專利名稱：原位構(gòu)建基因突變文庫的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)工程、分子生物學(xué)技術(shù)、基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種原 位構(gòu)建基因突變文庫的方法，以及用這種方法構(gòu)建1至多級突變文庫的試劑盒。
背景技術(shù)：
體外定向進化不僅為研究酶的底物特異性和確定酶的催化活性位點，改善酶 的熱穩(wěn)定性等方面提供了強有力的手段，而且有助于了解蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間的 關(guān)系。定向進化策略主要是體外模擬自然進化過程，快速，高效地建立一個隨機 突變的基因文庫，這已成為蛋白質(zhì)工程研究的重要措施。
易錯PCR是構(gòu)建基因突變文庫的一種基本方法，其原理是在PCR過程中通 過調(diào)整Mg^和Mn^濃度等因素，提高r叫酶在擴增過程中引入錯配堿基的頻 次，導(dǎo)致目標基因的擴增產(chǎn)物發(fā)生適量的隨機突變(Kammann e ，Nucleic Acids Res. 1989, 17(13): 5404)。早期的通過易錯PCR構(gòu)建突變文庫的步驟包括1)以 目標基因為模板在易錯條件下進行擴增出含有錯配堿基的突變基因；2)用限制 性內(nèi)切酶對突變基因進行末端處理；3)用DNA連接酶將突變基因連接到表達載 體上；4)將重組的表達載體導(dǎo)入宿主細胞，獲得帶有各種不同突變基因的重組 細胞群體，即基因突變文庫。這個過程相當于對目標基因進行了再一次克隆或稱 亞克隆，所不同的是亞克隆只需要獲得幾個轉(zhuǎn)化子，而一個基因隨機突變文庫需 要從成千上萬個轉(zhuǎn)化子，才能從中篩選出目標突變子。
隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，早期發(fā)明的突變文庫的構(gòu)建方法顯現(xiàn)出步驟煩瑣和效 率低等問題。為了提高構(gòu)建基因突變文庫的效率，Miyazaki和Takenouchi于2002 年提出大引物擴增法(Biotechniques， 33(5): 1033-1036)，對上述方法中的第2 步和第3歩進行了替換以隨機突變后的目標基因為大引物，以表達質(zhì)粒為模板， 采用高保真DNA聚合酶進行PCR，擴增出質(zhì)粒的全長片斷；再用Z^" I的處理， 將模板質(zhì)粒降解。這樣產(chǎn)生的含有突變基因的雙鏈質(zhì)粒，避免了限制性內(nèi)切酶處 理過程和突變基因與表達載體的連接過程。
大引物擴增法使構(gòu)建基因突變文庫的效率提高了一些，但是其中仍然有很多不足之處，例如，其中所使用的大引物是特定基因的突變?nèi)后w，不具有通用性； 只有當大引物大小在500-1000 bp才能獲得較好的擴增效果，突變基因的大小受 到限制；大引物擴增出來的是線性DNA，在退火時難以形成兩個缺口的環(huán)狀質(zhì) 粒，轉(zhuǎn)化效率低；大引物誘變方法同樣需要對PCR產(chǎn)物進行酶切，對質(zhì)粒模板 進行消化，步驟煩瑣。因此，構(gòu)建基因突變文庫需要有簡便、快捷、具有通用性 的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種原位構(gòu)建基因突變文庫的方法，以及用于方便實施 該方法的試劑盒。
本發(fā)明涉及用于原位構(gòu)建基因突變文庫的方法和試劑盒，所說的原位構(gòu)建基 因突變文庫的方法，其步驟是
(1) 將需要突變的目標基因克隆到表達載體的多克隆位點中構(gòu)建成基因表 達質(zhì)粒，并將基因表達質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，確認目標基因在大腸桿菌中得到表達；
(2) 以基因表達質(zhì)粒為模板，用選擇標記不同于基因表達質(zhì)粒的載體片斷 作引物，加入極耐熱性DNA連接酶、7邵DNA聚合酶和PCR緩沖液(含dNTP， MgCl2)， MnCl2禾P NAD+等；
(3) 在全自動PCR儀中進行易錯PCR和連接反應(yīng)；
(4) 用PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，并在與引物所帶的選擇標記相 應(yīng)的抗性平板上，選擇性地培養(yǎng)含突變基因的轉(zhuǎn)化子，獲取含正突變基因的重組 質(zhì)粒。
