專(zhuān)利名稱(chēng)：一株乙羧氟草醚降解芽孢桿菌fc12及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域，是利用微生物的方法降解化學(xué)農(nóng)藥，適用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工，具體涉及一株乙羧氟草醚降解芽孢桿菌FC12及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
含氟農(nóng)藥是近幾十年來(lái)使用的新興農(nóng)藥。氟原子具有半徑小、電負(fù)性大的特點(diǎn)，將氟原子和含氟基團(tuán)(如:_CF3)引入到具有生物活性的有機(jī)化合物中，能大大提高有機(jī)氟化物的穩(wěn)定性和生理活性，從而成為當(dāng)今研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。但含氟農(nóng)藥大量使用導(dǎo)致此類(lèi)農(nóng)藥在土壤和水體環(huán)境中的殘留，可能會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康構(gòu)成潛在威脅，因此含氟農(nóng)藥在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化和分解等環(huán)境行為正受到日益關(guān)注。乙羧氟草醚(Fluoroglycofen-ethyl),是由美國(guó)羅姆-哈斯公司開(kāi)發(fā)的一種二苯醚類(lèi)除草劑，具有較高脂溶性和疏水性。該除草劑為觸殺型，主要用于禾谷類(lèi)作物防除闊葉雜草，具有活性高、殺草譜廣、毒性低的特點(diǎn)，是一種很有市場(chǎng)前景的三氟甲基二苯醚類(lèi)除草劑。它通過(guò)雜草莖葉吸收后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物溢出，對(duì)植物組織產(chǎn)生物理性傷害，最終導(dǎo)致死亡，可用于防除小麥、大麥、花生、大豆和稻田的苗后闊葉雜草等。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)乙羧氟草醚在環(huán)境中降解動(dòng)態(tài)方面的研究不多，而生物修復(fù)技術(shù)因微生物本身能對(duì)各類(lèi)不同的有機(jī)污染物進(jìn)行降解和轉(zhuǎn)化而具有巨大的潛力。因此，從自然環(huán)境中篩選得到能夠去除乙羧氟草醚的有效菌種具有重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問(wèn)題和需求，開(kāi)發(fā)研制出一種新型的農(nóng)藥殘留降解菌劑，使用本菌劑可以使乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、三氟羧草醚等二苯醚類(lèi)含氟除草劑的殘留量降低90%以上·。具有較廣的降解譜，生產(chǎn)和使用成本較低。使用該降解菌劑可以在農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)過(guò)程中正常使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行病蟲(chóng)害防治而保證農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留含量符合綠色食品要求。本發(fā)明提供一種消除乙羧氟草醚殘留的降解菌，其菌株FC12是一株革蘭氏染色反應(yīng)陰性菌，于2013年4月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)CGMCC N0.7439，經(jīng)鑒定是芽孢桿菌屬(Bacillus sp.) 0主要生物學(xué)特性為G-，直桿狀，芽孢橢圓，周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，大小0.5^2.5X1.2 10μπι;接觸酶陽(yáng)性；氧化酶陰性；能水解淀粉，液化明膠。該菌能以乙羧氟草醚為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。本發(fā)明提供了芽孢桿菌FC12在乙羧氟草醚降解中的應(yīng)用。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)條件下乙羧氟草醚的降解率達(dá)90%以上。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。本發(fā)明提供了含有所述芽孢桿菌FC12的菌劑。本發(fā)明還提供了所述芽孢桿菌FC12生產(chǎn)菌劑的方法。
所述芽孢桿菌FC12生產(chǎn)菌劑的方法，包括:斜面種一搖瓶種一種子罐一生產(chǎn)罐一產(chǎn)品，所述產(chǎn)品的包裝劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑。所述生產(chǎn)菌劑的方法，具體為:
1)將乙羧氟草醚殘留的芽孢桿菌FC12的試管種接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)
期；
2)將步驟I)培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即種子液。3)將步驟2)所述種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同，發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液即為菌劑。步驟I)中所述的LB培養(yǎng)基配方為=NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉
5.00g/L, pH7.0。步驟2)所述的種子罐所用的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖0.8%，(NH4) 2S04 1%，K2HPO4
0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%,酵母膏 0.02%, pH 值 7.2-7.5。步驟2)所述種子罐和步驟3)所述的生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中，無(wú)菌空氣的通氣量為
