專利名稱：交聯(lián)葡萄糖異構(gòu)酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于通過使結(jié)晶酶交聯(lián)而生成的新的水不溶的葡萄糖異構(gòu)酶。本發(fā)明還涉及制備該水不溶的交聯(lián)葡萄糖異構(gòu)酶的方法。
在連續(xù)運(yùn)行的反應(yīng)器中應(yīng)用固定不動(dòng)的酶(即連結(jié)在固體載體上的酶)是日益優(yōu)先選用的技術(shù)，因?yàn)檫@種技術(shù)可以降低酶的費(fèi)用和最終產(chǎn)物的純化費(fèi)用。用固定的葡萄糖異構(gòu)酶使葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖是常用的方法。
一般來講，酶是水溶性的，因此在連續(xù)操作中有必要采用固定技術(shù)。必須采用一種能使酶不溶于水相，同時(shí)又能保持其活性的方法使酶結(jié)合在一固相上。已提出許多使酶與固體載體結(jié)合的方法，其中有將酶吸附、共價(jià)連接、交聯(lián)或微膠囊化。另外一種方法是，使產(chǎn)生酶的整個(gè)微生物結(jié)合到固相上。對(duì)于上述技術(shù)，在例如Mooo-young，M.(ed)，ComprehensiveBiotechnology，2，Pe-rgamonpress，倫敦1985，p.191-211中，有很好的綜述。
在以前的方法中，是使酶結(jié)合到另外制備的載體材料上，這樣做對(duì)于底物的化學(xué)動(dòng)力學(xué)或流動(dòng)也許是有益的。但是，在大多數(shù)情況下，尤其在大規(guī)模生產(chǎn)(例如在制糖工業(yè))中，載體材料比作為催化劑的酶更貴。另一個(gè)方法是，可以使酶與惰性成分(例如凝膠)交聯(lián)而將其固定?？傊?，在現(xiàn)有技術(shù)中作為催化劑的酶只構(gòu)成所用材料重量和體積的一小部分，在各個(gè)具體方法中一般只占5%以下，通常為1-2%。
從技術(shù)上講，用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)對(duì)于例如葡萄糖異構(gòu)酶的固定具有重要的意義。已知美國食品醫(yī)藥管理局(FDA)已認(rèn)可戊二醛在食品工業(yè)中可用于固定酶。
其它已經(jīng)應(yīng)用的技術(shù)還有使酶與離子交換劑相連和把酶吸附在固體載體上。在美國專利4，699，882(K.Visuri;穩(wěn)定的葡萄糖異構(gòu)酶)中可以找到應(yīng)用上述方法的實(shí)例。然而，在這一現(xiàn)有技術(shù)方法中應(yīng)用的載體比較昂貴，并且該技術(shù)還需使用一種大反應(yīng)器。
工業(yè)上應(yīng)用固定酶技術(shù)所需的費(fèi)用不一定與所應(yīng)用的酶有關(guān)系。這些費(fèi)用包括制造工藝設(shè)備和建造廠房的費(fèi)用;載體材料添置(再添置)費(fèi)用，失活酶材料的處理費(fèi)用;排空和裝填反應(yīng)器(或載體再生)的勞務(wù)費(fèi)用;由于反應(yīng)器遲鈍所需的附加費(fèi)用。長(zhǎng)期操作時(shí)常會(huì)出現(xiàn)非酶作用的不利副反應(yīng)，尤其是在果糖生產(chǎn)中。
上述科技文獻(xiàn)中有幾個(gè)用戊二醛來交聯(lián)結(jié)晶酶的實(shí)例。在這些研究中，為了基礎(chǔ)研究目的而對(duì)酶結(jié)晶進(jìn)行了交聯(lián)。酶結(jié)晶的結(jié)構(gòu)通常是很弱的，以至于在X射線衍射研究中它們不能經(jīng)受住所應(yīng)用的射線束;然而使用戊二醛卻?？梢允菇Y(jié)晶酶穩(wěn)定，從而能夠用于X射線衍射研究。此外，還為研究結(jié)晶酶的穩(wěn)定性和催化劑動(dòng)力學(xué)特性而對(duì)結(jié)晶酶進(jìn)行了交聯(lián)。在結(jié)晶交聯(lián)成功的情況下，只應(yīng)用了戊二醛，而介質(zhì)是由一種溶液構(gòu)成，在該溶液中各個(gè)特定的酶能保持結(jié)晶形式?，F(xiàn)在看來，通過戊二醛與酶蛋白反應(yīng)，可以直接生成一種不溶的結(jié)晶。Quiocho和Richards(Proc.Natl.Acad.Sci(美國)52(1964)p.833和Biochemistry5(1966)p.4062)首先將戊二醛用來交聯(lián)羧基肽酶。Bishop和Richards(J.Mol.Biol.33(1968)，p.415～421)用1%戊二醛水溶液于室溫下對(duì)結(jié)晶狀β-乳球蛋白進(jìn)行了交聯(lián)。應(yīng)用所得結(jié)晶研究了酶的電學(xué)性質(zhì)。Heas(Biophysic.Journ.8(1968)，p.549-555)應(yīng)用12%的戊二醛溶液在4%硝酸鈉溶液(PH8)存在下對(duì)浴菌酶結(jié)晶進(jìn)行了交聯(lián)。
