專利名稱：一種以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物降解農(nóng)藥殘留技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種以氯嘧磺隆為底物的混 菌降解菌劑的篩選方法。
背景技術(shù)：
氯嘧磺隆是廣譜廣效的大豆田除草劑，90年代初就開始在我國使用，每公頃用有 效量僅為15-22. 5克，使用方便，成本低，應(yīng)用面積非常廣泛，我國每年大豆種植面積約900 萬公頃，氯嘧磺隆的使用面積就達(dá)250多萬公頃，接近1/3。僅黑龍江省，每年大豆田氯嘧磺 隆使用量就超過400噸，覆蓋133萬公頃。但是由于氯嘧磺隆不易揮發(fā)，不易光解，殘留期很 長，所以易對后茬敏感作物造成藥害，這樣就嚴(yán)重影響了作物的輪作，換茬及種植結(jié)構(gòu)的調(diào) 整，使農(nóng)民只能被動的連作，造成病蟲害難以控制的惡性循環(huán)。同時，氯嘧磺隆對土壤功能 微生物，例如熒光假單胞菌和硝化細(xì)菌有一定的影響，也會導(dǎo)致土壤功能的改變甚至衰退。 所以，如何消除氯嘧磺隆的殘留毒害問題一直視專家們關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，國內(nèi)外很多專家采取了一系列措施來減少氯嘧磺隆殘留所造成的危害，主 要有添加復(fù)配劑降低氯嘧磺隆的用量，開發(fā)抗藥性轉(zhuǎn)基因作物，開發(fā)化學(xué)解毒劑等，但這些 措施并不能從根本上解決農(nóng)藥殘留問題。國內(nèi)外開發(fā)微生物菌劑來消除農(nóng)藥殘留污染的先 例已經(jīng)很多，而且有很多成功的案例，比如有機(jī)磷類農(nóng)藥，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，氨基甲酸酯 類農(nóng)藥等，但是分離出的單菌菌劑活性較低，在環(huán)境中退化和遭排斥的可能性很大，活性不 穩(wěn)定，限制了應(yīng)用?；酋ｋ孱惓輨┍容^難降解，目前這方面的菌劑很少，但是研究發(fā)現(xiàn)，微 生物降解也是該類農(nóng)藥的一個主要的降解途徑，由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難降解，所以考慮混菌菌劑 應(yīng)該是生物降解農(nóng)藥的可行方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、高效的以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法取土壤菌懸液，其為田間多年受 氯嘧磺隆污染的土樣為處理對象，制成土壤菌懸液，在1/5LB培養(yǎng)基中添加氯嘧磺隆濃度 為100mg/L，按照體積百分比5-10%的接種量接種菌懸液，28-30°C，150-180r/min搖床培 養(yǎng)5-7天，按體積百分比5-10%的接種量將培養(yǎng)液接種于新的1/5LB培養(yǎng)基，氯嘧磺隆的 濃度按100mg/L遞增，依次類推，5次轉(zhuǎn)接后，培養(yǎng)基中氯嘧磺隆濃度為500mg/L，再按體積 比5-10%的接種量轉(zhuǎn)接5次，氯嘧磺隆的添加濃度始終為500mg/L，得到富集的混菌菌種， 液相色譜法測得該混菌菌種對培養(yǎng)基中氯嘧磺隆的降解率達(dá)到70%以上，將上述菌種發(fā)酵 擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)處理后，即得到以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑。所述的1/5LB培養(yǎng)基的配方為胰蛋白胨2g，酵母粉lg，氯化鈉2g，蒸餾水1000ml pH = 7. 0。
液相色譜法測降解率的條件為，C18反相柱(4. 6umX250mm)，DAD 二級管陣列檢測 器，流動相為甲醇、水和冰醋酸，其體積比為70 30 0. 1 ；流速為lml/min ；檢測波長為 254nm ；柱溫為28-30 °C ；進(jìn)樣量為5-10 yl。所述發(fā)酵培養(yǎng)為，富集得到的混菌菌種，在1/5LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)， 發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個/mL以上，用麥麩和泥炭在40-50°C下吸附風(fēng)干粉碎，即 得到以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑。擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵罐的條件為無菌空氣的通氣量 為1 0.8-1，攪拌速度為180-200r/min，培養(yǎng)溫度為28-30°C，培養(yǎng)時間為48-60h。