1:0.6-1.2，攪拌速度為18 0-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30_35°C，步驟2和3的整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)。所述菌劑在乙羧氟草醚降解中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的芽孢桿菌FC12具有較廣的降解譜，能使土壤中乙羧氟草醚的殘留量降低90%以上，大大降低了生產(chǎn)和使用過(guò)程中的工作量，降低了生產(chǎn)和使用成本。所制備的菌劑具有生產(chǎn)使用成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合在全國(guó)糧油蔬菜生產(chǎn)出口基地或有綠色食品商標(biāo)標(biāo)志的地方大面積推廣使用。本發(fā)明對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人類(lèi)的身體健康，提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值具有重要的意義。使用該降解菌劑可以在農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)過(guò)程中正常使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行病蟲(chóng)害防治而保證農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留含量符合綠色食品要求。田間試驗(yàn)表明，用本發(fā)明生產(chǎn)的降解菌劑直接施用于土壤，可使土壤中農(nóng)藥殘留量降低90%以上。本發(fā)明成功地解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥殘留超標(biāo)和除草劑藥害問(wèn)題，既充分發(fā)揮了化學(xué)農(nóng)藥在植物病蟲(chóng)草害防治中的高效快速的作用，又可以生產(chǎn)出無(wú)毒無(wú)公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品。


圖1本發(fā)明所述的芽孢桿菌FC12的菌落照片；
圖2本發(fā)明所述的芽孢桿菌FC12的結(jié)晶紫染色照片；
圖3本發(fā)明所述的芽孢桿菌FC12的搖瓶降解 圖4含有芽孢桿菌FC12菌劑的田間降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
實(shí)施例1乙羧氟草醚降解芽孢桿菌FC12的篩選和分離
取從生產(chǎn)乙羧氟草醚的某農(nóng)藥廠(chǎng)生產(chǎn)車(chē)間的廢水處理池中得到的活性污泥3.0ml加入乙羧氟草醚濃度為100mg/L的IOOml無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)中，其配方為:每升含1.50 gK2HPO4^0.50 g KH2PO4^0.20 g MgSO4.7H20、1.00 g NaClU.00 g (NH4)2SO4, pH 7.0，于160r/min, 30°C條件下振蕩培養(yǎng)，每隔5天按3%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接5次。取上面得到的富集菌液1.0ml，加 入9.0ml無(wú)菌水中，配成KT1的富集液，再吸取
1.0ml配好的KT1的富集液加入9.0ml無(wú)菌水中，充分混勻配成10_2的富集液，以此類(lèi)推，對(duì)富集液進(jìn)行梯度稀釋。以此類(lèi)推，對(duì)富集液進(jìn)行梯度稀釋。吸取各梯度的稀釋液0.1ml涂布于含乙羧氟草醚的濃度為100mg/L無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基(配方為:每升含1.50g K2HPO4,0.50g KH2P04、0.20g MgSO4.7H20、1.00g NaCl ,1.0Og (NH4) 2S04,20.0Og 瓊脂，pH 7.0)上，30°C培養(yǎng)7天。7天后從以上的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，于3.0ml的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，LB液體培養(yǎng)基配方為=NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉
5.00g/L, pH7.0于8000r/min的條件下離心2min,倒去上清液,加入3.0ml的無(wú)菌水搖勻，仍于8000r/min的條件下離心2min,按此方法用無(wú)菌水洗兩遍后,加入3.0ml無(wú)菌水重懸該菌。吸取1.0ml該菌液加入IOOml乙羧氟草醚濃度為100mg/l的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于160r/min, 30°C條件下振蕩培養(yǎng)4天后，用高效液相色譜測(cè)其降解效果。將降解效率較高的一株囷株保存，進(jìn)彳丁后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將降解菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，其配方為=NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.0Og/L,酵母粉5.00g/L，瓊脂20.00g/L，pH7.0，30°C恒溫培養(yǎng)48h后觀察菌落形態(tài)，用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)(1000X)。菌株的生理生化鑒定按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行。其菌落圖片見(jiàn)圖1，鑒定為芽孢桿菌屬577.);命名為:FC12。其結(jié)晶紫染色照片見(jiàn)圖2所示，主要主要生物學(xué)特性為G-，直桿狀，芽孢橢圓，周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，大小0.5^2.5X1.2 10μπι ;接觸酶陽(yáng)性；氧化酶陰性；能水解淀粉，液化明膠。實(shí)施例2芽孢桿菌FC12的搖瓶降解實(shí)驗(yàn)
在含100mg/L乙羧氟草醚的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，其配方為:每升含1.50 g K2HP04、0.50gKH2P04、0.20g MgSO4.7H20、1.00g NaCl,1.0Og (NH4)2SO4, pH 7.0，按 3% 的接種量接種YS-03，于30°C振蕩培養(yǎng)，48小時(shí)取樣測(cè)定。與空白相比，由圖3可以看出，處理樣品的吸收峰明顯下降，乙羧氟草醚被降解90%以上。實(shí)施例3含有芽孢桿菌FC12菌劑的制備
將實(shí)施例1篩選和分離的乙羧氟草醚降解芽孢桿菌FC12的原種在培養(yǎng)皿上活化，并測(cè)定降解性能，接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200ml LB培養(yǎng)基的1000ml搖瓶中，LB培養(yǎng)基配方為:酵母膏5.00g/L，蛋白胨10.00g/L, NaCl 10.00g/L, pH 7.0，恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，準(zhǔn)備接種種子罐。種子罐500升，投料量400升，培養(yǎng)基配方為:葡萄糖0.8%, (NH4) 2S04 1%，K2HPO4 0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%，酵母膏 0.02%, pH值7.2-7.5。投料完畢后121 °C高壓濕熱滅菌，冷卻至33°C后，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，攪拌速度為220轉(zhuǎn)/分，無(wú)菌空氣通入量為1:0.8。將到達(dá)對(duì)數(shù)期的種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的生產(chǎn)罐1.1kg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35°C以下，通無(wú)菌空氣保持無(wú)菌狀態(tài)備用。接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在35°C，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)菌空氣的通氣量為1: 1.2，攪拌速度為240轉(zhuǎn)/分，整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為60小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。實(shí)施例4含有芽孢桿菌FC12菌劑的制備
