專利名稱：高分辨率光纖熒光成像的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高分辨率光纖熒光成像的方法和裝置，尤其是共焦成像；更具體涉及的預期應用領(lǐng)域是體內(nèi)、原位成像。
觀測到的熒光可來自外來化合物(一般為注入的標記物)或者生物組織的自生化合物(存在于細胞內(nèi))。
更具體地說，本發(fā)明的共焦成像方法是這樣一類成像方法該方法包括在皮下的平面內(nèi)逐點掃描組織，每點對應一個激發(fā)信號，該激發(fā)信號由連續(xù)源發(fā)射，依次偏轉(zhuǎn)并注入到光纖束的一根光纖內(nèi)，隨后在所述光纖的出口處聚焦到所述平面內(nèi)，所述每點轉(zhuǎn)而發(fā)射熒光信號，該熒光信號由所述光纖收集，隨后進行檢測和數(shù)字化處理，以形成像素。
共焦特性可通過以下方法獲得使用相同的光路(特別是使用用于空間濾波的同一根光纖)傳輸激發(fā)信號和響應激發(fā)信號而發(fā)射的熒光信號，并使用一個適合使組織內(nèi)的焦點與所述光纖共軛的光學系統(tǒng)。
相應的共焦成像裝置包括柔性的光纖束(通常稱為傳像束)，在它的近端設(shè)有-在一個或多個目標熒光體的激發(fā)波長上以連續(xù)或脈沖地發(fā)光的光源，一般為激光光源；-用以在光源產(chǎn)生的激發(fā)光束的時間內(nèi)、在與傳像束的入射截面對應的XY平面內(nèi)的行和列內(nèi)進行快速掃描的器件；-用以將激發(fā)光束注入某一光纖的器件；-用以檢測熒光信號的器件；以及控制器件，尤其是用于掃描器件的控制器件。
還提供了適于根據(jù)各光纖上連續(xù)檢測到的信號來形成并顯示圖像的器件。
在傳像束的遠端為光學頭，該光學頭設(shè)計成與被觀測的組織相接觸，使激發(fā)光束能夠在給定深度(幾十μm)聚焦，并由此形成皮下像。
在實際應用中，這種裝置尤其具有以下優(yōu)點-在傳像束的遠端只有一個聚焦光學元件，與和掃描器件結(jié)合的光學頭相比，該聚焦光學元件不易碎且成本低，且可獨立于掃描器件考慮這種光學頭的替換；此外，該光學頭可被小型化，這在內(nèi)窺鏡檢查方法中是有利的，且一般會有助于增加定位的精確度；-由柔性光纖制成的傳像束作為通向觀測部位的進入臂(accessarm)，這對于原位原位操作(in situ application)很重要。
本技術(shù)領(lǐng)域中，已經(jīng)描述了下列熒光方法和裝置。
文獻“Applied Optics”，Vol.38，No.34，December 1999，page7133-7144里介紹了一種共焦顯微內(nèi)窺鏡，該共焦顯微內(nèi)窺鏡使用柔性光纖束并在遠端裝配小型光學聚焦頭；為了成行地掃描光纖束，該裝置包括檢測狹縫以及電荷傳送(charge-transfer)型的線性CCD檢測器。使用這類裝置，可每秒獲得4幅圖像(4images/s)，每秒4幅圖像對取決于受治療者和操作者移動的原位成像來說太慢了。此外，成行(而不是逐點)掃描的事實降低了共焦特征，并導致分辨不良的圖像。
文獻“Optics Communication”，188(2001)，page267-273中介紹了一種共焦激光掃描臺式顯微鏡和柔性光纖束的耦合，在光纖束的遠端裝配有小型光學頭。想達到的目的是使顯微鏡和內(nèi)窺鏡兼容。掃描是逐根光纖進行的，但所使用的臺式顯微鏡為標準設(shè)計，該臺式顯微鏡設(shè)計成用來顯示固定樣品，不用關(guān)心獲得圖像所用的時間。該文獻提出了2秒的照射時間，這對于實時原位成像來說太長了。
本發(fā)明的目的是提出一種用于高分辨率光纖熒光成像的方法和裝置，具體是共焦成像，該成像方法使用由光纖制成的傳像束，用連續(xù)發(fā)射的激發(fā)光束對光纖進行逐根掃描，所述方法和裝置可獲得體內(nèi)部位的實時原位顯示，即能夠在不依靠受治療者和操作者移動的情況下，每秒提供足夠數(shù)量的逐點圖像，尤其為了獲得相當快速的檢查。