Dyer、Phillips和Townsend(ThermochimicaActa8(1974)，p.456～464)研究了用戊二醛交聯(lián)的羧基肽酶結(jié)晶的熱穩(wěn)定性。Dyer等人發(fā)現(xiàn)，交聯(lián)使穩(wěn)定性增加。Tuechsen和Ottesen(CarlsbergRes.Commun42(1977)，p.407-420)研究了在硫酸鈉溶液中用戊二醛交聯(lián)的枯草溶菌素結(jié)晶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。對(duì)映低分子量的底物，該結(jié)晶的活性強(qiáng)，而對(duì)于高分子量的底物(如蛋白質(zhì)或多肽，它們不能擴(kuò)散到結(jié)晶中)，結(jié)晶的活性是不顯著的。
Wong等(Biochem.andBiophysic.ResearchCommunications80(1978)，p.886-890)在硫酸銨溶液中用戊二醛對(duì)源于微生物的酸性蛋白酶進(jìn)行了交聯(lián)。在交聯(lián)中，硫酸銨的存在被認(rèn)為是技術(shù)上的缺點(diǎn)。
Morozov和Morozova(Biopolymers20(1981)，p.451-467)應(yīng)用2-6%戊二醛溶液，反應(yīng)時(shí)間2-10天，于室溫下對(duì)溶菌酶結(jié)晶、血紅蛋白結(jié)晶和肌紅蛋白結(jié)晶進(jìn)行了交聯(lián)。在2-甲基-2，4-戊二醇(25%)存在下，Lee等(BioorganicChemistry14(1986)，p.202-210)用戊二醛對(duì)醇脫氫酶結(jié)晶進(jìn)行了交聯(lián)。
已知用戊二醛得到不溶的酶是困難的，尤其是如果蛋白質(zhì)含有的賴氨酸較少時(shí)則更困難。對(duì)此問題通常作這樣的處理在酶中混入一種蛋白質(zhì)(例如白蛋白)，它可以交聯(lián)產(chǎn)生一種不溶物(G.B.Broun，MethodsinEnzymology，44(1976)，p.263)。但是當(dāng)需要交聯(lián)的酶為晶狀體時(shí)，加入上述無關(guān)的惰性蛋白質(zhì)是不可能的。對(duì)于僅用戊二醛無法使結(jié)晶體交聯(lián)成為不溶物的情況，目前還沒有交聯(lián)方法。
如以上所提到的，已知可用戊二醛固定葡萄糖異構(gòu)酶。這樣可以將異構(gòu)酶交聯(lián)到載體材料上。該方法在工業(yè)上已得到廣泛應(yīng)用。在該文獻(xiàn)中未曾敘述使葡萄糖異構(gòu)酶結(jié)晶交聯(lián)成為不溶形式的嘗試。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可以將葡萄糖異構(gòu)酶結(jié)晶交聯(lián)，并使其保持原來的結(jié)晶狀態(tài)而酶的活性仍然很高;最好的操作方法可以使交聯(lián)產(chǎn)物保持同原來的酶一樣的活性。本發(fā)明的產(chǎn)物不溶于任何應(yīng)用酶技術(shù)時(shí)可能存在的溶劑中。在工業(yè)異構(gòu)化方法中，可以用交聯(lián)的結(jié)晶酶直接裝填異構(gòu)化柱。應(yīng)用新的交聯(lián)的結(jié)晶可以在比以前所用的柱小得多、有效得多的柱中進(jìn)行連續(xù)的異構(gòu)化處理。熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員明白，本發(fā)明可以應(yīng)用填充有純的酶而不是與惰性材料結(jié)合的酶的柱子，該惰性材料經(jīng)常占據(jù)了柱子大部分空間并且其費(fèi)用占柱子費(fèi)用的一大部分。
在本發(fā)明的方法中，用二醛(例如戊二醛)和至少含一個(gè)氨基的化合物(例如銨化合物、胺或氨基酸，最好用銨鹽或賴氨酸)使葡萄糖異構(gòu)酶結(jié)晶交聯(lián)。有幾種胺和氨基酸是適用的。同樣明顯的是，在本發(fā)明的方法中，除了戊二醛之外，也可以應(yīng)用許多其它的二醛和與氨基反應(yīng)的物質(zhì)(稱為交聯(lián)劑)。
用本發(fā)明方法制得的固體狀結(jié)晶酶的活性是很高的，或者與游離酶的活性實(shí)際上是相同的。在連續(xù)的處理過程中，固體狀結(jié)晶酶可以用作柱填充劑。固體狀結(jié)晶酶很穩(wěn)定，并且能很好地耐受機(jī)械壓力。
如果需要，按已知的物理化學(xué)方法，還可以使交聯(lián)的結(jié)晶進(jìn)一步結(jié)合形成較大的本體，其形狀可以圓的、葉片狀的、帶狀的等。這樣得到的酶制品能夠經(jīng)得住機(jī)械的處理。
熟悉本領(lǐng)域的專業(yè)人員可以認(rèn)識(shí)到，按照本文所述的方法，實(shí)際上可以由迄今通常是由于其氨基酸成分而不適用于交聯(lián)的任何結(jié)晶酶來制成不溶的酶制品。
下面將更詳細(xì)地?cái)⑹霰景l(fā)明的方法。