將實(shí)施例1篩選和分離的乙羧氟草醚降解芽孢桿菌FC12的原種在培養(yǎng)皿上活化，并測(cè)定降解性能，接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200ml LB培養(yǎng)基的1000ml搖瓶中，LB培養(yǎng)基配方為:酵母膏5.00g/L，蛋白胨10.00g/L, NaCl 10.00g/L, pH 7.0，恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，準(zhǔn)備接種種子罐。種子罐500升，投料量400升，培養(yǎng)基配方為:葡萄糖0.8%, (NH4) 2S04 1%，K2HPO4 0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO3 0.3%，酵母膏 0.02%, pH值7.2-7.5。投料完畢后121°C高壓濕熱滅菌，冷卻至30°C后，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分，無(wú)菌空氣通入量為1:1。將到達(dá)對(duì)數(shù)期的種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的生產(chǎn)罐1.1 kg/cm2的壓力下，121°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35°C以下，通無(wú)菌空氣保持無(wú)菌狀態(tài)備用。接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在30°C，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)菌空氣的通氣量為1:0.6，攪拌速度為180轉(zhuǎn)/分，整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型。實(shí)施例5含有芽孢桿菌FC12菌劑的田間實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)用大田為I塊尺寸為IOmX IOm的耕作土壤,對(duì)耕作層土壤松土(松土深度大約20cm)、整平備用。對(duì)此耕作土壤施用乙羧氟草醚原藥，使乙羧氟草醚初始濃度為50mg/kg，攪拌均勻，噴施含lg/L的葡萄糖水溶液使其含水量達(dá)到飽和含水量的60%。然后將1#田平均劃分為6塊，向其中3塊分別加入實(shí)施例3制備的菌劑60g ;另外3塊分別加入同體積的滅菌處理(12rC，30min)的實(shí)施例3制備的菌劑。共兩種處理，每個(gè)處理均是三個(gè)重復(fù)。分別于5d、10d、15d、20d、25d、30d后取樣測(cè)定乙羧氟草醚在土壤中的降解率。由圖4可知，加入菌體后，加入未滅活的菌劑的土壤中乙羧氟草醚降解明顯，降解率可達(dá)96%，加入滅活后的菌劑的土壤中乙羧氟草醚沒(méi)有明顯降解。實(shí)施例4所述方法制備的菌劑，經(jīng)過(guò)實(shí)施例5所述的方法，具有同樣的效 果，降解率可達(dá)92%。
權(quán)利要求
1.一株乙羧氟草醚降解芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)菌株FC12，其保藏編號(hào)為CGMCCN0.7439。
2.權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌FC12在乙羧氟草醚降解中的應(yīng)用。
3.一種含有權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌FC12的菌劑。
4.權(quán)利要求3所述的含有芽孢桿菌FC12的菌劑在乙羧氟草醚降解中的應(yīng)用。
5.—種權(quán)利要求3所述的含有芽孢桿菌FC12的菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟: 將乙羧氟草醚殘留的芽孢桿菌FC12的試管種接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期； 將步驟I)培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即種子液； 將步驟2)所述種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同，發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液即為菌劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟I)中所述的LB培養(yǎng)基配方為=NaCll0.00g/L,蛋白胨 10.00g/L，酵母粉 5.00g/L，ρΗ7.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟2)所述的種子罐所用的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖 0.8%, (NH4) 2S04 1%，K2HPO4 0.2%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.01%, CaCO30.3%，酵母膏 0.02%, pH 值 7.2-7.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于:步驟2)所述種子罐和步驟 3)所述的生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中，無(wú)菌空氣的通氣量為1:0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30-35°C，步驟2與步驟3的整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種消除廢水中乙羧氟草醚殘留的降解菌劑，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域。所用菌株為革蘭氏染色反應(yīng)陰性菌FC12，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。主要生物學(xué)特性為G-，直桿狀，芽孢橢圓，周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，大小0.5~2.5×1.2~10μm；接觸酶陽(yáng)性；氧化酶陰性；能水解淀粉，液化明膠。降解菌產(chǎn)品直接施用可使水中農(nóng)藥殘留量降低90％上。
文檔編號(hào)A62D3/02GK103232965SQ20131020339
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月28日
發(fā)明者于國(guó)權(quán), 周汝祥, 杜剛, 呂良忠 申請(qǐng)人:江蘇長(zhǎng)青農(nóng)化股份有限公司