一種超高密度超分辨光學閃爍顯微成像系統(tǒng)及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種超高密度超分辨光學閃爍顯微成像系統(tǒng)及方法，它包括：激發(fā)光源，提供激發(fā)光；第一會聚透鏡，對來自激發(fā)光源的激發(fā)光聚光；第一二向色鏡，反射來自第一會聚透鏡的激發(fā)光；物鏡，透射來自第一二向色鏡的激發(fā)光；載物臺，設置生物樣品，生物樣品在激發(fā)光激發(fā)下發(fā)射熒光，并通過物鏡發(fā)射到第一二向色鏡；第二二向色鏡，對來自第一二向色鏡的熒光分光；第二會聚透鏡，對被第二二向色鏡反射的熒光聚光；第一CCD相機，對來自第二會聚透鏡的熒光成像；第三二向色鏡，對被第二二向色鏡透射的熒光分光；第三會聚透鏡，對被第三二向色鏡反射的熒光聚光；第二CCD相機，對來自第三會聚透鏡的熒光成像；第四會聚透鏡，對被第三二向色鏡透射的熒光聚光；以及第三CCD相機，對來自第四會聚透鏡的熒光成像。
【專利說明】一種超高密度超分辨光學閃爍顯微成像系統(tǒng)及方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種光學成像系統(tǒng)及方法，特別是關于一種基于聯(lián)合生物標記的超高 密度超分辨光學閃爍顯微成像系統(tǒng)及方法。

【背景技術】
[0002] 超分辨光學顯微技術利用對熒光發(fā)射在空間或時間上的調制，實現(xiàn)了突破光學衍 射極限的顯微成像。超分辨光學閃爍顯微成像技術（S0FI)通過熒光團自身發(fā)射熒光在時 間上的閃爍特性，計算不同熒光團所發(fā)射的熒光信號的時間自相關或空間互相關函數(shù)，獲 得空間分辨率的提升。在傳統(tǒng)的超分辨光學閃爍顯微成像中，分辨率提高的多少與所計算 的互相關累積量的階數(shù)有關，階數(shù)越高，所得到的分辨率提升也會越多。此外，熒光團生物 標記密度的高低直接影響到重建的生物結構的連續(xù)性和完整性，但是，隨著互相關累積量 階數(shù)的增加，高標記密度的圖像重建會誘發(fā)嚴重的偽影，導致最終圖像出現(xiàn)明顯的殘缺和 不連續(xù)的結構，降低了成像的質量，這一數(shù)學問題限制了高階閃爍顯微成像在生命科學研 究中的應用。
[0003] 現(xiàn)有的方法只能通過適當降低生物標記的密度來減少高階閃爍顯微成像所誘發(fā) 的偽影，但降低標記密度所帶來的問題是會造成生物結構標記不完整，難以真實、完整地反 映所研究的生物結構的細節(jié)信息。


【發(fā)明內容】

[0004] 針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種基于聯(lián)合生物標記的超高密度超分辨光 學閃爍顯微成像系統(tǒng)及方法，該方法能夠有效降低在超高標記密度下高階閃爍顯微成像的 偽影，更加真實地還原出所研究的生物樣品的完整結構和細節(jié)信息。