法。
因此，例如，可用編碼來(lái)自體內(nèi)的多肽的多核苷酸(DNA或RNA)對(duì)患者的細(xì)胞進(jìn)行工程化，隨后將工程化的細(xì)胞再提供給需用多肽治療的患者，這些方法是本領(lǐng)域公知的。例如，可用含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒利用本領(lǐng)域熟知的程序?qū)?xì)胞進(jìn)行工程化。
類(lèi)似地，例如也可通過(guò)本領(lǐng)域公知的程序在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行工程化以在體內(nèi)表達(dá)多肽。如本領(lǐng)域所公知的，可將生產(chǎn)含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)者細(xì)胞給予患者以在體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞的工程化并在體內(nèi)表達(dá)多肽。通過(guò)這種方法給予本發(fā)明的多肽的這些和其它方法對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)是顯而易見(jiàn)的。例如，用于工程化細(xì)胞的表達(dá)載體可以不是反轉(zhuǎn)錄病毒，而是例如腺病毒，其在與合適的輸送載體結(jié)合后可用于在體內(nèi)工程化細(xì)胞。
本發(fā)明的多肽可以與合適的藥物載體結(jié)合應(yīng)用，這種組合物包括治療有效量的蛋白質(zhì)以及藥物學(xué)可接受的載體或賦形劑。這種載體包括但不限于鹽水、緩沖的鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其結(jié)合物。配制品應(yīng)適合給藥方式。
本發(fā)明還提供了一種藥物包裝盒或試劑盒，其包括一或多個(gè)填充有一或多種本發(fā)明的藥物組合物成分的容器。與這種容器在一起的還有由控制藥品或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售的政府機(jī)構(gòu)出具的通知，該通知反應(yīng)了該機(jī)構(gòu)許可其為人體用而生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售。另外，本發(fā)明的多肽可以與其它藥物化合物結(jié)合應(yīng)用。
此藥物組合物可能以諸如口腔的，靜脈的，腹膜內(nèi)的，肌肉的，皮下的，鼻內(nèi)的，或皮內(nèi)途徑的傳統(tǒng)方式給藥。對(duì)治療主體的給藥量和劑量依賴(lài)于諸如給藥方式，被治療病情的性質(zhì)，被治療主體的體重和開(kāi)藥方醫(yī)生的診斷等的大量因素。一般來(lái)說(shuō)，例如，藥物有效劑量最低為大約每天每千克體重0.1毫克，大多數(shù)情況下給藥量不超過(guò)每天每千克體重約10.0毫克，最佳給藥劑量為每天每千克體重約0.1毫克至1.0毫克，幾天后，考慮給藥途徑、癥狀等。
本發(fā)明的序列還可用于染色體鑒定，該序列特異地定向于個(gè)別的人染色體的特定位置并可與之雜交。另外，目前需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)，而現(xiàn)在只有很少幾種基于實(shí)際序列資料(重復(fù)多態(tài)性)的染色體標(biāo)記試劑可以商購(gòu)用于標(biāo)記染色體位置。本發(fā)明的將DNA定位于染色體是將這些序列與相關(guān)疾病的基因聯(lián)系起來(lái)的非常重要的第一步。
簡(jiǎn)而言之，可通過(guò)從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)而將序列定位在染色體上。使用cDNA的計(jì)算機(jī)分析快速選擇長(zhǎng)度不超過(guò)基因組DNA的一個(gè)外顯子并因而不會(huì)使擴(kuò)增復(fù)雜化的引物，隨后使用這些引物對(duì)含有個(gè)別的人染色體的體細(xì)胞雜合子進(jìn)行PCR篩選。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合子能得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
體細(xì)胞雜合子的PCR作圖是將特定DNA定位于特定染色體的一個(gè)快速程序。采用本發(fā)明相同的寡核苷酸引物，可以類(lèi)似的方式將來(lái)自特定染色體的一組片段或大基因組克隆的集合體進(jìn)行亞定位。其它的可類(lèi)似用于染色體作圖的作圖策略包括原位雜交、用標(biāo)記的流選的染色體進(jìn)行的預(yù)篩選，以及通過(guò)雜交預(yù)選以構(gòu)建染色體-特異cDNA文庫(kù)。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可以用來(lái)提供精確的一步法染色體定位。這一技術(shù)可使用短至500或600個(gè)堿基cDNA；然而，大于2000bp的克隆更易于與獨(dú)特的染色體位置結(jié)合以具有足夠的信號(hào)強(qiáng)度便于檢測(cè)。FISH需要使用衍生EST的克隆，越長(zhǎng)越好。例如，2000bp是好的，更好為4000bp，而超過(guò)4000則可能不是獲得好結(jié)果所必須的，因其時(shí)間百分比不合理。