專利名稱：基于ito玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬細(xì)胞培養(yǎng)芯片領(lǐng)域，特別是涉及一種玻璃細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法及其應(yīng)用。
技術(shù)背景利用C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)方法是一種研究活細(xì)胞的良好方法，在病毒學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，但仍然存在明顯不足。首先是 細(xì)胞操作方法繁瑣，不易控制細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，難以全面模擬細(xì)胞生活的真實(shí)環(huán)境；還 有就是細(xì)胞所需數(shù)量巨大，不易進(jìn)行單細(xì)胞的控制和操縱，觀察不直接，耗費(fèi)世紀(jì)。將微 流控芯片和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合所得到的細(xì)胞培養(yǎng)芯片，具有明顯的優(yōu)越性。從器件尺寸 而言，芯片特征尺寸可與細(xì)胞大小相比擬，有助于實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)；從結(jié)構(gòu)上 而言，芯片內(nèi)物質(zhì)傳輸與熱傳導(dǎo)非常迅速，有利于細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的快速穩(wěn)定；從集成性而 言，芯片上可以集成多種分析手段，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的微型化。由于這些優(yōu)勢(shì)的存在，細(xì)胞 培養(yǎng)芯片在細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、藥物篩選等多個(gè)領(lǐng)域正在發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。在設(shè)計(jì)芯片時(shí)，必須考慮芯片材料的生物兼容性、培養(yǎng)液流動(dòng)導(dǎo)致的機(jī)械力對(duì)細(xì)胞的 影響和有效成分的傳遞輸送等因素。其中，如何通過(guò)簡(jiǎn)單快速的微細(xì)加工工藝加工生物兼 容性良好的材料是需要解決的首要問(wèn)題。目前用于加工細(xì)胞培養(yǎng)芯片的材料主要有硅、玻 璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS)等聚合物材料。PDMS芯片通常采用復(fù)制壓模技術(shù)制作， 能夠?qū)崿F(xiàn)微米級(jí)圖案的高保真復(fù)制，并且具有良好的生物兼容性，可直接培養(yǎng)各類細(xì)胞。 但由于PDMS為彈性材料，易受有機(jī)試劑作用產(chǎn)生微通道變形、溶脹等現(xiàn)象。并且PDMS 管道表面為疏水性，很難潤(rùn)濕親水性溶液，在培養(yǎng)液進(jìn)樣過(guò)程中容易產(chǎn)生氣泡而損傷細(xì)胞。硅材料親水，能夠耐受硫酸；鹽酸等液體，性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，加工技術(shù)成熟。其缺點(diǎn)主 要是易碎、價(jià)格較高、不透光、電絕緣性不夠好、表面化學(xué)行為較復(fù)雜。與硅、PDMS材 料相比，玻璃廉價(jià)、易得，且具有良好的親水性能、力學(xué)性能，制作設(shè)備與傳統(tǒng)IC (集成 電路)工藝設(shè)備相兼容。然而，現(xiàn)在制作玻璃芯片的方法是在玻璃基底上濺射一層金屬 或多晶硅等薄膜材料作為刻蝕掩模層，然后進(jìn)行濕法或干法刻蝕，最后在超凈環(huán)境中利用 高電壓或高溫進(jìn)行鍵合，整個(gè)加工工藝復(fù)雜，價(jià)格昂貴。細(xì)胞體外培養(yǎng)還需要一定的恒溫環(huán)境和合適的氣體供應(yīng)。常規(guī)培養(yǎng)下，C02培養(yǎng)箱能 夠?