本發(fā)明的試劑盒含有 一種含pUC18/19復(fù)制基因的大小為2. 2至3 kb基因 高效表達載體；極耐熱性DNA連接酶；與高效表達載體相應(yīng)的帶有不同抗性基 因的線性載體片段。
本發(fā)明方法的原理如圖l所示，(a)在初次循環(huán)中，以帶有抗性基因A(如 amp，氨芐青霉素抗性基因)的基因表達質(zhì)粒為模板，帶有抗性基因B (如kan， 卡那霉素抗性基因)的線性載體片段為引物，對模板中的目標基因或部分目標基 因在易錯條件下進行聚合酶聚合反應(yīng)，聚合完成后隨即被DNA連接酶連接成環(huán) 狀DNA，并進入下一個熱循環(huán)；(b)易錯PCR完成后，用PCR反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸 桿菌細胞，并在與抗性基因B相應(yīng)的抗生素平條件下篩選；(c)再以正突變子 中的帶有抗性基因B質(zhì)粒為模板，帶有抗性基因A的線性載體片段為引物，進行下一輪突變和篩選(d)。
本發(fā)明的特點在于極耐熱性DNA連接酶在PCR過程中介導(dǎo)擴增片段的環(huán) 化，產(chǎn)生的環(huán)狀質(zhì)?？芍苯佑糜诨蜣D(zhuǎn)化；在小型表達載體中以高保真性的線性 載體片段為引物，對表達質(zhì)粒中的目標基因進行局部易錯PCR;通過不同的篩選
標記選擇性地培養(yǎng)含突變基因的轉(zhuǎn)化子，達到基因突變產(chǎn)物與原始模板分離。
上述原位構(gòu)建基因突變文庫的方法步驟(1)和步驟(4)中涉及的目標基
因的克隆、大腸桿菌的基因轉(zhuǎn)化等相關(guān)操作均按《分子克隆手冊》第三版上的標
準方法進行的(Sambrook and Russell, 2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。
上述原位構(gòu)建基因突變文庫的方法步驟(2)中MnCl2的濃度與易錯PCR的 突變頻率相關(guān)，推薦濃度范圍為0.05 0.5mM，建議對小于1 kb的目標基因采 用較高的MnCl2濃度，對大于1 kb的基因適當降低MnCl2的濃度。極耐熱性DNA 連接酶和NAD+按實施例中的用量使用；其它酶和試劑的濃度按常規(guī)PCR條件 使用。
上述原位構(gòu)建基因突變文庫的方法步驟(3)中，連接反應(yīng)和PCR反應(yīng)同步 進行，建議參考實施例提供的反應(yīng)溫度設(shè)定熱循環(huán)程序。
上述步驟原位構(gòu)建基因突變文庫的方法(4)突變子的篩選方法因目標基因 性質(zhì)而異，與本發(fā)明的技術(shù)沒有直接關(guān)系。突變子中，基因產(chǎn)物的性狀表現(xiàn)為向 所期望的目標性狀轉(zhuǎn)變的突變稱為正突變。
從所獲得的目標突變子中提取的含正突變基因的重組質(zhì)?？梢员辉俅斡米?模板，立即進入新一輪的隨機突變和篩選(圖l)。
所說的"原位"指對已經(jīng)被插入表達載體的目標基因構(gòu)建基因突變文庫的過 程中不需要進行再次克隆。試劑盒EvoGen Kit為用該方法構(gòu)建基因突變文庫提 供了所需要的各種試劑和引物，其中包括普通制劑和特征性制劑。普通制劑包括 常規(guī)PCR所需要的DNA聚合酶和含dNTP和Mg"的PCR緩沖液、連接反應(yīng)需要的 NAD+溶液，以及誘變所需要的MnCl2溶液。
本發(fā)明方法和試劑盒中，所使用的特征性制劑及其制備方法如下 (1)所說的表達載體是從pUC18/19改建的大小為2. 2至2. 5 kb基因高效 表達載體。本方法推薦使用pHsh系列的受cr32或(77()識別的表達載體，因為它 們分別帶三種不同抗性基因，而且可根據(jù)需要選擇分泌型表達、低溫或無誘導(dǎo)表 達。pHsh系列表達載體的性質(zhì)參見國際專利文獻WO 2006/002574 Al和美國專利 文獻US-2007-0254335-A1;其基因序列參見基因庫資料(GenBank accession No.FJ571619, FJ571620， FJ571621， FJ715938， Fj715939)。