本發(fā)明的另一目的是提出一種方法和裝置，一般來說，該方法和裝置可優(yōu)化各圖像的質(zhì)量，尤其是為了獲得極好的橫向和軸向分辨率。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提出了一種用于實現(xiàn)共焦熒光體內(nèi)原位成像的方法，該方法使用由數(shù)千根光纖制成的傳像束，并且該方法包括在皮下平面內(nèi)逐點掃描組織，每點對應一個激發(fā)信號，該激發(fā)信號由連續(xù)光源發(fā)射，經(jīng)偏轉(zhuǎn)并注入到所述光纖束的一根光纖內(nèi)，隨后在所述光纖的出口聚焦到所述平面內(nèi)，每點轉(zhuǎn)而發(fā)射熒光信號，該熒光信號由所述光纖收集，隨后進行檢測和數(shù)字化處理，以形成像素，其特征在于以對應于每秒獲得的圖像數(shù)量足以滿足實時使用的速度偏轉(zhuǎn)激發(fā)信號，并以對應于光纖的最小逐根采樣頻率的檢測頻率檢測熒光信號。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提出了一種實現(xiàn)高分辨率熒光成像的方法，該方法使用由數(shù)千根光纖制成的傳像束，激發(fā)信號由連續(xù)光源發(fā)射，依次偏轉(zhuǎn)并注入到所述傳像束的一根光纖內(nèi)，并且響應激發(fā)信號而發(fā)射的熒光信號隨后由用于激發(fā)的同一根光纖所收集，隨后進行檢測和數(shù)字化處理，以形成像素，其特征在于光纖端設(shè)計成處于與要成像的組織的表面直接裸露接觸的狀態(tài)，各光纖適合產(chǎn)生發(fā)散光束，該發(fā)散光束適合激發(fā)位于表面到最大深度之間的組織的微體積(microvolume)，最大深度特別取決于光纖的芯徑，并且，以一對應于每秒獲得的圖像數(shù)量足以滿足實時使用的速度偏轉(zhuǎn)激發(fā)信號，并以對應于對光纖的最小逐根采樣頻率的檢測頻率檢測熒光信號。
因此，這種方法與第一方面的方法的不同之處在于本方法不提供對各光纖出口處聚焦的信號的掃描，而是提供對各光纖出口處的發(fā)散信號的掃描。這種光纖出口處的非聚焦信號可以獲得位于組織表面正下方的一定體積的圖像，可對這些圖像進行處理，從醫(yī)療觀點看它們尤為有利。因為這些圖像不是來源于已進行逐點掃描的皮下截面，所以它們不是“共焦的”，但是由于這些圖像是來自對位于表面正下方的微體積的依次掃描，并且來自用于激發(fā)的同一根光纖對各微體積發(fā)射的熒光信號的空間濾波，所以這些圖像仍可稱作“高分辨率”的。這種裝置的主要優(yōu)點在于對于內(nèi)窺鏡應用，內(nèi)窺鏡探針的直徑可以很小，僅取決于傳像束的直徑，因而取決于內(nèi)窺鏡的光纖數(shù)量。上述情況允許設(shè)計應用領(lǐng)域，例如神經(jīng)學領(lǐng)域，其中內(nèi)窺鏡探針的尺寸是克服光學聚焦頭小型化中內(nèi)在的問題的關(guān)鍵因素。
本發(fā)明提出了一種實現(xiàn)體內(nèi)、原位實時成像的解決方法(在光纖出口聚焦或不聚焦的方法)。本發(fā)明基于對光纖采樣的考慮(根據(jù)香農(nóng)標準)，該采樣可獲得與各光纖有效對應的逐點重構(gòu)的圖像。這種方法避免了當對所有光纖進行逐根采樣同時還維持每秒的最小平均圖像數(shù)時的信息損失，即在實際應用中，對于640×640像素的最大方式，至少每秒12幅圖像?；诖俗钚〔蓸拥年P(guān)系選擇檢測頻率(檢測器的通帶)，使得每根光纖能夠檢測盡可能多的熒光光子數(shù)。
因而，根據(jù)一可能的實施例，使用具有大約30000根柔性光纖的傳像束，采樣頻率和檢測系統(tǒng)(雪崩光電二極管或同等產(chǎn)品)的通帶固定為大約1.5MHz，近似地對應于每根光纖12個像素，因而可以640×640像素的最大方式最少獲得每秒12幅圖像。
在實際應用中，根據(jù)一有利的實施例(該實施例使實現(xiàn)光纖的適當快速掃描而獲得實時圖像成為可能)，光束的偏轉(zhuǎn)通過確定共振“線”反射鏡的快共振頻率和檢流計“幀”反射鏡的慢共振頻率來調(diào)節(jié)。
根據(jù)本發(fā)明，考慮到實時成像的獲取，光纖發(fā)出的流量的檢測周期是受時間限制的，并且該檢測周期很短。因而，本發(fā)明還提供了優(yōu)化部件，以在該有限的檢測周期內(nèi)收集并檢測來自樣品的最大流量，特別是-使用具有一定程度消色差能力的光學偏轉(zhuǎn)部件、光學注入部件以及光學聚焦和光學檢測部件(如果適當)，消色差取決于激發(fā)波長和最大熒光波長之間的波長差以及發(fā)射的熒光信號的譜寬。這種方法的好處是可優(yōu)化在發(fā)射的熒光的整個譜帶上收集的熒光流量；-如果適當，可選擇組織上的聚焦光學元件的數(shù)值孔徑(大約在0.5和1之間)，這種方法可以在光場尺寸和收集光子的數(shù)量之間獲得較好的折衷；以及-選擇要檢測的熒光波長處的量子效率至少為50％的檢測器。
