專利名稱：一株克雷伯氏菌株及其處理土壤和果蔬表面毒死蜱農(nóng)藥殘留的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于環(huán)境微生物修復技術領域，具體涉及到克雷伯氏dsp-B菌株及其處理土壤和果蔬表面毒死蜱農(nóng)藥殘留的方法。
背景技術：
水果、蔬菜是人們必不可少的生活必需品，農(nóng)藥是果蔬生產(chǎn)過程中防止病蟲草害、 保證其質(zhì)量必不可少的選擇。但是，近年來，蔬菜的質(zhì)量安全問題，特別是蔬果中的殘留農(nóng)藥導致的中毒相繼進入人們的視野，如福州“毒李子”事件、福建安溪“毒空心菜”事件、海南“毒豇豆”事件、廣西“毒白菜”事件。果蔬中的農(nóng)藥殘留不僅危害著人的健康，而且嚴重制約了我國的農(nóng)產(chǎn)品出口。2005年，中國農(nóng)產(chǎn)品出口達271. 8億美元，同比增長17.7%。但與此同時，我國有90%的農(nóng)業(yè)及食品出口企業(yè)受國外綠色壁壘措施的影響，每年損失約90 億美元。因此，尋求高效、安全、經(jīng)濟的農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留處理已成為科研工作者亟待解決的科研命題。農(nóng)藥殘留及其廢水的降解主要有微生物降解、化學降解和光降解等方式。微生物能夠通過各種生物化學作用將壞境中的有機污染物轉(zhuǎn)化為(X)2和H2O等無毒或毒性較小的物質(zhì)。與物理、化學降解方式相比，微生物降解具有操作簡單、降解徹底、無二次污染等優(yōu)點。因此利用微生物技術處理農(nóng)藥殘留，并對受污染的土壤與水體進行生物修復是一種行之有效的方法。毒死蜱是甲胺磷和甲基對硫磷等高效農(nóng)藥的新型高效、低毒替代品種，作為一種廣譜型有機磷酸酯類殺蟲劑，被廣泛用于農(nóng)業(yè)和城市衛(wèi)生害蟲的防治。由于其大量頻繁使用和它的持久性，在水體、土壤、和植物等環(huán)境樣品中大量檢出毒死蜱殘留。毒死蜱屬中度毒性殺蟲劑，能抑制人體膽堿酯酶活性，蓄積于神經(jīng)系統(tǒng)后導致惡心、頭暈、甚至神志不清，高濃度暴露可造成呼吸麻痹和死亡。因此，尋找一種去除環(huán)境中毒死蜱農(nóng)藥殘留高效安全的方法成為關注的焦點，而利用毒死蜱高效降解菌劑應用于其污染環(huán)境的治理具有重要的現(xiàn)實意義和應用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥殘留污染的實際問題和需要，提供一種毒死蜱殺蟲劑降解菌。本發(fā)明的另一目的是提供了使用毒死蜱降解菌制備油包水菌劑的方法，從而通過緩釋作用緩慢維持菌種營養(yǎng)物質(zhì)的供給，大大延長產(chǎn)品的保質(zhì)期，使用本菌劑產(chǎn)品可以使毒死蜱殘留量降低85%左右，且生產(chǎn)成本低廉，使用方便，具有廣闊的市場前
旦
ο技術方案
本發(fā)明提供一種毒死蜱降解菌，該菌株為革蘭氏染色陰性的克雷伯氏菌屬 (Klebsiella sp.)，主要生物學特性為G_，兼性厭氧菌，菌體呈球桿狀，單個、成對或短鏈狀排列，長0. 8-1. 2 μ m，寬2. 0-2. 4 μ m,不運動，有莢膜，不形成芽孢。在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12h的菌落直徑為0. 5mm，呈半球形，半透明，濕潤，表面光滑，電鏡照片如圖1所示；能利用檸檬酸鹽和葡萄糖作為唯一碳源，氨作為氮源；發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；甲基紅實驗呈陰性；VP反應顯陽性；三塘鐵瓊脂試驗不產(chǎn)生硫化氫。該菌株16SrDNA的Genbank登錄號為HQ836365。能利用毒死蜱為唯一碳源和能源進行生長，將其徹底礦化為C02和水及簡單的無機化合物。 在實驗室條件搖瓶試驗中，毒死蜱降解率達85%以上。該菌的最適生長pH為7. 0-7. 2，最適生長溫度為35°C。該降解菌可以通過發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設備進行生產(chǎn)，成本低廉，菌劑直接噴灑使用方便，易于推廣大規(guī)模應用；
使用上述毒死蜱降解菌生產(chǎn)菌劑產(chǎn)品的工藝流程為斜面種一藥瓶種子液一種子罐一發(fā)酵罐一菌劑產(chǎn)品；
本發(fā)明的詳細實施步驟為
(1)挑取毒死蜱殘留降解菌Klebsiellasp . dsp_B的單菌落接種于試管斜面；