(2) 所說的極耐熱性DNA連接酶是從嗜極端高溫的細菌或古菌克隆和異源 表達的DNA連接酶，建議選用海棲熱袍菌(77 er7z "o卵/z7arj'ti'鵬)熱穩(wěn)定性DNA 連接酶，其制備方法是用一對引物(5'-CTTCATATGAGTGAGAGAAAGAT C-3'禾n 5'-ACAAAGCTTACTCCATTCCTTCCAAC陽3')，從海棲熱袍菌基因 組中擴增DNA連接酶基因(GenBank accession No: NC_000853)，克隆到表達載 體pET-20b(+) (Novagen, Darmstadt Germany)，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET-//gaw，導(dǎo) 入￡ co//JM109(DE3)中進行表達，并純化出重組酶(圖2)。具體操作參考《分 子克隆手冊》第三版上的標準方法(Sambrook and Russell,2001,CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。
(3) 表達載體線性片段試劑盒提供兩種帶有不同選擇標記的表達載體片
段，其制備方法是分另ll以pHsh-amp、 pHsh-fe "或pHsh-c必 (GenBank accession No. FJ571619, FJ571620, FJ571621)為模板，用一對磷酸化的引物(5，-pCCTCC ATGGG TATAT CTCCT T-3'和5'—pAAGCT TGA AG GCCGC TTCCG A-3，)，并采
用高保真性的戶,o6eWDNA聚合酶(TaKaRa)進行PCR擴增。
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在
(1) 原位隨機突變，效率高，操作方便極耐熱性DNA連接酶介導(dǎo)的環(huán)狀
質(zhì)粒擴增，省略了限制性酶切、連接等繁瑣且降低效率的操作；
(2) 可進行大范圍的突變目標基因的大小不影響突變效果，還可以根據(jù) 具體要求制備線性表達質(zhì)粒的片段，對目標基因中的特定區(qū)域進行隨機突變；
(3) 對突變體具有選擇性通過不同的篩選標記選擇性地培養(yǎng)含突變基因 的轉(zhuǎn)化子，將基因突變產(chǎn)物與原始模板分離，便于平板篩選和高通量篩選；
(4) 材料與方法具有通用性 一套試劑適用于各種目標基因；
(5) 便于進行多級隨機突變從篩選到的目標突變子中提取的含正突變基 因的重組質(zhì)粒，可以用作模板直接進入突變文庫的再次構(gòu)建，通過篩選獲得2 級或多級累加的正突變。


圖l.原位隨機突變原理示意圖。
圖2.海棲熱袍菌熱穩(wěn)定性DNA連接酶的表達和純化的電泳分析。聚丙烯 酰氨凝膠電泳圖中，泳道M:蛋白分子量標準；泳道l:含pET-20b的大腸桿菌
JM109(DE3)的胞內(nèi)全蛋白；泳道2:從含pET-//gaw的大腸桿菌JM109(DE3)提 取的粗酶液；泳道3:粗酶液經(jīng)過75'C熱處理和離心；泳道4: His-tagged親和 層析后獲得的純酶。
圖3.實施例1中的易錯PCR反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析。
M, DNA分子量標準；1 ,空白對照，不加Tm DNA ligase和ra《DNA聚合酶 的PCR反應(yīng)；2,不加Tm DNA ligase，力P T叫DNA聚合酶的PCR反應(yīng)；3和4， 加入Tm DNA ligase和T叫DNA聚合酶的PCR反應(yīng)。
圖4.實施例1中的易錯PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌中，突變子在含有 木聚糖的LB平板上生長。
圖5.實施例2易錯PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌中，突變子在含有羧甲 基纖維素(CMC)的LB平板上生長。
具體實施例
下面結(jié)合具體的實施例及附圖進一步詳細地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施 例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下實施例中所使用的術(shù)語，除非有另外說明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員通常理解的含義；實施例中未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的 常規(guī)方法，可參考《分子克隆手冊》第三版上的標準方法(SambrookandRussdl， 2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York);所用特征性制劑在發(fā)明內(nèi)容部 分已經(jīng)描述，其它常規(guī)試劑的來源、商品名以及有必要列出組成成分者，均在首 次出現(xiàn)時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內(nèi)容相同。