依據(jù)本發(fā)明，為了從被檢測的光子的有限流量獲得高質(zhì)量的圖像，還對隨后對檢測的流量實施的圖像處理進行了優(yōu)化。這種優(yōu)化可通過以下方法實施。
在實時獲取圖像之前，實施一系列步驟-檢測選定的一組要使用的光纖(傳像束的所有光纖或一個選定的子組)的各光纖位置的步驟，該步驟至少在傳像束的每次改變時實施；-校準對各光纖的注入速率的步驟，即規(guī)定對每根光纖的注入率；以及-檢測背景圖像(在無樣品的情況下)的步驟。
在操作過程中，在對檢測信號進行數(shù)字化之后，圖像處理的優(yōu)化具體包括以下步驟以各光纖的注入率的函數(shù)形式進行校正并減去背景圖像之后，限定各光纖所收集的實際流量(即僅來自樣品的流量)，以獲得校正信號；
隨后，根據(jù)該校正信號進行圖像的重構(gòu)，尤其是為了將顯出光纖拼圖的圖像轉(zhuǎn)換成看不到明顯光纖的圖像。
根據(jù)本發(fā)明，最后兩個步驟必須能夠被實時執(zhí)行。至于信號的校正，由于采用適合于觀測信號的結(jié)構(gòu)的處理和一種優(yōu)化算法，信號的校正可實時進行。而圖像的重構(gòu)，可根據(jù)圖像質(zhì)量，通過選擇每個像素的操作次數(shù)來進行。高斯低通濾波(Gaussian low-passfiltering)體現(xiàn)了處理的復雜度結(jié)果質(zhì)量和計算時間之間很好的折衷。
為了節(jié)約時間并增加圖像重構(gòu)所對應的處理的復雜性，還可增加設(shè)備的處理能力，例如，通過使用特定的處理卡和/或并行的體系結(jié)構(gòu)(例如多處理器結(jié)構(gòu))。
本發(fā)明還提出了一種適合于實現(xiàn)上述第一方面的方法的裝置，該裝置包括傳像束；在至少一個目標熒光體的激發(fā)波長上連續(xù)發(fā)光的光源；用于在光源產(chǎn)生激發(fā)光束的時間內(nèi)，在與傳像束的入射截面對應的XY平面內(nèi)逐行和逐列地進行快速掃描的裝置和逐根光纖進行注入的部件；用于分離激發(fā)波長和熒光波長的部件；用于檢測熒光信號的部件；以及用于處理可使圖像得以形成的檢測信號的部件；光學頭設(shè)置在遠端，設(shè)計成可與觀測組織接觸，使激發(fā)光束可被聚焦。
所述裝置的特征在于掃描部件適于以與實時獲得圖像相對應的速度移動激發(fā)光束；以及檢測部件的通帶頻率由其與光纖的最小逐根采樣頻率的關(guān)系加以確定；本發(fā)明還提出了一種用于實現(xiàn)依據(jù)本發(fā)明第二方面的方法的裝置，該裝置包括傳像束；在至少一目標熒光體的激發(fā)波長上連續(xù)發(fā)光的光源；用于在與傳像束的入射截面對應的XY平面上，對光源產(chǎn)生的激發(fā)光束進行快速掃描的部件和逐根光纖注入的部件；用于分離激發(fā)波長和熒光波長的部件；用于檢測熒光信號的部件；以及用于處理可使圖像得以形成的檢測信號的部件；其特征在于各光纖的末端適合于產(chǎn)生發(fā)散光束，并且設(shè)計成處于與要觀測的組織的表面直接裸露接觸的狀態(tài)；并且，掃描部件適于以與實時獲得圖像相對應的速度移動激發(fā)光束，并且所述檢測部件的通帶頻率由其與光纖的最小逐根采樣頻率的關(guān)系加以確定。
根據(jù)后續(xù)的實施例描述并參照附圖，可更好地理解本發(fā)明并且明白其它優(yōu)點。


圖1示意表示一個包括聚焦頭的共焦熒光成像裝置的實施例。
圖2是圖1的裝置的框圖。
圖3示意表示一個高分辨率熒光成像裝置的實施例。
圖4是圖3的裝置的框圖。
根據(jù)圖1和圖2中選擇描述的實例，所述裝置包括光源1；用于對激發(fā)光束整型的部件2；用于分離波長的部件3；掃描部件4；光束注入部件5；由柔性光纖構(gòu)成的傳像束6；光學聚焦頭7；用于抑制激發(fā)光束的部件8；
用于聚焦熒光信號的部件9；用于對熒光信號進行空間濾波的部件10；用于檢測熒光信號的部件11；以及用于對檢測到的熒光信號進行電子和計算機處理并進行顯示的部件12。
下面詳細描述這些不同的單元。