用作起始有利的結(jié)晶狀葡萄糖異構(gòu)酶的制備將硫酸銨(約10%(重))溶于葡萄糖異構(gòu)酶溶液(按干燥蛋白質(zhì)測(cè)定，異構(gòu)酶占1～10%(重))中。在不斷攪拌下，將溶液慢慢冷卻至約1～2℃。異構(gòu)酶基本上完全結(jié)晶(大于95%)。可以用硫酸鎂或硫酸鈉代替硫酸銨作為結(jié)晶劑。所用鹽的濃度可以在寬范圍內(nèi)變化，例如可從5%到25%(重)。結(jié)晶過程所需的時(shí)間也可以在較寬的范圍內(nèi)變化，例如可從1小時(shí)到數(shù)天。制備大的結(jié)晶時(shí)，最好用逐漸冷卻的方法，并且異構(gòu)酶要盡可能純。美國專利4，699，882(Visuri敘述了該結(jié)晶過程，該專利收編在本申請(qǐng)中作為參考。
在結(jié)晶之后，用離心的方法或沉積法將結(jié)晶物質(zhì)從母液中分離出來。如果需要，用硫酸銨、硫酸鎂或其它適用于結(jié)晶作用的物質(zhì)的純?nèi)芤合礈旖Y(jié)晶物質(zhì)。對(duì)不含有任何游離的過量母液并且經(jīng)沉積和離心成為致密形式的結(jié)晶物質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)。該結(jié)晶物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)活性為10，000GIU/g。它含有20～30%(重)的純的酶蛋白質(zhì)(按干物質(zhì)計(jì)算)。應(yīng)該注意，如果將酶結(jié)晶干燥，酶結(jié)晶就會(huì)喪失其結(jié)構(gòu)。
交聯(lián)將結(jié)晶物質(zhì)懸浮在一種在其中該結(jié)晶其溶解的鹽溶液中。在該溶液中酶結(jié)晶的濃度可以在較寬的范圍內(nèi)變化，例如可以為2～17%(按干物質(zhì)計(jì))如果該鹽溶液在開始時(shí)不含有銨、合適的胺或氨基酸(例如賴氨酸)，則向該溶液中加入銨鹽。通過加入例如氫氧化鈉溶液，將混合物的PH值調(diào)節(jié)到5至9，最好調(diào)節(jié)到6至8。酸度用磷酸鹽緩沖液(例如0.05M磷酸鈉)控制，或用堿溶液(例如氫氧化鈉溶液)通過自動(dòng)PH調(diào)節(jié)來控制。加入的胺或氨基酸的濃度可以在較寬的范圍內(nèi)變化，并且取決于其它成分的濃度。在胺或氨基酸的濃度為最終混合物重量的1～15%時(shí)，已制得高產(chǎn)率的本發(fā)明產(chǎn)物。
隨后，將戊二醛加到混合物中以引發(fā)交聯(lián)反應(yīng)。戊二醛的量可以在較寬的范圍內(nèi)變化，可以為1～45%(按濕的酶結(jié)晶物質(zhì)計(jì)算)。較好的用量取決于例如混合物中所含的胺的濃度。一般來講，較好的濃度是每3g異構(gòu)酶(按干燥的酶計(jì)算)，用3～4.5g戊二醛。反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，要連續(xù)地?cái)嚢枞芤?溫度范圍是2～25℃。雖然溫度似乎不很關(guān)鍵，但低溫是有益的。反應(yīng)可以在幾分鐘內(nèi)很快地發(fā)生。在低溫下，反應(yīng)時(shí)間可以直到20小時(shí)。
在反應(yīng)之后，通過沉積或離心從混合物中分離出不溶的結(jié)晶。將結(jié)晶物質(zhì)懸浮在水或合適的鹽溶液中，并且再次離心，以此進(jìn)行洗滌。反復(fù)洗滌數(shù)次，直到結(jié)晶物質(zhì)足夠純而可用做催化劑。關(guān)于洗滌，最好將細(xì)粒狀沉淀沖去。
如果所得的結(jié)晶物質(zhì)是要作為酶過程中的催化劑使用，那么干燥該結(jié)晶物質(zhì)是不合適的。濕的結(jié)晶物質(zhì)可以充分地保持其活性至少6個(gè)月，而無需采取任何特殊措施。
最終產(chǎn)物的特征在外觀和大小方面，按本發(fā)明制得的交聯(lián)結(jié)晶同原有的原料結(jié)晶相似。結(jié)晶的大小不很關(guān)鍵。直徑為100～200μm或更大些(直至1mm)的結(jié)晶特別適合于工業(yè)應(yīng)用。
本發(fā)明的結(jié)晶最重要的性質(zhì)在于該結(jié)晶不溶于水、鹽溶液和糖溶液。本發(fā)明的異構(gòu)酶結(jié)晶不溶于濃的葡萄糖和果糖溶液，甚至在高溫時(shí)也不溶，這一點(diǎn)特別重要。在工業(yè)生產(chǎn)中，溫度通常采用60℃，而糖濃度為45%(按重量計(jì))。在上述條件下，以及在任何其它糖濃度和較高的溫度(直至100℃)下，交聯(lián)結(jié)晶均是不溶的。交聯(lián)結(jié)晶的活性與原有的酶的活性處于相同的等級(jí)。本發(fā)明結(jié)晶的活性比固定在惰性載體上的酶的活性高許多倍，這在技術(shù)上是有益和非常重要的。
把一種酶交聯(lián)化為結(jié)晶形式的另一優(yōu)點(diǎn)是，該結(jié)晶之內(nèi)的作用力以及自然地使該結(jié)晶保持結(jié)晶態(tài)的力，可以十分顯著地將該酶穩(wěn)定化。