此技術(shù)的綜述見(jiàn)Verma et al.，HumanChromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精確定位于染色體某一位置，則可比較該序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜資料的關(guān)系，這種資料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance inMan中發(fā)現(xiàn)(可在線從Johns Hopkins University Welch Medical Library獲得)。隨后可通過(guò)連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳性)鑒別基因與已定位于相同染色體區(qū)的疾病之間的關(guān)系。
接著，必須確定感染個(gè)體和未感染個(gè)體之間的cDNA或基因組序列的差異，如果在一些或所有感染個(gè)體中觀察到某一突變而未在任何正常個(gè)體中觀察到這種突變，則該突變可能是該疾病的致病原。
應(yīng)用目前的物理作圖和遺傳作圖技術(shù)的分辨率，一種精確定位于與疾病有關(guān)的染色體區(qū)的cDNA可以是50-500個(gè)潛在的致病基因中的一個(gè)(這假定作圖分辨率為1兆堿基，并且每20kb為一個(gè)基因)。
感染個(gè)體和未感染個(gè)體的比較通常是首先尋找染色體的結(jié)構(gòu)改變，如可從染色體涂片上觀察到的或者用基于該cDNA序列的PCR檢測(cè)到的缺失或易位。最后，需要對(duì)來(lái)自一些個(gè)體的基因進(jìn)行全測(cè)序以證實(shí)存在突變并從多態(tài)性中區(qū)分突變。
本發(fā)明還涉及用反義技術(shù)體內(nèi)抑制司登尼亞蛋白小體，反義技術(shù)通過(guò)三螺旋形成或反義DNA或RNA可用于控制基因表達(dá)，這兩種方法均基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，用編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列的5’編碼區(qū)設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為10-40bp的反義RNA寡核苷酸。設(shè)計(jì)一DNA寡核苷酸以互補(bǔ)子轉(zhuǎn)錄涉及的基因的某區(qū)域(三螺旋-見(jiàn)Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al，Science，241456(1988)；andDervan et al，Science，2511360(1991))，從而阻止司登尼亞蛋白小體的轉(zhuǎn)錄和生產(chǎn)。
反義RNA寡核苷酸與mRNA體內(nèi)雜交并阻斷mRNA分子翻譯成司登尼亞蛋白小體(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as AntisenseInhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。
或者，上述寡核苷酸可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的程序輸送到細(xì)胞，從而反義RNA或DNA可以體內(nèi)表達(dá)以通過(guò)上述方式抑制司登尼亞蛋白小體的生產(chǎn)。
相應(yīng)地，司登尼亞蛋白小體的反義構(gòu)建體可以被用來(lái)失活司登尼亞蛋白小體，阻止其降低血鈣的作用，達(dá)到治療低血鈣癥的目的。由于鈣水平低下造成的以細(xì)弱易碎骨骼為特征的骨質(zhì)疏松病，可以用上述的反義結(jié)構(gòu)體治療。這些反義構(gòu)建體可以用相似的方式治療Paget氏病。
本發(fā)明的多肽、其片段或其它衍生物、或其類(lèi)似物、或表達(dá)其的細(xì)胞可用作免疫原生產(chǎn)抗體，這些抗體可以是例如多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合抗體、CDR嫁接的單鏈抗體和人源化抗體，以及Fab片段，或者Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。可使用現(xiàn)有技術(shù)中公知的各種程序生產(chǎn)這些抗體和片段。
抗對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的序列的多肽或其體內(nèi)受體的抗體可以通過(guò)將多肽直接注射給動(dòng)物或?qū)⒍嚯慕o予動(dòng)物、優(yōu)選非人而獲得，如此獲得的抗體隨后與多肽本身結(jié)合。以這種方式，僅編碼多肽的一個(gè)片段的序列也可用于生產(chǎn)與完整天然多肽結(jié)合的抗體，這種抗體隨后可用于從表達(dá)該多肽的組織中分離該多肽。為制備單克隆抗體，可使用任何提供由連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)物生產(chǎn)的抗體的技術(shù)，例如雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein，1975，Nature，256495-497)，三瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(kozbor et al.，1983，ImmunologyToday 472)，以及生產(chǎn)人單克隆多肽的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，et al.，1985，inMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(USP4.946,778)可以用來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。