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術方案：一種超高密度超分辨光學閃爍顯微 成像系統(tǒng)，其特征在于，它包括：一激發(fā)光源，用以提供一束激發(fā)光；一第一會聚透鏡，對來 自所述激發(fā)光源的所述激發(fā)光進行聚光，并且來自所述激發(fā)光源的所述激發(fā)光穿透所述第 一會聚透鏡；一第一二向色鏡，反射來自所述第一會聚透鏡的所述激發(fā)光；一物鏡，透射來 自所述第一二向色鏡的所述激發(fā)光；一載物臺，其上設置有生物樣品，并且來自所述物鏡 的所述激發(fā)光照射在所述生物樣品上，所述生物樣品在來自所述物鏡的所述激發(fā)光的激發(fā) 下會發(fā)射熒光，所述熒光通過所述物鏡發(fā)射到所述第一二向色鏡，所述第一二向色鏡透射 來自所述物鏡的所述熒光；一第二二向色鏡，對來自所述第一二向色鏡的所述熒光進行分 光，一部分來自所述第一二向色鏡的所述熒光被所述第二二向色鏡反射，另一部分來自所 述第一二向色鏡的所述熒光被所述第二二向色鏡透射；一第二會聚透鏡，對被所述第二二 向色鏡反射的所述熒光進行聚光，并且來自所述第二二向色鏡的所述熒光穿透所述第二會 聚透鏡；一第一 C⑶相機，用于對來自所述第二會聚透鏡的所述熒光進行成像；一第三二向 色鏡，對被所述第二二向色鏡透射的所述熒光進行分光，一部分來自所述第二二向色鏡的 所述熒光被所述第三二向色鏡反射，另一部分來自所述第二二向色鏡的所述熒光被所述第 三二向色鏡透射；一第三會聚透鏡，對被所述第三二向色鏡反射的所述熒光進行聚光，并且 來自所述第三二向色鏡的所述熒光穿透所述第三會聚透鏡；一第二CCD相機，用于對來自 所述第三會聚透鏡的所述熒光進行成像；一第四會聚透鏡，對被所述第三二向色鏡透射的 所述熒光進行聚光，并且來自所述第三二向色鏡的所述熒光穿透所述第四會聚透鏡；以及 一第三CCD相機，用于對來自所述第四會聚透鏡的所述熒光進行成像。
[0006] 所述第一 C⑶相機、第二C⑶相機和第三C⑶相機具有相同的像素數(shù)，并且單個像 素大小相同。
[0007] -種超高密度超分辨光學閃爍顯微成像方法，包括以下步驟：1)使用三種不同熒 光發(fā)射波長的量子點聯(lián)合標記生物樣品中的同一細胞結構；2)將經過標記的生物樣品放 置并固定在超高密度超分辨光學閃爍顯微成像系統(tǒng)的載物臺上；3)調節(jié)物鏡與生物樣品 之間的距離，使生物樣品位于物鏡的焦點上，使成像系統(tǒng)滿足光學顯微系統(tǒng)的物象共軛關 系；4)開啟激發(fā)光源器，調節(jié)激發(fā)光的輸出功率，并同時通過多個數(shù)字成像設備觀察采集 到的熒光圖像，當觀察到明顯的熒光強度閃爍現(xiàn)象時，穩(wěn)定激發(fā)光的輸出功率；5)用多個 數(shù)字成像設備同時采集三種量子點獨立發(fā)射的熒光信號；6)對采集的三個通道的圖像時 間序列分別使用高精度的漂移校正算法進行漂移校正；7)用經平衡補償后的超分辨閃爍 顯微成像算法對漂移校正后的三個通道的閃爍熒光圖像進行分別處理；8)將處理后的三 個通道的超分辨圖像進行合并融合，即可得到生物樣品的超高分辨率、高保真度的圖像。
[0008] 所述第一二向色鏡選用能夠反射來自所述第一會聚透鏡的激發(fā)光并且透射所標 記的三種量子點發(fā)射的熒光的波長；所述第二二向色鏡選用能夠反射其中一種量子點的熒 光并且透射另外兩種量子點的熒光的波長；所述第三二向色鏡選用能夠反射所述第二二向 色鏡所透射的兩種量子點中一種量子點的熒光且透射另外一種量子點的熒光的波長。