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)提供37X:的恒溫環(huán)境和適當(dāng)?shù)?2、 C02供應(yīng)。因此，制作細(xì)胞培養(yǎng)芯片時(shí)， 需要集成溫度控制裝置，并滿足細(xì)胞對(duì)氣體的需求。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種基于ITO (Indium-Tin-Oxide,氧化銦錫)玻璃基底的細(xì)胞培 養(yǎng)芯片制備方法及其應(yīng)用，克服現(xiàn)有的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片的疏水性問(wèn)題和玻 璃材質(zhì)芯片的加工工藝復(fù)雜問(wèn)題，為細(xì)胞在體外的穩(wěn)定培養(yǎng)提供了良好的條件。本發(fā)明的基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法，包括步驟以ITO玻璃為細(xì)胞培養(yǎng)芯片的基質(zhì)材料；以ITO玻璃未濺射ITO薄膜的一側(cè)甩涂 AZ4620光刻膠作為玻璃腐蝕的掩模層，根據(jù)設(shè)計(jì)的掩膜版進(jìn)行曝光、顯影；將PDMS單 體、固化劑按比例均勻混合，澆注在ITO薄膜一側(cè)，加熱固化；將ITO玻璃置于腐蝕液中， 刻蝕得微管道和"壩型"結(jié)構(gòu)；剝離ITO薄膜上的PDMS;將PDMS單體、固化劑按比例 均勻混合后，平鋪在載玻片上，加熱固化得PDMS薄膜將PDMS薄膜和己刻蝕微管道的 ITO玻璃一側(cè)在氧等離子體作用下鍵合得到細(xì)胞培養(yǎng)芯片；再在ITO玻璃未鍵合PDMS薄 膜的一側(cè)通過(guò)黏附金屬導(dǎo)線連入外部溫度控制系統(tǒng)。所述的微管道分兩個(gè)區(qū)域，其中一個(gè)區(qū)域?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)區(qū)域，另外一個(gè)區(qū)域?yàn)榕囵B(yǎng)液進(jìn) 樣區(qū)域，兩個(gè)區(qū)域通過(guò)"壩型"結(jié)構(gòu)連接；所述的"壩型"結(jié)構(gòu)髙度小于微管道深度；所述的腐蝕液是BOE (Buffered Oxide Etch);所述的固化劑是Dow Coming公司所提供的sylgard184產(chǎn)品；所述的PDMS單體與固化劑的重量混合比為10:1;所述的加熱固化是8(TC加熱固化1小時(shí)；所述的黏附金屬導(dǎo)線是通過(guò)導(dǎo)電膠將金屬導(dǎo)線黏附在ITO薄膜上； 所述的外部溫度控制系統(tǒng)，其溫度控制對(duì)象為芯片微管道內(nèi)液體的溫度，其溫度傳感器為PtlOOO溫敏電阻，其加熱方法為ITO薄膜導(dǎo)電發(fā)熱的直接加熱方式，其控制中心為ADfiC812單片機(jī)。本發(fā)明的一種基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的應(yīng)用在于細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì) 胞之間相互作用研究。所述的細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞，或正常體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞； 所述細(xì)胞的培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)液添加Leibovitz's L-15培養(yǎng)基。 本發(fā)明的有益效果(1)利用玻璃濕法腐蝕過(guò)程中的鉆蝕效應(yīng)刻蝕出高度低于微管道深度的壩型結(jié)構(gòu)，隔離 細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域和培養(yǎng)液進(jìn)樣區(qū)域，減少了培養(yǎng)液進(jìn)樣所產(chǎn)生的流體剪切力對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影 響；(2) 利用ITO玻璃的ITO薄膜導(dǎo)電發(fā)熱性質(zhì)，在芯片上集成溫度控制系統(tǒng)(3) 利用PDMS材料的透氣性特點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)須通入氧氣，降低了細(xì)胞培養(yǎng)微系 統(tǒng)設(shè)計(jì)的復(fù)雜度；(4) 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中使用的培養(yǎng)液添加了Leibovitz'sL-15培養(yǎng)基，可以保持培養(yǎng)液pH 值的穩(wěn)定，從而去除CCb的供應(yīng)。