光源1是在某一激發(fā)波長上發(fā)光的激光器，該波長可激發(fā)大范圍的熒光體，例如488nm。為了優(yōu)化進入傳像束6中的一根光纖的注入，激發(fā)光束為圓形，以能夠注入到截面也為圓形的光纖內(nèi)，并且為了優(yōu)化注入率，激光器最好是縱向單模型激光器，以為向輕微多模(slightly multimode)光纖的注入提供盡可能好的波前。激光器以連續(xù)形式或脈沖形式發(fā)光，并且以穩(wěn)定的方式發(fā)光(最小可能噪聲＜1％)?？色@得的輸出功率的量級為20mW。例如，可使用量子阱激光器(VCSEL)、二極管泵浦的固態(tài)激光器、激光二極管或氣體激光器(氬離子激光器)。
用于定形激發(fā)激光束的部件2設(shè)置在光源1的出口。該部件2由放大倍數(shù)不為1的遠焦光學系統(tǒng)組成，該光學系統(tǒng)包括適用于改變激光束直徑的兩個透鏡L1和L2。對放大倍數(shù)進行計算，以使光束的直徑適合于光纖的注入部件5。
隨后，經(jīng)整型的激發(fā)激光束被導向到為分離激發(fā)波長和熒光波長而提供的部件3。例如，該部件3是激發(fā)波長的透過率為98-99％的分色濾光器，并且，該分色濾光器將其它波長光線基本上反射。因而，沿與激發(fā)信號相同的光路(共焦特征)返回的熒光信號幾乎全部傳輸?shù)綑z測光路(8-11)。設(shè)置在檢測光路的抑制部件8用于完全消除向檢測光路傳播的激發(fā)波長488nm的1-2％的干擾反射。(例如，488nm的抑制濾光器，僅允許例如500-600nm的光線透射的帶通濾光器，或允許500nm以上光線透射的高通濾光器)。
隨后，掃描部件4獲得激發(fā)光束。根據(jù)在圖1中選擇描述的實例，這些部件包括在4KHz共振的反射鏡M1，該反射鏡M1用于水平地折射光束，并由此實現(xiàn)圖像的行；在15Hz處檢流的反射鏡M2，該反射鏡M2用于垂直地折射光線，并由此實現(xiàn)圖像的幀；以及兩個具有單一放大率(unitary magnification)的遠焦系統(tǒng)，AF1位于兩個反射鏡之間，AF2位于反射鏡M2之后，這些遠焦系統(tǒng)用于使這兩個反射鏡M1、M2的轉(zhuǎn)動面與一根光纖的注入面共軛。根據(jù)本發(fā)明，確定掃描速度，以使對組織的實時體內(nèi)原位觀測成為可能。為此，掃描必須足夠快，以對于640×640像素的顯示方式，與最慢方式相對應的至少12幅圖像顯示在屏幕上。因而，對于像素較少的顯示方式，每秒所獲得的圖像數(shù)始終大于12圖像/秒。作為本例的變形，掃描部件可具體包括旋轉(zhuǎn)反射鏡、MEMs型集成元件(X和Y掃描鏡)或聲光系統(tǒng)。
在掃描部件的出口處進行折射的激發(fā)光束被導向到光學部件5，以注入到傳像束6的一根光纖內(nèi)。在這種情況下，所述部件5由兩個光學單元E1和E2組成。第一光學單元E1適用于校正掃描部件4的光場邊緣的部分像差，由此優(yōu)化整個光場(中心以及邊緣)上的注入。第二光學單元E2用來進行實際注入。對第二光學單元E2的焦距和數(shù)值孔徑進行選擇，以優(yōu)化傳像束6的光纖的注入率。依據(jù)一個可獲得消色差標準的實施例，第一光學單元E1由一個雙合消色差透鏡構(gòu)成，兩個雙合消色差透鏡中的第二光學單元E2后隨有一個靠近傳像束設(shè)置的透鏡。作為本例的變形，這種注入光學元件可由任何其它類型的標準光學元件(例如兩個三片透鏡)或折射率漸變透鏡或顯微透鏡(然而成本較高)構(gòu)成。
傳像束6由大量(幾萬根)柔性光纖組成，例如30000根直徑為2μm，間距為3.3μm的光纖。在實際應用中，可使用傳像束的整組光纖或者這些光纖的選定的子組(例如，居中的選定子組)。
在光纖的出口處，激發(fā)激光束由光學頭7聚焦到樣品13內(nèi)的一點14上，該點14位于相對樣品表面15的給定深度，該深度位于在幾十μm到大約一百μm之間，該光學頭設(shè)計成位于與樣品表面15相接觸的位置。例如，該深度可為40μm。因此，光學頭可將傳像束輸出的流量聚焦到樣品內(nèi)，并且還收集從樣品返回的熒光流量。光學頭的放大倍數(shù)為2.4，樣品上的數(shù)值孔徑為0.5。選取這兩個參數(shù)，是為了使返回信號只存在于傳輸激發(fā)信號的光纖內(nèi)，不存在于鄰近的光纖內(nèi)，并由此保持利用一根光纖的共焦濾波。利用這些放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑值，軸向分辨率的量級為10μm，橫向分辨率的量級為1.4μm。