[0009] 本發(fā)明由于采取以上技術方案，其具有以下優(yōu)點：1、本發(fā)明由于采用三種不同熒 光發(fā)射波長的量子點標記生物樣品的同一細胞結構，通過分別使用超分辨閃爍顯微成像算 法進行處理，并將處理后的圖像合并融合，有效地抑制了在超高標記密度下高階閃爍顯微 成像所產生的偽影和不連續(xù)性。2、本發(fā)明中采用的三種不同熒光發(fā)射波長的量子點作為生 物標記物，其可以由同一光源激發(fā),大大降低了系統(tǒng)的復雜性和成本。3、本發(fā)明中標記的三 種量子點的熒光波長完全分離且光譜無重疊，只需設置適當?shù)亩蛏R就能將三種量子點 的熒光信號完全分離，無需后期使用相關算法進行光譜分離，提高了系統(tǒng)的可操作性。4、本 發(fā)明由于設置有三個C⑶相機，可以實現(xiàn)同時對三個通道的熒光圖像同步采集，大大提高 了系統(tǒng)成像的速度。本發(fā)明可以廣泛應用于生物樣品的熒光成像過程中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是本發(fā)明超高密度超分辨光學閃爍顯微成像系統(tǒng)的結構示意圖；
[0011] 圖2是本發(fā)明方法中生物樣本聯(lián)合標記的示意圖。

【具體實施方式】
[0012] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
[0013] 如圖1所示，本發(fā)明提出了一種超高密度超分辨光學閃爍顯微成像系統(tǒng)，它包括 一激發(fā)光源1、三個二向色鏡2、3、4、一物鏡5、一載物臺6、四個會聚透鏡7、8、9、10和三個 CCD 相機 11、12、13。
[0014] 激發(fā)光源1用以提供一束激發(fā)光。會聚透鏡7設置在激發(fā)光所行經的光路上，并 對激發(fā)光源1所發(fā)出的激發(fā)光進行聚光。二向色鏡2反射來自會聚透鏡7的激發(fā)光，反射 后的激發(fā)光通過物鏡5照射在載物臺6上的生物樣品14上。生物樣品14在激發(fā)光的激發(fā) 下會發(fā)射熒光，熒光通過物鏡5發(fā)射到二向色鏡2。二向色鏡2透射來自物鏡5的熒光。二 向色鏡3設置在來自二向色鏡2的透射熒光的光路上，并對來自二向色鏡2的熒光進行分 光，一部分熒光被二向色鏡3反射，一部分熒光被二向色鏡3透射。會聚透鏡8設置在來自 二向色鏡3的反射熒光的光路上，并對來自二向色鏡3的反射熒光進行聚光使反射熒光在 C⑶相機11上成像。二向色鏡4設置在來自二向色鏡3的透射熒光的光路上，并對來自二 向色鏡3的透射熒光進行再次分光，一部分熒光被二向色鏡4反射，一部分熒光被二向色鏡 4透射。會聚透鏡9設置在來自二向色鏡4的反射熒光的光路上，并對來自二向色鏡4的 反射熒光進行聚光使反射熒光在C⑶相機12上成像。會聚透鏡10設置在來自二向色鏡4 的透射熒光的光路上，并對來自二向色鏡4的透射熒光進行聚光使透射熒光在CCD相機13 上成像。
[0015] 本發(fā)明的每個(XD相機分別對生物樣品14進行100幀左右的成像。將三個(XD 相機11、12、13采集到的圖像分別通過超分辨閃爍顯微成像算法處理，并將處理后的圖像 合并，最終可以獲得生物樣品內部結構的高分辨率、高質量的圖像。
[0016] 上述實施例中，激發(fā)光源1可采用激光器。
[0017] 上述實施例中，物鏡5可以選用數(shù)值孔徑大于1. 4的物鏡，以便C⑶相機11、12、13 能夠采集到盡可能高分辨率的寬場圖像，便于后期利用超分辨閃爍顯微成像算法實現(xiàn)對空 間分辨率的進一步提升，突破光學衍射極限。