表征起始原料和最終產(chǎn)物所用的方法異構(gòu)酶的活性規(guī)定為每1g干燥酶制品的國際葡萄糖異構(gòu)酶單位(簡(jiǎn)寫為GIU)數(shù)。1個(gè)單位(GIU)表示在下述條件下能以1μmol/分鐘的速率使葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楣堑拿傅牧科咸烟菨舛葹?.0mole/l，PH為7.0，溫度為60℃。
為了測(cè)定活性，將0.1～1g酶制品(原有的結(jié)晶物質(zhì)或充分洗滌的交聯(lián)結(jié)晶物質(zhì))混合到100ml如前面所述的底物溶液中。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(如10分鐘)后，測(cè)定溶液中果糖的含量，計(jì)算并以上述單位表示活性。選擇酶的用量和反應(yīng)時(shí)間，使生成的果糖少于總糖含量的5%，這是為了使測(cè)定結(jié)果反映反應(yīng)開始時(shí)的轉(zhuǎn)變速率。按常規(guī)方法，在105℃干燥樣品至恒重，以測(cè)定起始原料和產(chǎn)物的干含量。
異構(gòu)化工藝過程結(jié)晶狀交聯(lián)酶可以按常規(guī)方式用于間歇式異構(gòu)化過程，在反應(yīng)之后，用過的酶例如可以用過濾法分離出來，并且如果需要，還可重復(fù)使用。
不過，以工業(yè)規(guī)模進(jìn)行異構(gòu)化時(shí)，最好采用連續(xù)的異構(gòu)化工藝。在連續(xù)的異構(gòu)化工藝中，是使待異構(gòu)化的糖溶液流過酶柱。通過改變保留時(shí)間和/或溫度，異構(gòu)化過程容易控制。在較寬的溫度范圍內(nèi)，從冰點(diǎn)到超過100℃，酶都是有活性的。低溫下操作的缺點(diǎn)是反應(yīng)慢，并且糖(葡萄糖和果糖)水合物會(huì)結(jié)晶析出，而在高溫下，酶和果糖會(huì)相當(dāng)顯著地較快破壞。
連續(xù)異構(gòu)化一般是這樣進(jìn)行用100～300μm的交聯(lián)酶結(jié)晶裝柱。在各個(gè)具體情況下根據(jù)所需要的容量改變柱的孔徑和長(zhǎng)度。小柱的適宜填充物長(zhǎng)度為5～50cm。溫度也可以在較寬的范圍內(nèi)調(diào)整。室溫是非常可行的。如果微生物污染問題較嚴(yán)重，可以提高溫度到至少約60℃來消除污染。
通過改變線性流速，可以容易地控制異構(gòu)化過程。
小柱的線性流速范圍為2～30cm/分鐘。新鮮酶的合適保留時(shí)間為1～2分鐘。壓力為1大氣壓。壓降是不明顯的(每50cm長(zhǎng)度的柱填充物，壓降小于0.2巴)。保留時(shí)間可通過改變柱填充物長(zhǎng)度以及流速來調(diào)節(jié)。升高溫度可加速異構(gòu)化反應(yīng)。
在大部分情況下，常規(guī)工業(yè)化方法的目的是得到糖溶液，其中40～45%的糖是果糖。當(dāng)酶活性下降時(shí)柱隨之老化，此時(shí)減慢流速可保持所得糖溶液具有所需組成。
下列實(shí)例更詳細(xì)地闡明了本發(fā)明。
實(shí)例1稱取在10%硫酸銨溶液中結(jié)晶的葡萄糖異構(gòu)酶結(jié)晶物質(zhì)(如美國專利4，699，882所述)850g，并將其加到PH用0.5M磷酸鈉緩沖液調(diào)至7.4的1000ml硫酸鹽溶液中。將混合物冷卻至10℃。所得的混合物用螺旋槳式攪拌器以低速(200～400轉(zhuǎn)/分)連續(xù)攪拌，以減輕結(jié)晶的破壞。向混合物中加入160ml25%戊二醛等分溶液。1小時(shí)后將201純水加到混合物中使反應(yīng)中止。立即停止攪拌，用時(shí)2小時(shí)讓結(jié)晶物質(zhì)沉降于容器底部，傾出母液，注意不要沖出結(jié)晶。再次將201純水混合到結(jié)晶物質(zhì)中，然后傾出洗滌水。用水再次洗滌。所得到的用水洗滌過3次的異構(gòu)酶濕結(jié)晶物質(zhì)可直接用于異構(gòu)化試驗(yàn)、活性測(cè)定和其它實(shí)驗(yàn)。
所制得的交聯(lián)葡萄糖異構(gòu)酶呈結(jié)晶狀態(tài)(顯微鏡鑒別)。該結(jié)晶不溶于水、各種鹽的稀溶液(PH在2～9范圍內(nèi))、稀酸(1mol/l)、直至100℃的熱水和熱鹽溶液中，也不溶于直至100℃的濃葡萄糖、果糖和糖溶液中。在所有上述條件下，該結(jié)晶的外觀保持不變，而未交聯(lián)的結(jié)晶異構(gòu)酶溶解或以無定形沉淀形式析出。交聯(lián)異構(gòu)酶的酶活性是原有未交聯(lián)的異構(gòu)酶活性的52%，即當(dāng)原有異構(gòu)酶的活性為40，000GIU/g時(shí)，交聯(lián)結(jié)晶的活性相應(yīng)地為20，000GIU/g以上(按干燥的酶蛋白質(zhì)計(jì)算)。