抗本發(fā)明的多肽的抗體可以進(jìn)一步用來(lái)抑制此多肽的正常功能。以這種方式，這些抗體可以通過(guò)其阻止司登尼亞鈣蛋白的降血鈣功能而用作抗低血鈣因子?？梢杂眠@些抗體治療的疾病是骨質(zhì)疏松。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽的拮抗劑/抑制劑，該拮抗劑/抑制劑抑制或消除該多肽的功能。
因此，例如，拮抗劑與本發(fā)明的多肽結(jié)合并抑制或消除其功能，拮抗劑例如可以是與多肽結(jié)合的抗體，或在某些情況下是寡核苷酸。抑制劑的一個(gè)例子是與多肽結(jié)合并占據(jù)多肽的催化位點(diǎn)的小分子從而使催化位點(diǎn)不能與底物接觸，進(jìn)而防止正常的生物學(xué)活性，這些小分子的例子包括但不限于小肽或類(lèi)肽分子。
或者，可以采用與受體(本發(fā)明的多肽正常與該受體結(jié)合)結(jié)合的本發(fā)明的多肽的拮抗劑，該拮抗劑可以是與天然蛋白緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)以便它們識(shí)別并結(jié)合于天然蛋白質(zhì)的受體位點(diǎn)，但它們是天然蛋白質(zhì)的無(wú)活性形式并由此因?yàn)槭荏w位點(diǎn)被占據(jù)而阻止司登尼亞蛋白小體的作用。以這種方式，司登尼亞蛋白小體的作用被阻止，拮抗劑/抑制劑還可用作抗低血鈣因子治療類(lèi)似骨質(zhì)疏松這類(lèi)需要提高鈣水平的紊亂。
拮抗劑/抑制劑可與例如上述的藥物學(xué)可接受載體形成組合物而應(yīng)用。
以下將參照實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是應(yīng)理解的是，本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。除非另有說(shuō)明，所有的份或量均為重量份或重量。
為促進(jìn)對(duì)下述實(shí)施例的理解，以下將描述常用的方法和/或術(shù)語(yǔ)。
“質(zhì)?！钡拿菍⑿?xiě)字母p置于前面和/或后跟大寫(xiě)字母和/或數(shù)字。本文的起始質(zhì)?；蛘呤巧藤?gòu)得到的，或者是公眾可以不受限制地得到的，或者可以根據(jù)公布的程序由可得到的質(zhì)粒構(gòu)建的。另外，與所述的這些等效的質(zhì)粒是本領(lǐng)域公知的，并對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
DNA的“消化”是指用僅作用于DNA的特定序列的限制性酶對(duì)DNA的催化裂解。本文所用的各種限制性酶是可商購(gòu)的，其反應(yīng)條件、輔因子和其它要求對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的。為分析目的，典型地，1μg質(zhì)?；駾NA片段使用約2單位的酶，反應(yīng)體積為20μl緩沖液；為分離DNA片段用于構(gòu)建質(zhì)粒的目的，典型地，在較大體積中用20-250單位酶消化5-50μg DNA。對(duì)特定限制性酶的合適的緩沖液和底物由廠商提供。通常使用37℃ 1小時(shí)的溫育時(shí)間，但可根據(jù)供應(yīng)商的指示而變化。消化后，將反應(yīng)物直接在聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離所需片段。
裂解片段的大小分離是根據(jù)Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，84057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行。
“寡核苷酸”是指可化學(xué)合成的單鏈聚脫氧核苷酸或兩個(gè)互補(bǔ)的聚脫氧核苷酸鏈。這種合成的寡核苷酸沒(méi)有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸則不能與另一寡核苷酸連接。合成的寡核苷酸將與沒(méi)有經(jīng)過(guò)脫磷酸化的片段連接。
“連接”是指在兩個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過(guò)程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p.146)。除非另有說(shuō)明，連接可以采用公知的緩沖液，在每0.5μg約等摩爾的待連接DNA片段使用10單位T4 DNA連接酶(“連接酶”)的條件下進(jìn)行。