[0018] 上述實施例中，三個C⑶相機11、12、13應具有相同的像素數(shù)，且單個像素大小應 一致，以確保采集到圖像具有相同大小的區(qū)域和分辨率，以便對三組圖像進行合并融合。
[0019] 上述實施例中，采用的是倒置熒光顯微鏡的方式對生物樣品14進行成像，也可以 采用正置式熒光顯微鏡的方式，兩者的區(qū)別僅是將光路進行上下翻轉，即當采用正置式熒 光顯微鏡時，生物樣品14設置在物鏡5的下部，當采用倒置式熒光顯微鏡時，生物樣品14 設置在物鏡5的上部（如圖1所示）。
[0020] 基于上述超高密度超分辨光學閃爍顯微成像系統(tǒng)，本發(fā)明還提出了一種超高密度 超分辨光學閃爍顯微成像方法，該方法包括以下步驟：
[0021] 1)使用三種不同熒光發(fā)射波長的量子點15、16、17聯(lián)合標記生物樣品14中的同一 細胞結構18。
[0022] 2)將經過標記的生物樣品14放置并固定在載物臺6上。
[0023] 3)精細調節(jié)物鏡5與生物樣品14之間的距離，使得生物樣品14位于物鏡5的焦 點上，使成像系統(tǒng)滿足光學顯微系統(tǒng)的物象共軛關系。
[0024] 4)開啟激發(fā)光源1，調節(jié)激發(fā)光的輸出功率，并同時通過C⑶相機11、12、13觀察 采集到的熒光圖像，當觀察到明顯的熒光強度閃爍現(xiàn)象時，穩(wěn)定激發(fā)光的輸出功率。
[0025] 5)設置合適的(XD相機曝光時間（通常設置為10?30毫秒），用三個(XD相機 11、12、13同時采集三種量子點獨立發(fā)射的熒光信號，采集的幀數(shù)各為100幀。
[0026] 6)對采集的三個通道的圖像時間序列分別使用高精度的漂移校正算法進行漂移 校正。
[0027] 7)用經平衡補償后的超分辨閃爍顯微成像算法對漂移校正后的三個通道共300 幀閃爍熒光圖像進行分別處理。
[0028] 8)將處理后的三個通道的超分辨圖像進行合并融合，即可得到生物樣品14的超 高分辨率、高保真度的圖像。
[0029] 上述各實施例中，如圖2所示，生物樣品14標記了三種量子點15、16、17,三種量子 點15、16、17均標記于同一細胞結構18上。其中，量子點15的熒光發(fā)射中心波長為525nm， 量子點16的突光發(fā)射中心波長為625nm，量子點17的突光發(fā)射中心波長為705nm，三種量 子點可由同一個波長的激發(fā)光進行激發(fā)，且其熒光發(fā)射光譜不存在重疊區(qū)域。
[0030] 上述各實施例中，二向色鏡2、3、4應當針對所標記的不同量子點選用合適的波 長。二向色鏡2應反射來自會聚透鏡7的激發(fā)光，透射所標記的三種量子點15、16、17發(fā)射 的突光；二向色鏡3應反射其中一種量子點的突光，透射另外兩種量子點的突光；二向色鏡 4應反射二向色鏡3所透射的兩種量子點中一種量子點的熒光，透射另外一種量子點的熒 光；最終將三種量子點的熒光有效地分離開。
[0031] 上述實施例僅用于說明本發(fā)明，凡是在本發(fā)明技術方案的基礎上進行的等同變換 和改進，均不應排除在本發(fā)明的保護范圍之外。
【權利要求】