二級 發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個/ml以上，用質(zhì)量比2 8-1 9的麥麩和泥炭吸附，在 40-50°C下風(fēng)干粉碎。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1.富集得出高效混菌菌劑，降解農(nóng)藥殘留，活性更高更穩(wěn)定，成本降低。2.取田間污染土樣作為處理對象，菌種取之土，用之土，增強(qiáng)適應(yīng)能力。3.利用微生物降解農(nóng)藥殘留，綠色環(huán)保，不僅保護(hù)后茬作物，更重要的是對調(diào)整種 植結(jié)構(gòu)，提高作物的病蟲害抵抗能力。4.本發(fā)明采用對氯嘧磺隆敏感的玉米作為指示作物，盆栽實(shí)驗(yàn)，能夠直觀地驗(yàn)證 本發(fā)明的菌劑對土壤中氯嘧磺隆的降解效果。具體的實(shí)施方式實(shí)施例1取田間(佳木斯市撫遠(yuǎn)縣大豆田)多年受氯嘧磺隆污染的土樣為處理對象，用蒸 餾水稀釋制成土壤懸液，在1/5LB液體培養(yǎng)基中添加氯嘧磺隆的濃度為100mg/L，接種土壤 懸液，按體積百分比接種量為10%，28°C，150r/min搖床培養(yǎng)5天，將該培養(yǎng)液按相同的接 種量接種于氯嘧磺隆濃度為200mg/L的新鮮的1/5LB培養(yǎng)基中，然后相同條件搖床培養(yǎng)5 天，依次類推，接種5次，按氯嘧磺隆100mg/L的濃度梯度遞增，使培養(yǎng)基中的氯嘧磺隆最終 濃度為500mg/L，再按體積比10%的接種量轉(zhuǎn)接5次，氯嘧磺隆的添加濃度始終為500mg/L， 得到富集的混菌菌種。用液相色譜法測定富集菌種的降解率色譜條件為，C18反相柱(4. 6umX250mm)， DAD 二級管陣列檢測器，流動相為甲醇、水和冰醋酸，其體積比為70 30 0.1;流速為 lml/min ；檢測波長為254nm ；柱溫為28°C ；進(jìn)樣量為5 yl。得出該混菌菌種對培養(yǎng)基中氯 嘧磺隆的降解率達(dá)到72%。將上述降解率達(dá)到72%的混菌菌種在1/5LB培養(yǎng)基發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為， 無菌空氣的通氣量為1 0.8，攪拌速度為180轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時間為48h。 發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個/ml以上，用麥麩和泥炭(質(zhì)量比2 8)在40°C下吸附 風(fēng)干粉碎，即得到以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑。而后以玉米中金736作為指示作物，室內(nèi)盆栽測定上述所得以氯嘧磺隆為底物的 混菌降解菌劑的降解效果，10天的盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的混菌降解菌劑對土壤中的 氯嘧磺隆殘留有明顯的降解作用，經(jīng)菌劑處理的土壤，玉米根長明顯長于沒有施用菌劑的 土壤，能夠有效保護(hù)后茬作物。經(jīng)液相色譜法(條件同上)測定土壤中氯嘧磺隆的含量，得 出該菌劑10天對土壤中氯嘧磺隆的降解率能達(dá)到63. 7%。實(shí)施例2
取田間(佳木斯市撫遠(yuǎn)縣大豆田)多年受氯嘧磺隆污染的土樣為處理對象，用蒸 餾水稀釋制成土壤懸液，在1/5LB液體培養(yǎng)基中添加氯嘧磺隆的濃度為100mg/L，接種土壤 懸液，按體積百分比接種量為5%，30°C，180r/min搖床培養(yǎng)7天，將該培養(yǎng)液按相同的接種 量接種于氯嘧磺隆濃度為200mg/L的新鮮的1/5LB培養(yǎng)基中，然后相同條件搖床培養(yǎng)7天， 依次類推，接種5次，按氯嘧磺隆100mg/L的濃度梯度遞增，使培養(yǎng)基中的氯嘧磺隆最終濃 度為500mg/L，再按體積比5%的接種量轉(zhuǎn)接5次，氯嘧磺隆的添加濃度始終為500mg/L，得 到富集的混菌菌種。用液相色譜法測定富集菌種的降解率色譜條件為，C18反相柱(4. 6umX250mm)， DAD 二級管陣列檢測器，流動相為甲醇、水和冰醋酸，其體積比為70 30 0.1;流速為 lml/min ；檢測波長為254nm ；柱溫為30°C;進(jìn)樣量為10 yl。得出混菌菌種對培養(yǎng)基中氯嘧 磺隆的降解率達(dá)到71.3%。將上述降解率達(dá)到71. 3 %的混菌菌種在1/5LB培養(yǎng)基發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為，無菌空氣的通氣量為1 1，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時間為60h。 發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個/ml以上，用麥麩和泥炭(質(zhì)量比1 9)在50°C下吸附 風(fēng)干粉碎，即得到以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑。而后以玉米中金736作為指示作物，室內(nèi)盆栽測定上述所得以氯嘧磺隆為底物的 混菌降解菌劑的降解效果，15天的盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的混菌降解菌劑對土壤中的 氯嘧磺隆殘留有明顯的降解作用，經(jīng)菌劑處理的土壤，玉米根長明顯長于沒有施用菌劑的 土壤，能夠有效保護(hù)后茬作物。經(jīng)液相色譜法(條件同上)測定土壤中氯嘧磺隆的含量，得 出該菌劑15天對土壤中氯嘧磺隆的降解率能達(dá)到75. 2%。實(shí)施例3取田間(佳木斯市撫遠(yuǎn)縣大豆田)多年受氯嘧磺隆污染的土樣為處理對象，用蒸 餾水稀釋制成土壤懸液，在1/5LB液體培養(yǎng)基中添加氯嘧磺隆的濃度為100mg/L，接種土壤 懸液，按體積百分比接種量為10%，28°C，150r/min搖床培養(yǎng)5天，將該培養(yǎng)液按相同的接 種量接種于氯嘧磺隆濃度為200mg/L的新鮮的1/5LB培養(yǎng)基中，然后相同條件搖床培養(yǎng)5 天，依次類推，接種5次，按氯嘧磺隆100mg/L的濃度梯度遞增，使培養(yǎng)基中的氯嘧磺隆最終 濃度為500mg/L，再按體積比10%的接種量轉(zhuǎn)接5次，氯嘧磺隆的添加濃度始終為500mg/L， 得到富集的混菌菌種。用液相色譜法測定富集菌種的降解率色譜條件為，C18反相柱(4. 6umX250mm)， DAD 二級管陣列檢測器，流動相為甲醇、水和冰醋酸，其體積比為70 30 0.1;流速為 lml/min ；檢測波長為254nm ；柱溫為28°C ；進(jìn)樣量為5 yl。得出混菌菌種對培養(yǎng)基中氯嘧 磺隆的降解率達(dá)到74.3%。將上述降解率達(dá)到74. 3 %的混菌菌種在1/5LB培養(yǎng)基發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為，無菌空氣的通氣量為1 0.8，攪拌速度為180轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時間為 48h。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個/ml以上，用麥麩和泥炭(質(zhì)量比2 8)在40°C下 吸附風(fēng)干粉碎，即得到以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑。而后以玉米丹玉53作為指示作物，室內(nèi)盆栽測定上述所得以氯嘧磺隆為底物的 混菌降解菌劑的降解效果，10天的盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的混菌降解菌劑對土壤中的 氯嘧磺隆殘留有明顯的降解作用，經(jīng)菌劑處理的土壤，玉米根長明顯長于沒有施用菌劑的
5土壤，能夠有效保護(hù)后茬作物。經(jīng)液相色譜法(條件同上)測定土壤中氯嘧磺隆的含量，得 出該菌劑10天對土壤中氯嘧磺隆的降解率能達(dá)到60. 23%。實(shí)施例4取田間(佳木斯市撫遠(yuǎn)縣大豆田)多年受氯嘧磺隆污染的土樣為處理對象，用蒸 餾水稀釋制成土壤懸液，在1/5LB液體培養(yǎng)基中添加氯嘧磺隆的濃度為100mg/L，接種土壤 懸液，按體積百分比接種量為5%，30°C，180r/min搖床培養(yǎng)7天，將該培養(yǎng)液按相同的接種 量接種于氯嘧磺隆濃度為200mg/L的新鮮的1/5LB培養(yǎng)基中，然后相同條件搖床培養(yǎng)7天， 依次類推，接種5次，按氯嘧磺隆100mg/L的濃度梯度遞增，使培養(yǎng)基中的氯嘧磺隆最終濃 度為500mg/L，再按體積比5%的接種量轉(zhuǎn)接5次，氯嘧磺隆的添加濃度始終為500mg/L，得 到富集的混菌菌種。用液相色譜法測定富集菌種的降解率色譜條件為，C18反相柱(4. 6umX250mm)， DAD 二級管陣列檢測器，流動相為甲醇、水和冰醋酸，其體積比為70 30 0.1;流速為 lml/min ；檢測波長為254nm ；柱溫為30°C;進(jìn)樣量為10 yl。得出混菌菌種對培養(yǎng)基中氯嘧 磺隆的降解率達(dá)到75.7%。將上述降解率達(dá)到75. 7 %的混菌菌種在1/5LB培養(yǎng)基發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為，無菌空氣的通氣量為1 1，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時間為60h。 發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個/ml以上，用麥麩和泥炭(質(zhì)量比1 9)在40°C下吸附 風(fēng)干粉碎，即得到以氯嘧磺隆為底物的混菌降解 菌劑。而后以玉米丹玉53作為指示作物，室內(nèi)盆栽測定上述所得以氯嘧磺隆為底物的 混菌降解菌劑的降解效果，15天的盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的混菌降解菌劑對土壤中的 氯嘧磺隆殘留有明顯的降解作用，經(jīng)菌劑處理的土壤，玉米根長明顯長于沒有施用菌劑的 土壤，接近于沒有施用農(nóng)藥的對照根長，說明本發(fā)明的混菌降解菌劑能夠有效保護(hù)后茬作 物。經(jīng)液相色譜法(條件同上)測定土壤中氯嘧磺隆的含量，得出該菌劑15天對土壤中氯 嘧磺隆的降解率能達(dá)到71. 9%。