實(shí)例2按照實(shí)例1的方法于25℃制備以下反應(yīng)混合物14g異構(gòu)酶(按純的酶蛋白質(zhì)計(jì)算)10g硫酸銨1.5g戊二醛(約8ml25%戊二醛溶液)0.05M磷酸鈉緩沖液(溶液PH為7.4)100ml水反應(yīng)1小時(shí)后，用實(shí)驗(yàn)室用離心分離機(jī)以1000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，將游離溶液從混合物中除去。把得到的結(jié)晶物質(zhì)懸浮于200ml純水中，并按上述方法再次離心。按上述方法再次用水洗滌?；厥战?jīng)洗滌的濕的結(jié)晶物質(zhì)，用于進(jìn)一步研究。該法制得的結(jié)晶物質(zhì)的活性是原結(jié)晶物質(zhì)活性的49%。
實(shí)例3～8按實(shí)例1的方法，于10℃制備具有與實(shí)例2所述相同初始組成的各反應(yīng)混合物。經(jīng)不同的反應(yīng)時(shí)間后，中止反應(yīng)并洗滌結(jié)晶物質(zhì)，然后測(cè)定各結(jié)晶物質(zhì)的活性，結(jié)果示于以下表Ⅰ中。
表Ⅰ實(shí)例反應(yīng)時(shí)間活性(表示為原來結(jié)晶物質(zhì)活性的百分比)實(shí)例310分鐘45實(shí)例430分鐘46實(shí)例560分鐘49實(shí)例690分鐘48實(shí)例72小時(shí)40實(shí)例83小時(shí)40從以上結(jié)果可見，反應(yīng)能很快完成。而反應(yīng)時(shí)間增加，活性沒有大的變化。
實(shí)例9～16按實(shí)例1的方法，于10℃制備具有以下初始組成的反應(yīng)混合物14g葡萄糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì)(結(jié)晶形式)10g硫酸銨90ml0.5M磷酸鈉溶液(如表Ⅱ所示，PH為6.0，7.0，8.0或8.4)0.12g、0.5g、2.0g、3.5g或4.12g戊二醛(如表Ⅱ所示)反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)。所得各結(jié)晶物質(zhì)的活性(表示為原來結(jié)晶物質(zhì)活性的百分?jǐn)?shù))列于表Ⅱ中。
表Ⅱ?qū)嵗齈H戊二醛(g)活性(%)實(shí)例96.00.522實(shí)例106.03.524實(shí)例117.00.1260實(shí)例127.02.065實(shí)例137.04.1259實(shí)例148.00.541實(shí)例158.03.544實(shí)例168.42.039從以上結(jié)果看來，戊二醛的量在相當(dāng)寬的范圍內(nèi)變化時(shí)，仍可得到較高的活性。酸度明顯地影響結(jié)果;雖然在試驗(yàn)的整個(gè)PH范圍內(nèi)，即PH6.0～8.4，都可以得到有效的制品，但是最佳的PH值為約7.0。
實(shí)例17～27按以上各實(shí)例進(jìn)行一系列相似的試驗(yàn)，但溫度為2℃，反應(yīng)時(shí)間為18小時(shí)。反應(yīng)混合物的組成如下3g異構(gòu)酶結(jié)晶(按干燥蛋白質(zhì)計(jì)算)50ml水(作為介質(zhì))7.5g鹽(硫酸鈉、硫酸鎂和/或硫酸銨，見表Ⅲ)
氫氧化鈉(用來調(diào)節(jié)PH至7.0，用量不大于2毫克當(dāng)量，即80mg)0.125～2.5g戊二醛(見表Ⅲ)表Ⅲ鹽(g)實(shí)例 (NH4)2SO4MgSO4Na2SO4戊二醛活性(%)實(shí)例177.50.50實(shí)例187.52.50實(shí)例197.50.1250實(shí)例207.50.50實(shí)例217.50.750實(shí)例227.51.250實(shí)例230.457.050.7520實(shí)例240.906.60.7519實(shí)例251.85.70.7528實(shí)例263.753.750.7540實(shí)例277.50.7560從以結(jié)果看來，在沒有銨鹽的情況下進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，得不到不溶的結(jié)晶，即使戊二醛濃度較高也得不到不溶結(jié)晶。即使只用少量的銨鹽，也可以促進(jìn)不溶結(jié)晶的形成。
實(shí)例28～38按以下一般方法，用不同的含氮化合物制備不溶的異構(gòu)酶結(jié)晶3g結(jié)晶狀異構(gòu)酶(按干蛋白質(zhì)計(jì)算)7.5g硫酸鎂10mmol含氮化合物(見表Ⅳ)2.5g戊二醛(按100%計(jì)算)溫度為2℃，反應(yīng)時(shí)間為18小時(shí)表Ⅳ實(shí)例含氮化合物用量(g)活性(%)實(shí)例28賴氨酸1.8380實(shí)例29精氨酸1.7417實(shí)例30組氨酸1.5526實(shí)例31谷氨酰氨1.4618實(shí)例32亮氨酸1.3121實(shí)例33異亮氨酸1.3118實(shí)例34脯氨酸1.1510實(shí)例35甲硫氨酸1.4927實(shí)例36苯丙氨酸1.6517實(shí)例37色氨酸2.0444實(shí)例38三甲銨乙內(nèi)酯1.1723