(2)將毒死蜱殘留降解菌dsp-B的斜面種接種于LB培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期；
(3)將上述培養(yǎng)好的菌液按15%體積接種量轉(zhuǎn)入種子罐，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期；
(4)將達到對數(shù)生長期的種子液按15%的接種量接入生產(chǎn)罐中培養(yǎng)；
(5)發(fā)酵完成后將細菌培養(yǎng)液制成油包水劑型，并用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型產(chǎn)品；
步驟2中所述LB培養(yǎng)基配方為酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L, pH 7. 0-7. 2 ；
步驟3與4中種子罐和發(fā)酵罐的培養(yǎng)基相同，配方為葡萄糖5g/L，NH4NO3 10g/L ,K2HPO4 2 g/L, MgSO4*7H20 0.5 g/L, Na2HPO4 2 g/L, CaCO3 3g/L，NaCl 1.0 g/L，酵母膏 0.5 g/L，pH :7. 0-7. 2 ；
種子罐和發(fā)酵罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:0. 8-1. 5，攪拌速度為150-220 轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為^_35°C，全程培養(yǎng)時間為48-72小時，結(jié)束后菌體40億個/ml ；
步驟5所研制的油包水劑型中添加的油相為10號白油，乳化劑為spanSO，助溶劑為吐溫80。將發(fā)酵液制成油包水后可使其中的營養(yǎng)物質(zhì)懸浮穩(wěn)定地包裹在降解菌周圍，通過緩釋提供營養(yǎng)底物保持菌種的活性，防止降解菌的沉淀，并且油相可以給降解菌提供適宜的濕潤環(huán)境，從而大大延長菌劑產(chǎn)品的保質(zhì)期。使用時直接噴灑到果蔬表面，由于油包水的保水特性可以使營養(yǎng)物的緩慢釋放從而維持菌的活性，提高果蔬表面農(nóng)殘的降解率，同時還可防止果蔬失水、褐變等現(xiàn)象的發(fā)生。本發(fā)明的有益效果為
1本發(fā)明提供一種有機磷農(nóng)藥毒死蜱的降解菌，實驗室生物降解實驗和田間實驗結(jié)果表明，對毒死蜱的降解率達到85%左右；
2使用該方法生產(chǎn)的毒死蜱降解菌劑具有生產(chǎn)成本低，使用方便，降解效果好的優(yōu)點， 適合在糧食蔬菜水果生產(chǎn)出口基地和綠色食品生產(chǎn)基地大規(guī)模使用。該發(fā)明對于保護生態(tài)環(huán)境，保護人民的身體健康，增加農(nóng)產(chǎn)品的附加值有著重要的意義。


圖1 克雷伯氏菌dsp-Β的電鏡照片； 圖2 降解菌株dsp-B在土壤不同處理中的毒死蜱降解曲線。
具體實施例方式實施例1
采集成都農(nóng)泉驛區(qū)連續(xù)幾年施用毒死蜱殺蟲劑的桃園田表層土壤。稱取采集的農(nóng)藥污染土樣5g加到IOOml含100mg/l毒死蜱的滅菌基礎鹽培養(yǎng)基中，基礎鹽培養(yǎng)基的配方為 (均為 g/L) NH4NO3 1. 0，MgSO4·7Η20 0. 5，(NH4)2SO4 0. 5，KH2PO4 0. 5，NaCl 0. 5，K2HPO4 1. 5， PH 7. 0-7. 2，于37°C，180r/min振蕩培養(yǎng)7d。用第一次的富集培養(yǎng)液按5%的體積比接入相應的IOOml基礎鹽培養(yǎng)基中，同時毒死蜱濃度提高至200mg/L，在同樣的條件下培養(yǎng)。 7d后取5ml菌液再接入同樣培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)，傳代過程中毒死蜱的濃度逐步提高到 1000mg/l，再傳代4次，大約7d傳代1次。將富集的農(nóng)藥降解菌菌液用無菌水作10倍梯度(10_4、10_5、10_6 )稀釋，分別取0.1 ml菌懸液涂布于含有50 mg/L毒死蜱的無機鹽固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)；當平板出現(xiàn)菌落時，將單菌落在無機鹽農(nóng)藥平板上劃線分離、純化菌株。將生長快、菌落規(guī)則、傳代穩(wěn)定的單菌落斜面保存。將初篩得到的5株菌活化，接入 100mg/l毒死蜱基礎鹽培養(yǎng)基中，37°C，180r/min培養(yǎng)10d，測其降解率。通過復篩，得到降解率最高的菌株B。