1. 一種超高密度超分辨光學閃爍顯微成像系統(tǒng)，其特征在于，它包括： 一激發(fā)光源，用以提供一束激發(fā)光； 一第一會聚透鏡，對來自所述激發(fā)光源的所述激發(fā)光進行聚光，并且來自所述激發(fā)光 源的所述激發(fā)光穿透所述第一會聚透鏡； 一第一二向色鏡，反射來自所述第一會聚透鏡的所述激發(fā)光； 一物鏡，透射來自所述第一二向色鏡的所述激發(fā)光； 一載物臺，其上設置有生物樣品，并且來自所述物鏡的所述激發(fā)光照射在所述生物樣 品上，所述生物樣品在來自所述物鏡的所述激發(fā)光的激發(fā)下會發(fā)射熒光，所述熒光通過所 述物鏡發(fā)射到所述第一二向色鏡，所述第一二向色鏡透射來自所述物鏡的所述熒光； 一第二二向色鏡，對來自所述第一二向色鏡的所述熒光進行分光，一部分來自所述第 一二向色鏡的所述熒光被所述第二二向色鏡反射，另一部分來自所述第一二向色鏡的所述 熒光被所述第二二向色鏡透射； 一第二會聚透鏡，對被所述第二二向色鏡反射的所述熒光進行聚光，并且來自所述第 二二向色鏡的所述熒光穿透所述第二會聚透鏡； 一第一 CCD相機，用于對來自所述第二會聚透鏡的所述熒光進行成像； 一第三二向色鏡，對被所述第二二向色鏡透射的所述熒光進行分光，一部分來自所述 第二二向色鏡的所述熒光被所述第三二向色鏡反射，另一部分來自所述第二二向色鏡的所 述熒光被所述第三二向色鏡透射； 一第三會聚透鏡，對被所述第三二向色鏡反射的所述熒光進行聚光，并且來自所述第 三二向色鏡的所述熒光穿透所述第三會聚透鏡； 一第二CCD相機，用于對來自所述第三會聚透鏡的所述熒光進行成像； 一第四會聚透鏡，對被所述第三二向色鏡透射的所述熒光進行聚光，并且來自所述第 三二向色鏡的所述熒光穿透所述第四會聚透鏡；以及 一第三CCD相機，用于對來自所述第四會聚透鏡的所述熒光進行成像。
2. -種基于如權利要求1所述的超高密度超分辨光學閃爍顯微成像系統(tǒng)的成像方法， 包括以下步驟： 1) 使用多種不同熒光發(fā)射波長的量子點聯(lián)合標記生物樣品中的同一細胞結構； 2) 將經過標記的生物樣品放置并固定在所述超高密度超分辨光學閃爍顯微成像系統(tǒng) 的載物臺上； 3) 調節(jié)物鏡與生物樣品之間的距離，使生物樣品位于物鏡的焦點上，使成像系統(tǒng)滿足 光學顯微系統(tǒng)的物象共軛關系； 4) 開啟激發(fā)光源，調節(jié)激發(fā)光的輸出功率，并同時通過多個相機觀察采集到的熒光圖 像，當觀察到明顯的熒光強度閃爍現(xiàn)象時，穩(wěn)定激發(fā)光的輸出功率； 5) 對采集的三個通道的圖像時間序列分別使用高精度的漂移校正算法進行漂移校 正； 6) 用經平衡補償后的超分辨閃爍顯微成像算法對漂移校正后的三個通道的閃爍熒光 圖像進行分別處理； 7) 將處理后的三個通道的超分辨圖像進行合并融合，即可得到生物樣品的超高分辨 率、高保真度的圖像。
3.如權利要求2所述的一種超高密度超分辨光學閃爍顯微成像方法，其特征在于，所 述第一二向色鏡選用能夠反射來自所述第一會聚透鏡的激發(fā)光并且透射所標記的三種量 子點發(fā)射的熒光的波長；所述第二二向色鏡選用能夠反射其中一種量子點的熒光并且透射 另外兩種量子點的熒光的波長；所述第三二向色鏡選用能夠反射所述第二二向色鏡所透射 的兩種量子點中一種量子點的突光且透射另外一種量子點的突光的波長。
【文檔編號】G02B21/36GK104122662SQ201410401642
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年8月15日 優(yōu)先權日:2014年8月15日
【發(fā)明者】曾志平, 陳軒澤, 席鵬 申請人:北京大學