除非另有說(shuō)明，使用Graham，F(xiàn).and Van der Eb.A.，Virology，52456-457(1973)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例1司登尼亞蛋白小體的細(xì)菌表達(dá)和純化編碼司登尼亞蛋白小體的DNA(ATCC#75652)首先用與司登尼亞蛋白小體的5’和3’端序列對(duì)應(yīng)的，在5’和3’端分別加上Sph I和Bgl II酶切位點(diǎn)附加序列的PCR寡聚核苷酸引物擴(kuò)增。5’寡聚核苷酸引物的序列為5’-GACTGCATGCTCCAAAACTCAGCAGTG-3’，其中含有一個(gè)SphI限制酶位點(diǎn)(GCATGC)和開(kāi)始于起始密碼子的21個(gè)核苷酸的司登尼亞蛋白小體的編碼序列；3’端引物序列3’-GACTAGATCTTGCACTCTCATGGGATGTGCG-5’含有Bgl II限制性位點(diǎn)(AGATCT)的互補(bǔ)序列和司登尼亞蛋白小體編碼序列最后的21個(gè)核苷酸。此限制酶位點(diǎn)與細(xì)菌表達(dá)載體pQE70上的限制酶位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)(Qiagen，Inc.9259Eton Ave.，Chatsworth，CA 91311)。pQE70編碼抗生素抗性(Ampr)，一個(gè)細(xì)菌性復(fù)制起始點(diǎn)(ori)，一個(gè)IPTG可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子操縱子(P/O)，一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，一個(gè)6-His標(biāo)記和限制酶位點(diǎn)。pQE70用Sph I和Bgl II限制酶消化。擴(kuò)增序列連接到pQE70中且插入帶編碼組氨酸標(biāo)記和RBS序列的框架中。然后，用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli菌株M15/rep4，商標(biāo)為M15/rep4的菌株可以從Qiagen公司得到。M15/rep4含有質(zhì)粒pREP4的多個(gè)拷貝，pREP4表達(dá)lacI阻遏物和帶有卡那霉素抗性(Kanr)。通過(guò)其在LB板上的生長(zhǎng)能力來(lái)鑒定轉(zhuǎn)化子，選擇有青霉素/卡那霉素抗性的菌落。分離質(zhì)粒DNA，并用限制酶分析予以確認(rèn)。含有所需結(jié)構(gòu)體的克隆在加有Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜(O/N)。過(guò)夜培養(yǎng)物以1∶100到1∶250的稀釋倍數(shù)用于大規(guī)模培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)到光密度O.D.600為0.4到0.6之間。然后，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至終濃度為1mM。IPTG通過(guò)使lacI阻遏物失活，清除P/O來(lái)誘導(dǎo)增加基因表達(dá)。細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)3到4小時(shí)。然后離心(6000×g，20分鐘)收獲細(xì)胞。細(xì)胞沉淀物溶于6克分子的鳥(niǎo)苷-鹽酸試劑中。澄清后，從此溶液中用鎳-螯合柱層析純化溶解的司登尼亞鈣蛋白，條件是能夠使含6-His標(biāo)記的蛋白與柱結(jié)合緊密。(Hochuli，E.et al.，Genetic Engineering，Principles & Methods，1287-98(1990)。從鹽酸胍(GnHCl)中復(fù)性蛋白可以通過(guò)幾種方法完成。(Jaenicke，R.and Rudolph，R.，Protein Structure-A PracticalApproach，IRL Press，New York(1990)。開(kāi)始，透析步驟用于清除GnHCl。或者是，從鎳-螯合柱上分離出來(lái)的純化蛋白可以結(jié)合到GnHCl以線性梯度下降的第二個(gè)層析柱上。當(dāng)?shù)鞍捉Y(jié)合到層析柱上并用含250mM咪唑，150mM NaCl，25mM Tris-Hcl pH 7.5和10％甘油的緩沖液洗脫時(shí)，蛋白質(zhì)被復(fù)性。最后，可溶性蛋白對(duì)含5mM碳酸氫銨的儲(chǔ)存緩沖液透析。純化的蛋白用SDS-PAGE分析。見(jiàn)圖3。