從以上結(jié)果看來，一些不同的胺對(duì)交聯(lián)過程具有相似的作用。
實(shí)例39～51按以下一般方案，用不同量的戊二醛和賴氨酸制備不溶的異構(gòu)酶結(jié)晶。
3g結(jié)晶狀異構(gòu)酶(按干燥蛋白質(zhì)計(jì)算)7.5g硫酸鎂0.47～2.34g賴氨酸(見表Ⅴ)用氫氧化鈉溶液將PH調(diào)至8.00.5～1.25g戊二醛(100%;見表Ⅴ)將溶液于2℃反應(yīng)18小時(shí)。
表Ⅴ實(shí)例戊二醛(g)賴氨酸(g)活性(%)實(shí)例390.50.4767實(shí)例400.50.9477實(shí)例410.51.4060實(shí)例420.750.4772實(shí)例430.750.9483實(shí)例440.751.4092實(shí)例450.751.8781實(shí)例460.752.3475實(shí)例471.250.4768實(shí)例481.250.9478實(shí)例491.251.4090實(shí)例501.251.87102實(shí)例511.252.34100從以上結(jié)果看來，賴氨酸和戊二醛用量之間的比率會(huì)影響不溶結(jié)晶的形成，也就是說，在各個(gè)戊二醛用量下，都有一個(gè)最佳的賴氨酸用量。
實(shí)例52～57按以下一般方案，在賴氨酸存在下，于硫酸銨溶液中使異構(gòu)酶結(jié)晶進(jìn)行交聯(lián)。
10g異構(gòu)酶結(jié)晶置于10%硫酸銨溶液中(即3.72g純的異構(gòu)酶蛋白質(zhì)(按干燥物質(zhì)計(jì)算)，0.63g硫酸銨和5.65g水)5g硫酸銨45g水1.25g戊二醛(按100%計(jì)算)0～3g賴氨酸(見表Ⅵ)在攪拌前用氫氧化鈉將所有反應(yīng)充分的PH調(diào)至8.0。
混合物于3℃攪拌18小時(shí)。
表Ⅵ實(shí)例賴氨酸(g)活性(%)實(shí)例52040實(shí)例530.362實(shí)例540.666實(shí)例551.272實(shí)例561.892實(shí)例573.096由以上結(jié)果看來，賴氨酸對(duì)交聯(lián)結(jié)晶的活性具有十分有利的作用。雖然單獨(dú)使用硫酸銨可得到滿意的結(jié)果，但是當(dāng)應(yīng)用賴氨酸時(shí)，硫酸銨對(duì)結(jié)果影響不很大。
實(shí)例58～69異構(gòu)酶和賴氨酸的用量保持不變，其它成分按表Ⅶ所示改變。
3g葡萄糖異構(gòu)酶(按干態(tài)計(jì)算)1g賴氨酸0.01g氫氧化鈉(PH8的溶液)于2℃反應(yīng)18小時(shí)。
表Ⅶ實(shí)例戊二醛 MgSO4水反應(yīng)溶液的總量活性(g)(g)(g)(g)(%)實(shí)例580.52.111.918.539實(shí)例590.52.715.322.570實(shí)例600.54.223.832.570實(shí)例610.55.332.742.573實(shí)例620.510.257.872.575實(shí)例630.516.291.8112.577實(shí)例641.252.111.919.2586實(shí)例651.252.715.323.2599實(shí)例661.254.223.833.25101實(shí)例671.255.332.743.2589實(shí)例681.2510.257.873.2583實(shí)例691.2516.291.8113.2589
從以上結(jié)果看來，反應(yīng)混合物的濃度對(duì)最終結(jié)果幾乎沒有什么影響。反應(yīng)成分(酶、賴氨酸(或胺)和戊二醛)之間的重量比例則具有較大的影響。
實(shí)例70將水洗過的1g交聯(lián)葡萄糖異構(gòu)酶物質(zhì)(按實(shí)例56制得;0.4g干物質(zhì))混入PH值已調(diào)至7.0的100g40%葡萄糖溶液中?；旌衔镉?0℃不斷攪拌。從混合物中間歇地取樣，用旋光計(jì)測(cè)定樣品的果糖含量，用已糖激酶以酶法測(cè)定葡萄糖含量。在3小時(shí)內(nèi)果糖含量上升到溶液總糖含量(葡萄糖+果糖＝100%)的42%。試驗(yàn)后交聯(lián)異構(gòu)酶經(jīng)過濾從混合物中分出并用水洗滌。測(cè)定所得結(jié)晶物質(zhì)的活性及其干含量。試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)活性酶溶解或消失。用同一批酶可以重復(fù)試驗(yàn)數(shù)次。
實(shí)例71洗去按實(shí)例1所述制得的結(jié)晶物中的細(xì)粒狀沉淀，并在把結(jié)晶材料懸浮于水中并將水傾出(3次)的過程中，將結(jié)晶材料軋細(xì)。將所得平均大小為100μm的大結(jié)晶部分裝入于直徑為2.6cm、高為5cm的圓柱形反應(yīng)器內(nèi)。把具有以下組成的葡萄糖溶液于60℃泵入柱內(nèi)使其通過582g葡萄糖一水合物590g水0.37g Mg SO47H2O0.19g Na HSO3