以下實施列中涉及的pHsh系列載體，由發(fā)明人實驗室構(gòu)建保存；公眾可從 發(fā)明人實驗室獲取，也可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)自行構(gòu)建。
實施例l:疏棉狀嗜熱絲孢菌(77iw附(w^ces/做"g/"仍附)木聚糖酶基因突變文
庫的構(gòu)建和篩選(1) 根據(jù)疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶基因序列(GenBank: U35436)合成 編碼成熟肽的完整基因，并插入帶有氨芐青霉素抗性基因的表達載體pHsh-amp 構(gòu)建成重組表達質(zhì)粒pHsh-Jcy"J，具體方法參見Yin Erkang等(World J Microbiol Biotechnol， 2008, 24: 275-280)。
(2) 以pHsh-:c""為模板，選用帶有卡那霉素抗性基因的線性載體片段為 引物，配制以下PCR反應(yīng)體系(20pl):
線性載體片段1 pi
熱穩(wěn)定性DNA連接酶1 pi
質(zhì)粒模板(pHsh-x，J)1 pi (30 ng爾l)
10 mM MnCl20.8 pi
10xPCR buffer2 pi
10 mM NAD+ (sigma公司)1 ^
ddH2012.8 pi
ra《DNA聚合酶(TaKaRa)0.4 pi ( 0.5 U )
(3) PCR擴增，循環(huán)程序為95°C， 5min; (94°C， 1 min, 72°C， 1.5 min 和60°C， 2 min) X15循環(huán)；60。C延伸10 min。 PCR完成后對產(chǎn)物進行瓊脂糖 凝膠電泳分析(圖3)。結(jié)果表明，在同時加入r叫DNA聚合酶和TmDNAligase 的PCR反應(yīng)中，環(huán)狀質(zhì)粒條帶中DNA量有明顯的提高。
(4) PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡ JM109感受態(tài)細胞(Promega Corp., Madison, WI, USA),涂布在含有2%木聚糖和卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板上，置37匸溫箱中 培養(yǎng)(圖4)，菌落周圍的透明圈的大小表明基因突變導(dǎo)致木聚糖酶活性發(fā)生很 大的變化。
實施例2:海棲熱袍菌纖維素酶基因突變文庫的構(gòu)建和篩選
試劑盒由8種試劑組成熱穩(wěn)定性連接酶、2種線性載體片段、表達載體
pHsh、 Tag DNA聚合酶、10 mM MnCl2、 10 mM NAD+、 10xPCR buffer (含 MgCl2和dNTP)。
使用上述試劑盒構(gòu)建海棲熱袍菌纖維素酶CdB基因突變文庫的方法如下 (1)根據(jù)海棲熱袍菌纖維素酶CelB的基因序列(GenBank Accession No.NC—000853)設(shè)計引物(5'-GGGCT CGAGT TATTT TACAA CTTCG ACAG -3' 禾口 5，- CTAGC GTTGG TGCAACGGAC -3，)，以海棲熱袍菌基因組DNA為模板， 擴增出除信號肽以外的全部編碼基因，按照標準的分子克隆方法將基因插入帶有 卡那霉素抗性基因表達載體pHsh-kan，構(gòu)建成重組表達質(zhì)粒pHsh-ce/S。
(2)以pHsh-cdS為模板、帶有氨芐青霉素抗性基因的線性質(zhì)粒片段為引物，
建立以下PCR反應(yīng)體系
線性載體片段 1 nl
熱穩(wěn)定性DNA連接酶 1 ^
質(zhì)粒模板(pHsh-x;%4) 1 pl (30 ng/^il)
10mMMnCl2 0.4^1
10xPCR buffer 2 |ul
10 mM NAD+ (sigma公司) 1
ddH20 13.2 (il
T叫DNA聚合酶(TaKaRa) 0.4 pi ( 0.5 U )
(3) PCR擴增程序為95°C， 5min; (94°C， lmin,72。C， 1.5min和60。C， 2min) X20循環(huán);60。C延伸10min。