還可選擇數(shù)值孔徑，以便優(yōu)化回收的光子數(shù)，該光子數(shù)必須盡可能大。光學頭可由具有適于共焦的光學性質(zhì)和色差品質(zhì)(即，使像差最小化)的標準光學元件(雙合透鏡、三合透鏡、非球面透鏡)和/或梯度折射率透鏡(GRIN)和/或衍射透鏡構(gòu)成，否則，特別是會導致光場深度的降低，并由此導致成像裝置的軸向分辨率的降低。光學頭設(shè)計成在操作過程中與樣品13接觸。后者是生物組織或細胞培養(yǎng)物(cell culture)。以注入的熒光體(系統(tǒng)熒光)或通過修改基因由細胞本身產(chǎn)生熒光體(轉(zhuǎn)基因熒光)的方式實現(xiàn)熒光表示。在這兩種情況下，熒光體均在更寬或更窄的譜帶上再發(fā)射光子，該譜帶寬度可在幾十納米到大于一百納米的范圍內(nèi)變化。
在檢測光路上，從抑制濾光器8輸出的熒光信號隨后由部件9(例如，由檢測透鏡構(gòu)成的部件)聚焦到空間濾波部件10的濾波孔內(nèi)。計算檢測透鏡的焦距，以使來自光纖的熒光信號的尺寸與濾波孔相同或略小于濾波孔。后者使得可以僅保留來自被入射光束照射的光纖的熒光。濾光孔使得可以抑制否則會被耦合到與被照射光纖相鄰的光纖內(nèi)的光。計算濾波孔的尺寸，以使光纖的圖像完全適合該濾波孔。在本實施例中，濾波孔為20μm。此外，還是為了優(yōu)化通過濾波孔的光子數(shù)量和由此產(chǎn)生的檢測流量，掃描部件4、注入部件5、光學頭的聚焦部件7以及檢測部件8、9和10按照檢測熒光體作了調(diào)整上述部件被選擇為充分地消像差，以便在最寬的熒光體發(fā)射帶上收集光子。
檢測部件11在被調(diào)查的熒光波長處的靈敏度最大。例如，可使用雪崩光電二極管(APD)或光電倍增管。此外，依據(jù)本發(fā)明，對通帶作了選擇，以優(yōu)化熒光信號的積分時間。該通帶為1.5MHZ，對應于具有各像素上優(yōu)化積分時間的傳像束的最小采樣頻率。
用于控制、分析和數(shù)字化處理檢測信號并進行顯示的電子和計算機部件12包括下述卡-同步卡20，該同步卡用于-以同步方式控制掃描，即控制行反射鏡M1和幀反射鏡M2的移動；-在任意時刻獲知這樣被掃描的激光點的位置；以及-并通過其自身可被控制的微控制器管理所有其它的卡；-檢測器卡21，該檢測器卡包括具體進行阻抗匹配的模擬電路、模-數(shù)轉(zhuǎn)換器以及對信號進行整型的可編程邏輯元件(例如，F(xiàn)PGA電路)；-數(shù)字獲取卡22，該數(shù)字獲取卡22適于以可變頻率處理數(shù)字數(shù)據(jù)流(flux of digital data)及其在屏幕23上的顯示；以及-圖形卡24。
作為本例的變形，可使用結(jié)合這些不同卡的功能的單個卡。
通過以下方式進行圖像處理。
當傳像束放置在所述裝置內(nèi)時，實施第一操作，以確認傳像束中的光纖的設(shè)計結(jié)構(gòu)(design)，并由此獲知要使用的各光纖的實際位置。
在使用所述裝置前，還實施以下操作-用均勻樣品確定各光纖的注入率，各光纖之間的這種注入率可發(fā)生變化。
-測量背景圖像，該測量在沒有樣品的情況下進行。
可以根據(jù)裝置使用的頻度來定期執(zhí)行這兩項操作。所獲得的結(jié)果將用于對檢測器卡輸出的數(shù)字信號的操作中的校正。
根據(jù)發(fā)明2，在操作過程中，在探測器卡輸出的數(shù)字信號上實施處理組第一組處理存在于校正數(shù)字信號的第一步，尤其是為了考慮所述信號來自的光纖的實際注入率，并為了從該信號上減去與背景圖像相對應的那部分流量。這樣可以僅處理與觀測樣品真正對應的信號。對于該處理組，使用一種標準計算算法，該算法可進行優(yōu)化，以顧及實時這一約束條件。
隨后，第二組包括從校正的信號中重構(gòu)數(shù)字圖像，該圖像由醫(yī)生來顯示。所實施的處理的目的是為顯示器提供重構(gòu)的數(shù)字圖像，該數(shù)字圖像不是分別與并排放置的光纖的校正的數(shù)字信號對應的像素的簡單拼圖，而是提供不再顯示光纖的重構(gòu)數(shù)字圖像。為此，使用在各像素上實施一定數(shù)量的操作的算法，選擇該算法是為了滿足實時這一約束條件，即，該算法必須在所需操作的復雜性、可獲得的結(jié)果質(zhì)量和計算時間之間體現(xiàn)很好的折衷。例如，可使用高斯低通濾波算法。