PH6.9(1MNaOH，用量低于1ml)試驗(yàn)開始時(shí)流速為11ml/分，同時(shí)從柱中流出的溶液的果糖含量上升到總糖含量的42%。試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行200小時(shí)，此后流速須減至9ml/分以保持原有的轉(zhuǎn)化率(果糖含量為42%)。因此，在這期間酶的活性下降到初始值的81%，在試驗(yàn)期間未觀察到結(jié)晶物質(zhì)減少或溶解。
實(shí)例72～76稱取43.42g水洗過的濕的活性異構(gòu)酶(按實(shí)例67的方法制得;10.0g酶(按干物質(zhì)計(jì)算)。
將200ml按實(shí)例71所述方法制得的葡萄糖溶液與該結(jié)晶物質(zhì)相混合。于60℃將混合物攪拌不同時(shí)間，然后通過圓形濾紙過濾混合物。留在濾紙上的結(jié)晶物質(zhì)仔細(xì)地用水沖洗，以除去所有可溶性物質(zhì)。在恒溫箱中于105℃將結(jié)晶物質(zhì)干燥，然后稱重。結(jié)果列于表Ⅷ中。
表Ⅷ實(shí)例攪拌時(shí)間試驗(yàn)后結(jié)晶物質(zhì)的干重(g)實(shí)例7210分鐘9.9實(shí)例732小時(shí)11.0實(shí)例744小時(shí)10.9實(shí)例756小時(shí)10.7實(shí)例7621小時(shí)10.4
從以上結(jié)果看來，在常規(guī)工業(yè)操作條件下，按本發(fā)明方法制得的交聯(lián)結(jié)晶異構(gòu)酶不溶于底物溶液中。
實(shí)例77將結(jié)晶狀交聯(lián)異構(gòu)酶、固定連結(jié)在DEAE纖維素上的異構(gòu)酶和原來的游離可溶性異構(gòu)酶都置于完全相同的化學(xué)和物理?xiàng)l件下，對(duì)它們進(jìn)行相互比較。選擇條件，使每個(gè)酶樣品的活性在合理的短時(shí)間內(nèi)(即10～30小時(shí))能有在可測(cè)范圍內(nèi)的下降。每個(gè)酶制品取5g混入150ml0.05M磷酸鈉緩沖液(PH6.0)(含有1.5mmol/lMgSO和2mmol/lNaHSO)中?；旌衔镉?0℃振搖數(shù)小時(shí)。從混合物中間歇地取樣，經(jīng)由樣品測(cè)定剩余異構(gòu)酶的活性。根據(jù)活性降到情況，確定出每個(gè)酶樣品的半壽期(即活性降至原有值的1/2時(shí)所用的時(shí)間)，結(jié)果示于表Ⅸ中。
表Ⅸ酶樣品半壽期(h)原來的可溶性異構(gòu)酶2.2固定在DEAE纖維素上的異構(gòu)酶3.3結(jié)晶狀交聯(lián)結(jié)晶異構(gòu)酶19.0從以上結(jié)果看來，交聯(lián)結(jié)晶保持其酶活性的能力大大強(qiáng)于游離酶或用已知方法固定的酶。
實(shí)例78將結(jié)晶狀交聯(lián)異構(gòu)酶和固定在DEAE纖維素上的異構(gòu)酶裝入與實(shí)例71所述類似的圓柱形反應(yīng)器內(nèi)。用泵使葡萄糖溶液連續(xù)地從柱中通過。此葡萄糖溶液除PH調(diào)至6.0外，其組成與實(shí)例71中的相同。在試驗(yàn)期間柱溫為60℃。柱中所含酶的活性根據(jù)流速和流出溶液的果糖含量進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果列于表Ⅹ中。
表Ⅹ反應(yīng)器裝填物活性半壽期〔小時(shí)(h)〕結(jié)晶狀交聯(lián)異構(gòu)酶120在DEAE纖維素上固定的異構(gòu)酶36從以上結(jié)果看來，交聯(lián)結(jié)晶能很好地保持其酶活性。
實(shí)例79～81柱處理法中交聯(lián)結(jié)晶與現(xiàn)有技術(shù)的固定異構(gòu)酶的比較將工業(yè)上應(yīng)用的典型異構(gòu)酶樣品與本發(fā)明的交聯(lián)結(jié)晶裝入垂直的實(shí)驗(yàn)柱內(nèi)。該交聯(lián)結(jié)晶是按實(shí)例51所述方法制備的。圓柱形柱的內(nèi)徑為2.7cm，高為50cm。實(shí)驗(yàn)柱有一個(gè)60℃的恒溫水夾層。柱子的下端有一個(gè)篩網(wǎng)，以便把酶顆粒保持在柱中，同時(shí)能使糖溶液從柱中流過。將各為20g按干燥物計(jì)算的每種酶裝入各個(gè)柱中。具有實(shí)例71組成的葡萄糖底物用可調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)泵泵入各柱中。每個(gè)柱子各用一個(gè)泵。底物的溫度調(diào)至60℃。測(cè)定流出柱子的產(chǎn)物中的葡萄糖和果糖。當(dāng)?shù)孜锪魉傧嗤瑫r(shí)，觀察到經(jīng)每種不同的酶制品得到不同含量的果糖。各個(gè)柱子的流速分別用嘗試法調(diào)節(jié)，直到各個(gè)產(chǎn)物中果糖的含量同樣是總糖(葡萄糖+果糖)的45%。下表列出了所用的酶以及生成45%果糖時(shí)的相應(yīng)流速。