根據(jù)以上的教導(dǎo)，對(duì)本發(fā)明作出各種改進(jìn)和變動(dòng)是可能的，因此，在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以不同于所述的方式實(shí)施。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人OLSEN，等(ii)發(fā)明名稱(chēng)司登尼亞蛋白小體-司登尼亞鈣蛋白(iii)序列數(shù)2(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART& OLSTEIN(B)街道6BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西州(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編07068(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類(lèi)型3.5寸軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?8/208,005(B)申請(qǐng)日1994年3月8日(C)分類(lèi)(v)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(vi)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)注冊(cè)號(hào)36,134(C)案號(hào)/文檔號(hào)325800-139(viii)通訊信息
(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744
(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度771堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GAAACTTCTC AGAGAATGCT CCAAAACTCA GCAGTGCTTC TGGTGCTGGT GATCAGTGCT 60TCTGCAACCC ATGAGGCGGA GCAGAATGAC TCTGTGAGCC CCAGGAAATC CCGAGTGGCG120GCCCAAAACT CAGCTGAAGT GGTTCGTTGC CTCAACAGTG CTCTACAGGT CGGCTGCGGG180GCTTTTGCAT GCCTGGAAAA CTCCACCTGT GACACAGATG GGATGTATGA CATCTGTAAA240TCCTTCTTGT ACAGCGCTGC TAAATTTGAC ACTCAGGGAA AAGCATTCGT CAAAGAGAGC300TTAAAATGcA TCGCCAACGG GGTCACCTCC AAGGTCTTCC TCGCCATTCG GAGGTGCTCC360ACTTTCCAAA GGATGATTGC TGAGGTGCAG GAAGAGTGCT ACAGCAAGCT GAATGTGTGC420AGCATCGCCA AGCGGAACCC TGAAGCCATC ACTGAGGTCG TCCAGCTGCC CAATCACTTC480TCCAACAGAT ACTATAACAG ACTTGTCCGA AGCCTGCTGG AATGTGATGA AGACACAGTC540AGCACAATCA GAGACAGCCT GATGGAGAAA ATTGGGCCTA ACATGGCCAG CCTCTTCCAC600ATCCTGCAGA CAGACCACTG TGCCCAAACA CACCCACGAG CTGACTTCAA CAGGAGACGC660ACCAATGAGC CGCAGAAGCT GAAAGTCCTC CTCAGGAACC TCCGAGGTGA GGAGGACTCT720CCCTCCCACA TCAAACGCAC ATCCCATGAG AGTGCATAAC CAGGGAGAGG T 771(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度247個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2
Met Leu Gln Asn Ser Ala Val Leu Leu Val Leu Val Ile Ser Ala-30 -25 -20Ser Ala Thr His Glu Ala Glu Gln Asn Asp Ser Val Ser Pro Arg-15 -10 -5Lys Ser Arg Val Ala Ala Gln Asn Ser Ala Glu Val Val Arg Cys15 10Leu Asn Ser Ala Leu Gln Val Gly Cys Gly Ala Phe Ala Cys Leu15 20 25Glu Asn Ser Thr Cys Asp Thr Asp Gly Met Tyr Asp Ile Cys Lys30 35 40Ser Phe Leu Tyr Ser Ala Ala Lys Phe Asp Thr Gln Gly Lys Ala45 50 55Phe Val Lys Glu Ser Leu Lys Cys Ile Ala Asn Gly Val Thr Ser60 65 70Lys Val Phe Leu Ala Ile Arg Arg Cys Ser Thr Phe Gln Arg Met75 80 85Ile Ala Glu Val Gln Glu Glu Cys Tyr Ser Lys Leu Asn Val Cys90 95 100Ser Ile Ala Lys Arg Asn Pro Glu Ala Ile Thr Glu Val Val Gln105 110 115Leu Pro Asn His Phe Ser Asn Arg Tyr Tyr Asn Arg Leu Val Arg120 125 130Ser Leu Leu Glu Cys Asp Glu Asp Thr Val Ser Thr Ile Arg Asp135 140 145Ser Leu Met Glu Lys Ile Gly Pro Asn Met Ala Ser Leu Phe His150 155 160Ile Leu Gln Thr Asp His Cys Ala Gln Thr His Pro Arg Ala Asp165 170 175He Asn Arg Arg Arg Thr Asn Glu Pro Gln Lys Leu Lys Val Leu180 185 190Leu Arg Asn Leu Arg Gly Glu Glu Asp Ser Pro Ser His Ile Lys195 200 205Arg Thr Ser His Glu Ser Ala210