經(jīng)16SrDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)菌株B與Klebsiella 200916的序列相似性為99%，與Klebsiella sp. MS6的序列相似性也為99%，GenBank登錄號HQ836365。因此B應歸屬于克雷伯氏菌屬，主要生物學特性為G_，兼性厭氧菌，菌體呈球桿狀，單個、成對或短鏈狀排列，長0. 8-1. 2 μ m，寬2. 0-2. 4 μ m,不運動，有莢膜，不形成芽孢。在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12h的菌落直徑為0. 5mm，呈半球形，半透明，濕潤，表面光滑；能利用檸檬酸鹽和葡萄糖作為唯一碳源，氨作為氮源；發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；甲基紅實驗呈陰性；VP反應顯陽性； 三塘鐵瓊脂試驗不產(chǎn)生硫化氫； 實施例2
取實施例1中革蘭氏染色陰性的克雷伯氏菌的斜面接種于IOOmlLB培養(yǎng)基中，LB培養(yǎng)基(g/Ι)配方如下蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7. 0-7. 2，恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，獲得菌液。將上述培養(yǎng)好的菌液按15%體積接種量轉(zhuǎn)入已經(jīng)121°C高壓濕熱滅菌并冷卻至35°C左右的種子罐，種子罐培養(yǎng)基配方為葡萄糖5g/L，NH4NO3 10g/L , K2HPO4 2 g/ L, MgSO4·7Η20 0.5 g/L, Na2HPO4 2 g/L, CaCO3 3g/L, NaCl 1. 0 g/L，酵母膏 0.5 g/L, pH 7. 0-7. 2;繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:1. 5，攪拌速度為 200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為35°C。將達到對數(shù)生長期的種子液按15%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，發(fā)酵罐所用培養(yǎng)基與種子罐相同，接種后的發(fā)酵溫度控制在^_35°C，無菌空氣的通氣量為1:0. 8-1. 5，攪拌速度為150-220轉(zhuǎn)/分鐘，全程發(fā)酵培養(yǎng)時間為48-72小時，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達到40億個/ml。發(fā)酵完成后按照一定的油水比例在乳化劑的作用下將細菌培養(yǎng)液制成油包水劑型，然后用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型； 應用例1
在實驗室搖瓶條件下，應用實施例2中的液體降解菌劑，按5%的接種量接種于50ml毒
死蜱濃度為100mg/l的無機鹽培養(yǎng)基中，在35°C，pH=7. 2，180r/min下培養(yǎng)，于培養(yǎng)后的第
3，6，9，12(1取樣測其毒死蜱殘留濃度。對照為不加降解菌。12(1后毒死蜱的降解率為85. 5%，
而對照的降解率只有5. 2% (見表1)；
表1.克雷伯氏菌在實驗室搖瓶條件下對毒死蜱的降解
權利要求
1.一種毒死蜱農(nóng)藥殘留降解菌，其特征在于該微生物是革蘭氏染色陰性的克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)的dsp_B菌株，主要生物學特性為G_，兼性厭氧菌，菌體呈球桿狀，單個、成對或短鏈狀排列，長0. 8-1. 2 μ m，寬2. 0-2. 4 μ m,不運動，有莢膜，不形成芽孢；在LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)12h的菌落直徑為0. 5mm，呈半球形，半透明，濕潤，表面光滑；能利用檸檬酸鹽和葡萄糖作為唯一碳源，氨作為氮源；發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；甲基紅實驗呈陰性；VP反應顯陽性；三塘鐵瓊脂試驗不產(chǎn)生硫化氫；該菌株16SrDNA的Genbank登錄號為HQ836365。