表Ⅺ實(shí)例20g按干燥物質(zhì)計(jì)算的酶底物溶液流速(ml/h)(比較用樣品)SPEZYMEIGI，179芬蘭糖業(yè)公司的市售產(chǎn)品(比較用樣品)SWEETZYMET.197丹麥NOVO公司的市售產(chǎn)品(比較用樣品)TAKASWEET，94Miles-KaliChemie的市售產(chǎn)品79直徑100～200μm的交聯(lián)異構(gòu)1364酶結(jié)晶80直徑500～600μm的交聯(lián)異構(gòu)1121酶結(jié)晶81直徑900～1100μm的交聯(lián)異構(gòu)1098酶結(jié)晶含有市售酶的柱子的流速十分典型地代表了目前工業(yè)實(shí)踐中所觀察到的流速。含有交聯(lián)異構(gòu)酶結(jié)晶的柱子其流速高得多。在工業(yè)實(shí)踐中，使用高活性的交聯(lián)結(jié)晶時(shí)采用較小的酶柱就夠了，這樣就可以減少投資和操作費(fèi)用。
權(quán)利要求
1.結(jié)晶狀葡萄糖異構(gòu)酶，其特征在于通過交聯(lián)使結(jié)晶狀可溶的葡萄糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)變?yōu)樗蝗艿男问健?br> 2.按照權(quán)利要求1所述的葡萄糖異構(gòu)酶，其特征在于在PH范圍為1-10的稀酸和堿溶液中是不溶的。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的葡萄糖異構(gòu)酶，其特征在于它在葡萄糖、果糖和其它糖的水溶液中是不溶的。
4.按照權(quán)利要求3所述的葡萄糖異構(gòu)酶，其特征在于該結(jié)晶在上述糖溶液中是不溶的，甚至在提高溫度下也是不溶的。
5.按照權(quán)利要求1所述的葡萄糖異構(gòu)酶，其特征在于它可催化它的天然底物(如葡萄糖、果糖和木糖)的異構(gòu)化，甚至在上述糖的濃溶液中它也可進(jìn)行催化。
6.按照權(quán)利要求1-5所述的葡萄糖異構(gòu)酶，其特征在于通過化學(xué)和物理的作用該結(jié)晶結(jié)合成較大的圓形、片狀、帶狀的物體或這些物體的可能的混合物。
7.用于連續(xù)生產(chǎn)果糖的反應(yīng)器，該反應(yīng)器含有水不溶性、充分純的結(jié)晶狀交聯(lián)葡萄糖異構(gòu)酶。
8.制備水不溶的結(jié)晶狀交聯(lián)酶的方法，該方法的特征在于a)將二醛加到結(jié)晶狀異構(gòu)酶懸浮液中，在加入二醛之前或在交聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，加入含有至少一個(gè)氨基的化合物，例如銨鹽、胺或氨基酸，以及b)用水或其它液體洗滌交聯(lián)結(jié)晶，以除去試劑殘余物。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其中的酶為葡萄糖異構(gòu)酶。
10.按照權(quán)利要求8的方法，其特征在于二醛為戊二醛。
11.按照權(quán)利要求8或9的方法，其特征在于戊二醛的用量為0.4～8%(重)。
12.使底物異構(gòu)化的方法，其中應(yīng)用結(jié)晶狀交聯(lián)異構(gòu)酶催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)樗漠悩?gòu)體。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述的底物為葡萄糖、果糖或木糖，并且上述異構(gòu)酶為葡萄糖異構(gòu)酶。
14.連續(xù)生產(chǎn)果糖的方法，其中使含有葡萄糖的溶液流經(jīng)含有水不溶的結(jié)晶狀交聯(lián)葡萄糖異構(gòu)酶的反應(yīng)器。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于新的水不溶的葡萄糖異構(gòu)酶，該酶是通過使結(jié)晶狀酶交聯(lián)而轉(zhuǎn)化為固體形式得到的。本發(fā)明還涉及在至少含有一個(gè)氨基的化合物存在下，用二醛進(jìn)行交聯(lián)化反應(yīng)來制備上述新的結(jié)晶狀葡萄糖異構(gòu)酶的方法，以及這種新的酶制品作為異構(gòu)化催化劑的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C23G5/06GK1038313SQ8810345
公開日1989年12月27日 申請(qǐng)日期1988年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1988年6月4日
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