該裝置進行如下操作光源1產(chǎn)生波長為488nm的圓形平行激發(fā)光束，該光束隨后在遠焦系統(tǒng)2中進行整型，以給出盡可能最大地注入到光纖纖芯的適當尺寸。該光束隨后送入到分色分離系統(tǒng)3中，該系統(tǒng)反射激發(fā)波長。隨后，由反射鏡的光機掃描系統(tǒng)4成角度地將入射光束經(jīng)時間反射到空間內(nèi)的兩個方向上，并利用光學注入部件5將入射光束注入到傳像束6的光纖的一根光纖內(nèi)。電子部件12用于控制在一給定時刻傳像束光纖中一個光纖的注入，通過反射鏡在給定行上逐點偏轉(zhuǎn)光束角度，并逐行地進行地，以構(gòu)成圖像。在傳像束的出口，通過光學頭7將從被注入的光纖射出的光聚焦到位于給定深度的一點處，該給定深度在大約幾十μm和大約一百μm之間。由于掃描，樣品被逐點照射。因而，在每一時刻，光點照射的組織發(fā)射其特征為向較大波長方向偏移的熒光信號。由光學頭7獲取該熒光信號，隨后，該熒光信號沿激發(fā)光束的反向光路傳輸?shù)椒稚珵V光器3，該分色濾光器將熒光信號傳輸?shù)綑z測光路。隨后，在激發(fā)波長處形成的干擾反射由抑制濾光器8抑制。最后，熒光信號聚焦到濾光孔10，以只選擇來自受激光纖的光，并通過雪崩光電二級管11檢測光子。隨后，檢測信號被數(shù)字化并進行校正。使用上述的圖像處理方法對檢測信號逐一進行實時處理，以能夠?qū)崟r地重構(gòu)在屏幕上顯示的圖像。
根據(jù)圖3和4中選擇描述的實施例，除了光學聚焦頭7外，該裝置包括的部件與圖1和圖2的裝置相同。在這些附圖中，相同的部件使用相同的附圖標記，因此，在本實施例中不再詳細描述。
該裝置使用的傳像束6可由大約5000-100000根柔性光纖制成，光纖數(shù)取決于所想要的傳像束的外徑，外徑本身決定于預期的應用(內(nèi)窺鏡檢查法、所要求的光場尺寸等)。例如，它們可為FUJIKURA銷售的傳像束。光纖的芯徑最好在1到4μm之間。對于空氣中的數(shù)值孔徑為0.42的情況，這種芯徑會導致光束在光纖的出口處的發(fā)散角大約是18°?？赏ㄟ^拉伸整個傳像束的端部的方法獲得1μm的芯徑。傳像束6的端部被拋光，并且不包含光學部件。拋光的目的是給出傳像束表面，因而使裸光纖與組織接觸，相同的表面條件一方面可使獲得的圖像背景盡可能均勻，另一方面，抑制光纖與組織的任何粘著問題，光纖與組織的粘著將破壞組織。拋光面可光滑或修圓，以便適應組織的形狀。各光纖的數(shù)值孔徑最好選擇得盡可能大(即，例如0.42)，以收集最多的熒光光子。芯間距給出獲得圖像的橫向分辨率(圖像的兩點之間的距離)。該芯間距越小，分辨率越高，但是這會損害要成像的光場的尺寸。因而，應該在傳像束的光纖數(shù)和光纖間的芯間距之間找到較好的折衷辦法，以獲得具有適于觀測所要求的組織的光場尺寸的較好的橫向分辨率(2-8μm)。
下面給出本發(fā)明適用的兩例傳像束
DCT數(shù)據(jù)儲存在塊層。它先從比特流(VLC)解碼，使用曲折或交互掃描模式而逆向掃描，然后反量化。內(nèi)部DC系數(shù)可從dct_dc_differential和預測器(預測器可根據(jù)MPEG-2規(guī)格而重新設(shè)定)決定。在跳越宏塊中的DCT系數(shù)設(shè)定成零。
權(quán)利要求
1.一種用于實現(xiàn)共焦熒光體內(nèi)原位成像的方法，該方法使用由數(shù)千根光纖制成的傳像束，并包括在皮下平面內(nèi)逐點掃描組織，每點對應一個激發(fā)信號，該激發(fā)信號由連續(xù)光源發(fā)射，經(jīng)偏轉(zhuǎn)并注入到所述光纖束的一根光纖內(nèi)，隨后在所述光纖的出口聚焦到所述平面內(nèi)，每點轉(zhuǎn)而發(fā)射熒光信號，所述熒光信號由所述光纖收集，隨后進行檢測和數(shù)字化處理，以形成像素，其特征在于以與每秒獲得的圖像數(shù)量充分滿足實時使用相對應的速度偏轉(zhuǎn)激發(fā)信號，并以與光纖的最小逐根采樣頻率相對應的檢測頻率檢測熒光信號。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于聚焦光學元件的數(shù)值孔徑大約在0.5到1之間。