權(quán)利要求
1.一種分離的抗體或其片段，其特異性結(jié)合具有由SEQ ID NO2的第33至247位氨基酸組成的氨基酸序列的蛋白。
2.一種分離的抗體或其片段，其特異性結(jié)合自細(xì)胞培養(yǎng)物中純化的司登尼亞鈣蛋白，其中所述的司登尼亞鈣蛋白由編碼SEQ ID NO2的第1至247位氨基酸的多核苷酸所編碼。
3.一種分離的單克隆抗體或其片段，其特異性結(jié)合具有由SEQ ID NO2的第33至247位氨基酸組成的氨基酸序列的蛋白。
4.一種分離的單克隆抗體或其片段，其特異性結(jié)合自細(xì)胞培養(yǎng)物中純化的司登尼亞鈣蛋白，其中所述的司登尼亞鈣蛋白由編碼SEQ ID NO2的第1至247位氨基酸的多核苷酸所編碼。
5.一種分離的人類(lèi)抗體或其片段，其特異性結(jié)合具有由SEQ ID NO2的第33至247位氨基酸組成的氨基酸序列的蛋白。
6.一種分離的人類(lèi)抗體或其片段，其特異性結(jié)合自細(xì)胞培養(yǎng)物中純化的司登尼亞鈣蛋白，其中所述的司登尼亞鈣蛋白由編碼SEQ ID NO2的第1至247位氨基酸的多核苷酸所編碼。
7.一種分離的嵌合型抗體或其片段，其特異性結(jié)合具有由SEQ ID NO2的第33至247位氨基酸組成的氨基酸序列的蛋白。
8.一種分離的嵌合型抗體或其片段，其特異性結(jié)合自細(xì)胞培養(yǎng)物中純化的司登尼亞鈣蛋白，其中所述的司登尼亞鈣蛋白由編碼SEQ ID NO2的第1至247位氨基酸的多核苷酸所編碼。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的抗體或其片段，其是一種拮抗抗體。
10.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的抗體或其片段，其是一種Fab片段。
11.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的抗體或其片段，其中所述蛋白是糖基化的。
12.權(quán)利要求7或8的抗體或其片段，其是人源化的抗體或其片段。
13.一種生產(chǎn)特異性結(jié)合具有由SEQ ID NO2的第33至247位氨基酸組成的氨基酸序列的蛋白的抗體的方法，其包括(a)將該蛋白引入一種動(dòng)物；(b)并回收該抗體。
14.一種生產(chǎn)特異性結(jié)合具有由SEQ ID NO2的第33至247位氨基酸組成的氨基酸序列的蛋白的抗體的方法，其包括(a)用該蛋白對(duì)一單鏈文庫(kù)或Fab表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選(b)并回收該抗體。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中所述抗體是一種單克隆抗體、嵌合型抗體、人源化抗體或人類(lèi)抗體、或Fab片段。
16.由權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)的方法所產(chǎn)生的抗體。
17.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的抗體或其片段在制備用于治療需要升高血鈣水平的患者的藥物中的用途。
18.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的抗體或其片段在制備用于治療低鈣血癥的藥物中的用途。
19.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的抗體或其片段在制備用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物中的用途。
20.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的抗體或其片段在制備用于治療Paget’s病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明披露了人司登尼亞小體－司登尼亞鈣蛋白多肽和編碼此多肽的DNA(RNA)。本發(fā)明還提供用重組技術(shù)生產(chǎn)此多肽的程序和生產(chǎn)此多肽的抗體和拮抗劑/抑制劑的程序。本發(fā)明的另一方面是提供此多肽和一個(gè)合適的藥物載體的結(jié)合物以用于疾病的治療和需要抑制此多肽的疾病的治療。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1560080SQ200410002718
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期1994年5月9日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月8日
發(fā)明者亨里克·奧森, 亨里克 奧森, D 亞當(dāng)斯, 馬克·D·亞當(dāng)斯 申請(qǐng)人:人體基因組科學(xué)有限公司