權(quán)利要求
一種以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法，其特征在于取土壤菌懸液，在1/5LB培養(yǎng)基中添加氯嘧磺隆濃度為100mg/L，按照體積百分比5-10％的接種量接種菌懸液，28-30℃，150-180r/min搖床培養(yǎng)5-7天，按體積百分比5-10％的接種量將培養(yǎng)液接種于新的1/5LB培養(yǎng)基，氯嘧磺隆的濃度按100mg/L遞增，依次類推，5次轉(zhuǎn)接后，培養(yǎng)基中氯嘧磺隆濃度為500mg/L，再按體積比5-10％的接種量轉(zhuǎn)接5次，氯嘧磺隆的添加濃度始終為500mg/L，得到富集的混菌菌種，液相色譜法測得該混菌菌種對培養(yǎng)基中氯嘧磺隆的降解率達(dá)到70％以上，將上述菌種發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)處理后，即得到以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法，其特征在 于所述的1/5LB培養(yǎng)基的配方為胰蛋白胨2g，酵母粉lg，氯化鈉2g，蒸餾水1000ml pH =7. 0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法，其特征在 于液相色譜法測降解率的條件為，C18反相柱(4. 6umX250mm)，DAD 二級管陣列檢測器，流 動相為甲醇、水和冰醋酸，其體積比為70 30 0. 1 ；流速為lml/min;檢測波長為254nm; 柱溫為28-30°C ；進(jìn)樣量為5-10 μ 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法，其特征在 于所述發(fā)酵培養(yǎng)為，富集得到的混菌菌種，在1/5LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié) 束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個/mL以上，用麥麩和泥炭在40-50°C下吸附風(fēng)干粉碎，即得到以氯 嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法，其特征在 于擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵罐的條件為；無菌空氣的通氣量為1 0.8-1，攪拌速度為180-2001·/ min，培養(yǎng)溫度為28-30°C，培養(yǎng)時間為48_60h。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法，其特征在 于二級發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個/ml以上，用質(zhì)量比2 8-1 9的麥麩和泥炭 吸附，在40-50°C下吸附風(fēng)干粉碎。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物降解農(nóng)藥殘留技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑的篩選方法。取菌懸液，在1/5LB培養(yǎng)基中添加氯嘧磺隆濃度為100mg/L，按體積百分比5-10％的量接種菌懸液，28-30℃，150-180r/min搖床培養(yǎng)5-7天，按體積百分比5-10％的量將培養(yǎng)液接種于新的1/5LB培養(yǎng)基，氯嘧磺隆的濃度按100mg/L遞增，5次轉(zhuǎn)接后，培養(yǎng)基中氯嘧磺隆濃度為500mg/L，再按體積比5-10％的接種量轉(zhuǎn)接5次，氯嘧磺隆的添加濃度始終為500mg/L，得到混菌菌種。經(jīng)液相色譜法檢測，降解率達(dá)到70％以上。將上述菌種發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)后即得到以氯嘧磺隆為底物的混菌降解菌劑。
文檔編號A62D101/28GK101845393SQ20091001087
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月25日
發(fā)明者張惠文, 張曉黎, 李新宇, 李旭, 蘇振成, 蔡穎慧 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所