3.一種用于實現(xiàn)高分辨率熒光成像的方法，該方法使用由數(shù)千根光纖制成的傳像束，激發(fā)信號由連續(xù)光源發(fā)射，依次偏轉(zhuǎn)并注入到所述傳像束的一根光纖內(nèi)，并且響應激發(fā)信號而發(fā)射的熒光信號由用于激發(fā)的同一根光纖所收集，隨后進行檢測和數(shù)字化處理，以形成像素，其特征在于光纖端設(shè)計成用來與要成像的組織的表面直接裸露接觸，各光纖適合產(chǎn)生發(fā)散光束，所述發(fā)散光束適合激發(fā)位于表面到最大深度之間的組織的微體積，最大深度特別取決于光纖的芯徑，并且，以與每秒獲得的圖像數(shù)量充分滿足實時使用相對應的速度偏轉(zhuǎn)激發(fā)信號，并以與對光纖的最小逐根采樣頻率相對應的檢測頻率檢測熒光信號。
4.如上述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其特征在于，通過確定共振線反射鏡的快速共振頻率和檢流計式幀反射鏡的慢速共振頻率來調(diào)節(jié)所述激發(fā)光束的偏轉(zhuǎn)速度。
5.如上述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其特征在于，所使用的光學偏轉(zhuǎn)部件、光學注入部件、光學聚焦部件和光學檢測部件存在一定程度的消色差，所述一定程度的消色差使得在受激熒光體的整個發(fā)射帶上收集光子成為可能。
6.如上述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其特征在于，要檢測的熒光波長處的檢測量子效率至少為50％。
7.如上述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其特征在于，包括檢測要被使用的所述傳像束光纖的位置的預先步驟。
8.如上述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其特征在于，包括確定針對每一根光纖的實際注入率的預先步驟。
9.如上述權(quán)利要求中任意一項所述的方法，其特征在于，包括確定與背景圖像相對應的被收集光通量的預先步驟。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，包括通過減去與背景圖像相對應的光通量并調(diào)整光纖實際注入率來校正來自光纖的數(shù)字信號的步驟。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，包括從經(jīng)校正的信號重構(gòu)圖像的步驟。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述重構(gòu)圖像的步驟包括高斯低通濾波。
13.一種用于原位體內(nèi)光纖光學共焦熒光成像的裝置，所述裝置用于實施如權(quán)利要求1、2、4-12中任意一項所述的方法，所述裝置包括傳像束(6)；在至少一目標熒光體的激發(fā)波長處連續(xù)發(fā)光的光源(1)；用于在所述光源(1)產(chǎn)生的激發(fā)光束的期間，在與所述傳像束(6)的入射截面對應的XY平面上逐行并逐列地快速掃描的部件(4)和逐根光纖注入的部件(5)；用于分離激發(fā)波長和熒光波長的部件(3)；用于檢測熒光信號的部件(11)，以及用于處理檢測信號而使圖像能夠?qū)崿F(xiàn)的部件(12)；配置在遠端的光學頭(7)，所述光學頭(7)設(shè)計成用來與被觀測的組織(13)相接觸，讓所述激發(fā)光束聚焦，其特征在于所述掃描部件適于以與原位圖像的獲得相對應的速度移動所述激發(fā)光束；以及所述檢測部件具有一通帶，所述通帶根據(jù)光纖的最小逐根采樣頻率來確定。
14.用于原位體內(nèi)高分辨率光纖共焦熒光成像的裝置，所述裝置用于實施如權(quán)利要求3-12中任意一項所述的方法，所述裝置包括傳像束(6)；在至少一目標熒光體的激發(fā)波長處連續(xù)發(fā)光的光源(1)；用于在與所述傳像束(6)入射截面對應的XY平面內(nèi)，對所述光源(1)產(chǎn)生的激發(fā)光束進行快速掃描的部件(4)和逐根光纖注入的部件(5)；用于分離激發(fā)波長和熒光波長的部件(3)；用于檢測熒光信號的部件(11)；以及用于處理檢測信號而使圖像能夠?qū)崿F(xiàn)的部件(12)；其特征在于各光纖的端部適合于產(chǎn)生發(fā)散射束，并且所述端部設(shè)計成用以與要觀測的組織的表面直接裸露接觸；所述掃描部件適于以與原位圖像的獲得相對應的速度移動所述激發(fā)光束；以及所述檢測部件具有一通帶，所述通帶根據(jù)光纖的最小逐根采樣頻率來確定。