(4) PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡.co// JM109感受態(tài)細胞，涂布在含有氨節(jié)青霉素和2.5% 羧甲基纖維素的LB平板上，置于4(TC溫箱中培養(yǎng)。生長的菌落釋放纖維素酶， 對培養(yǎng)基中羧甲基纖維素進行降解；酶活性的強弱體現(xiàn)于菌落周圍凹陷圈的大小
(圖5)。
(5) 以pHsh-Ce/S轉(zhuǎn)化子作對照，從凹陷圈明顯增大的菌落挑取細胞接種， 提取質(zhì)粒進行分析和驗證。確認正突變后命名為pHsh-ce/S-ml。
實施例3:海棲熱袍菌纖維素酶基因"仿的2級隨機突變和篩選 以實施例2中得到的含1級正突變基因的質(zhì)粒pHsh-"W-ml為模板，重復(fù)實施 例2中的步驟(2)至(5)，所不同的是步驟(2)中換以帶有卡那霉素抗性基因 的線性質(zhì)粒片段為引物；步驟(4)中的培養(yǎng)基平板換為含有卡那霉素而不是氨 芐青霉素LB平板。正突變得到確認后命名為pHsh-ceW-m2。
權(quán)利要求
1. 一種原位構(gòu)建基因突變文庫的方法，(1)將需要突變的目標基因克隆到表達載體的多克隆位點中構(gòu)建成重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，確認目標基因在大腸桿菌中得到表達；(2)以重組質(zhì)粒為模板，用選擇標記不同于重組質(zhì)粒的載體片斷作引物，加入極耐熱性DNA連接酶、Taq DNA聚合酶和PCR緩沖液；(3)在全自動PCR儀中進行易錯PCR和連接反應(yīng)；(4)用PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，并在與引物所帶的選擇標記相應(yīng)的抗性平板上，選擇性地培養(yǎng)含突變基因的轉(zhuǎn)化子，獲取含正突變基因的重組質(zhì)粒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所說的原位構(gòu)建基因突變文庫的方法，其特征在于，步 驟(1)中所說的表達載體是從pUC18/19改建產(chǎn)生的載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所說的原位構(gòu)建基因突變文庫的方法，其特征在于，所 說的表達載體是從pUC18/19改建產(chǎn)生的載體，是pHsh系列載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所說的原位構(gòu)建基因突變文庫的方法，其特征在于， 步驟(1)中所說的極耐熱性DNA連接酶是海棲熱袍菌熱穩(wěn)定性DNA連接酶。
5. —種應(yīng)用權(quán)利要求1的方法構(gòu)建基因突變文庫的試劑盒，其特征在于， 該試劑盒含有(1) 一種帶有抗性基因的表達載體；(2) 極耐熱性DNA連接酶；(3) 與表達載體相應(yīng)的帶有不同抗性基因的線性載體片段。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所說的原位構(gòu)建基因突變文庫的方法，其特征在于，(1) 中所說的表達載體是從pUC18/19改建產(chǎn)生的載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所說的原位構(gòu)建基因突變文庫的方法，其特征在于，所 說的表達載體是從pUC18/19改建產(chǎn)生的載體，是pHsh系列載體。
全文摘要
本發(fā)明為基因定向進化提供一種快速、通用的原位構(gòu)建基因突變文庫的新方法，以及應(yīng)用該方法構(gòu)建基因突變文庫的試劑盒。該方法具有以下特點(1)極耐熱性DNA連接酶在PCR過程中介導(dǎo)環(huán)狀質(zhì)粒的擴增；(2)在小型表達載體中對目標基因或部分目標基因進行原位易錯PCR；(3)以不同的篩選標記將隨機突變基因與原始模板分離；(4)一套試劑適用于各種目標基因，并且便于對篩選到的正突變基因再次構(gòu)建突變文庫，通過篩選獲得多級累加的正突變。試劑盒EvoGen Kit為用該方法構(gòu)建基因突變文庫提供了所需要的各種試劑。
文檔編號C40B50/06GK101532181SQ20091002592
公開日2009年9月16日 申請日期2009年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者樂易林, 裴建軍, 邵蔚藍 申請人:南京師范大學(xué)