2.利用權利要求1所述的克雷伯氏降解菌株研制成毒死蜱殘留降解菌劑，其特征在于，具體制備工藝如下(1)挑取毒死蜱殘留降解菌Klebsiellasp . dsp-B的單菌落接種于試管斜面；(2)將毒死蜱殘留降解菌dsp-B的斜面種接種于LB培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期；(3)將上述培養(yǎng)好的菌液按10-15%體積接種量轉(zhuǎn)入種子罐，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期；種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖5g/L，NH4NO3 10g/L , K2HPO4 2 g/L, MgSO4·7Η20 0.5 g/L, Na2HPO4 2 g/L，CaCO3 3g/L，NaCl 1.0 g/L，酵母膏 0. 5 g/L，pH :7. 0_7· 2 ；(4)將達到對數(shù)生長期的種子液按10-15%的接種量接種入生產(chǎn)罐中培養(yǎng)；生產(chǎn)罐所用的培養(yǎng)基配方與種子罐一樣；(5)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:0.8-1. 5，攪拌速度為 150-220轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為^_35°C，全程培養(yǎng)時間為48-72小時，結(jié)束后菌體40億個 /ml ；(6)發(fā)酵完成后將細菌培養(yǎng)液制成油包水劑型；油相制備取6份span-80和94份10 號白油混勻高壓滅菌備用；水相制備向活化好的細菌發(fā)酵液中加入4%的滅菌吐溫80并充分溶解；乳化制劑先將油相傾入置立式膠體磨中，在低速攪拌下緩慢加入水相(油相和水相按1 :3的比例充分混合)，然后高速攪拌;3min-5min，快速乳化成油包水狀，用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成油包水液體劑型。
3.根據(jù)權利要求2所述的毒死蜱殘留高效降解菌劑的制備方法，其特征在于步驟(6) 所述發(fā)酵液制成油包水產(chǎn)品時，需加入一定比例的spanSO作為乳化劑，其HLB值為4. 3， 能使互不相溶的油水兩相相互混溶，并形成均勻分散的油包水乳化體系；微生物菌劑施用到環(huán)境中以后容易受環(huán)境因素影響而喪失活性，這些因素中最重要的是營養(yǎng)元素和水分供給；將發(fā)酵液制成油包水后可使其中的營養(yǎng)物質(zhì)懸浮穩(wěn)定地包裹在降解菌周圍，通過緩釋提供營養(yǎng)底物保持菌種的活性，防止降解菌的沉淀，并且油相可以給降解菌提供適宜的濕潤環(huán)境，從而大大延長菌劑產(chǎn)品的保質(zhì)期；使用時直接噴灑到果蔬表面，由于油包水的保水特性可以使營養(yǎng)物的緩慢釋放從而維持菌的活性，提高果蔬表面農(nóng)殘的降解率，同時還可防止果蔬失水、褐變等現(xiàn)象的發(fā)生。
4.如權利要求1所述的克雷伯氏菌dsp-B在處理水體、土壤及果蔬表面毒死蜱農(nóng)藥殘留上的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株能降解毒死蜱農(nóng)藥殘留的微生物新菌種——克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)dsp-B，Genbank登錄號為HQ836365，以及利用該降解菌株研制的毒死蜱農(nóng)藥殘留降解菌劑。本發(fā)明降解菌劑是利用微生物的技術降解化學農(nóng)藥，屬于環(huán)境微生物修復技術領域，生產(chǎn)工藝為斜面種→搖瓶種子液→種子罐→發(fā)酵罐→產(chǎn)品，其制備工藝簡單、生產(chǎn)成本低廉易于大面積推廣應用，施用時直接噴灑非常方便，解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥噴灑該菌劑產(chǎn)品后可快速、高效地降解水體、土壤及果蔬表面的殘留毒死蜱含量，從而殘留超標問題，可生產(chǎn)出無毒無公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品，有效提高農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)和經(jīng)濟價值。
文檔編號A62D101/28GK102517234SQ201110443310
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權日2011年12月27日
發(fā)明者唐敦義, 徐恒, 楊新元 申請人:四川大學