15.如權(quán)利要求13或14所述的裝置，其特征在于，所述光源(1)產(chǎn)生的激發(fā)光束是縱向單模光束，所述縱向單模光束提供最適于注入到輕微多模光纖中的波前質(zhì)量。
16.如權(quán)利要求13-15中任意一項所述的裝置，其特征在于，光纖的橫截面為圓形，所述光源產(chǎn)生的激發(fā)光束為圓形，以優(yōu)化各光纖的注入。
17.如權(quán)利要求13-16中任意一項所述的裝置，其特征在于，在所述光源(1)的出口處設(shè)有將所述光束整形的部件(2)，對激發(fā)光束進行整形而使所述激發(fā)光束適合所述傳像束(6)的注入部件(5)。
18.如權(quán)利要求13-17中任意一項所述的裝置，其特征在于，用于分離所述激發(fā)波長和熒光波長的部件中，包括在所述激發(fā)波長處具有最大效率的分色濾光器(3)。
19.如權(quán)利要求13-18中任意一項所述的裝置，其特征在于，抑制部件(8)設(shè)置在所述檢測部件(11)的上游，適于消除所述激發(fā)波長。
20.如權(quán)利要求13-19中任意一項所述的裝置，其特征在于，所述掃描部件(4)包括共振線反射鏡(M1)、檢流計式幀反射鏡(M2)、第一遠焦光學系統(tǒng)(AF1)、第二遠焦系統(tǒng)(AF2)，所述第一遠焦光學系統(tǒng)具有單一放大率，適合于使兩個所述反射鏡共軛，所述第二遠焦系統(tǒng)具有單一放大率，適合于使兩個所述反射鏡的轉(zhuǎn)動面與所述光纖中的一根光纖的注入面共軛。
21.如權(quán)利要求13-20中任意一項所述的裝置，其特征在于，所述光學頭(7)、掃描部件(4)、注入部件(5)和檢測部件提供適合于在所述熒光信號的整個譜帶寬度上收集光子的一定程度的消色差。
22.如權(quán)利要求13-21中任意一項所述的裝置，其特征在于，所述注入部件(5)包括兩個光學單元(E1、E2)，所述第一光學單元(E1)適合于校正所述掃描部件(4)的光場邊緣的像差，并且所述第二光學單元(E2)適合于進行對所述傳像束(6)的光纖的一根光纖的實際注入。
23.如權(quán)利要求22所述的裝置，其特征在于，所述第一光學單元(E1)包括一個雙合透鏡，并且所述第二光學單元(E2)包括兩個雙合透鏡，且后隨一個透鏡。
24.如權(quán)利要求13-23中任意一項所述的裝置，其特征在于，在所述檢測器(11)的前面放置一濾光孔(10)，選擇所述濾光孔(10)的直徑，以使一根光纖的圖像通過所述濾光孔(10)。
25.如權(quán)利要求24所述的裝置，其特征在于，設(shè)有用以將所述熒光信號聚焦到所述濾光孔(10)上的部件(9)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用傳像束方法，該傳像束包括數(shù)千根光纖，激發(fā)信號由光源發(fā)射，依次偏轉(zhuǎn)并注入到所述傳像束的光纖內(nèi)。在光纖輸出中的人體組織的各激發(fā)點轉(zhuǎn)而發(fā)射熒光信號，該熒光信號由所述光纖收集，隨后，經(jīng)探測以及數(shù)字化處理，形成像素。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，所述方法用以在光纖輸出內(nèi)聚焦光束，以激發(fā)表皮下平面，產(chǎn)生共焦圖像。根據(jù)第二方面，所述方法用以在光纖輸出中產(chǎn)生發(fā)散光束，該光束能夠從表皮開始激發(fā)組織的微體積。本發(fā)明的特征在于所述方法是以一定速度偏轉(zhuǎn)激發(fā)信號，該速度對應于每秒獲得的圖像數(shù)足夠?qū)崟r使用，并以一定探測頻率探測熒光信號，該探測頻率對應于最小的對光纖逐根采樣的頻率。本發(fā)明使得體內(nèi)原位實時成像的實現(xiàn)成為可能。
文檔編號G02B26/10GK1681432SQ03821815
公開日2005年10月12日 申請日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月18日
發(fā)明者M·格內(nèi)特, B·維伊勒羅貝, F·伯里爾, S·克拉德 申請人:莫納基技術(shù)公司