圖1是ITO玻璃芯片制作工藝過(guò)程示意圖；圖2是芯片的掩膜版設(shè)計(jì)示意圖；圖3是玻璃刻蝕后的微管道示意圖圖4是細(xì)胞培養(yǎng)和觀察微系統(tǒng)示意圖；圖5是P正C內(nèi)皮細(xì)胞在芯片內(nèi)的貼壁展開(kāi)示意圖；圖6是3T3細(xì)胞在芯片內(nèi)的相對(duì)運(yùn)動(dòng)示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一歩闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。實(shí)施例1細(xì)胞培養(yǎng)玻璃芯片制作工藝流程如圖1所示，具體如下1. 清洗ITO (Indium-Tin-Oxide,氧化銦錫)玻璃，先用丙酮和酒精各超聲11分鐘，再用 去離子水沖洗干凈；2. 在ITO玻璃未濺射ITO薄膜的一側(cè)甩涂AZ4620光刻膠(2000轉(zhuǎn)/秒，30秒)，8(TC前 烘3分鐘；3. 根據(jù)設(shè)計(jì)的掩膜版(如圖2所示)進(jìn)行曝光；4. 顯舉，130*0后烘，得到與芯片設(shè)計(jì)所對(duì)應(yīng)的圖形結(jié)構(gòu)；5. 將聚二甲基硅氧烷(PDMS)單體和固化劑(Dow Coming公司所提供的sylgaidl'84產(chǎn) 品)按重量比10:1混合均勻，脫氣處理30分鐘后澆注在ITO薄膜一側(cè)，80X:固化1 小時(shí)；6. 將ITO玻璃置于1:6稀釋的BOE腐蝕液中腐蝕50分鐘，將圖形轉(zhuǎn)移到ITO玻璃上， 刻蝕得到的微管道深度約為39微米，得到的壩型結(jié)構(gòu)最大高度約為31微米，刻蝕完 成后的微管道如圖3所示；7. 去除覆蓋在ITO玻璃上的PDMS材料，將玻璃用丙酮、酒精各超聲5min清洗干凈；8. 將PDMS單體和固化劑按10:1重量比混合均勻后，脫氣處理30分鐘，澆注在水平放 置的載玻片上，8(TC固化一個(gè)小時(shí)，獲得厚度為lmm的PDMS薄膜9. 將PDMS薄膜和已刻蝕微管道的ITO玻璃一側(cè)在等離子體刻蝕儀內(nèi)處理45秒，完成兩 者的不可逆鍵合；10..在ITO玻璃未鍵合--側(cè)，即濺射有ITO薄膜處，利用導(dǎo)電膠黏附金屬導(dǎo)線，連入外部 溫度控制系統(tǒng)，其溫度控制對(duì)象為芯片微管道內(nèi)液體的溫度，其溫度傳感器為PtlOOO溫敏 電阻，其加熱方法為ITO薄膜導(dǎo)電發(fā)熱的直接加熱方式，其控制中心為AD(iC812單片機(jī)。實(shí)施例2培養(yǎng)液采用1640培養(yǎng)基，將其與L-15培養(yǎng)基以1:1混合后，補(bǔ)充10%的胎牛血清、 100Unit/ml鏈霉素。用胰酶消化液(含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA)消化常規(guī)培養(yǎng)的 P正C內(nèi)皮細(xì)胞、離心去上清、培養(yǎng)液分散重懸，將細(xì)胞懸濁液的濃度調(diào)整到4xlOscells/ mm3,然后用注射器吸入細(xì)胞懸濁液，通過(guò)注射泵緩慢注入芯片內(nèi)。將此已導(dǎo)入細(xì)胞的芯 片和溫度控制裝置、培養(yǎng)液進(jìn)樣裝置相連進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)。溫度控制目標(biāo)設(shè)置在37±0.51C, 培養(yǎng)液進(jìn)樣速度為8fiL/s。芯片置于倒置顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察的細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。細(xì)胞培養(yǎng) 和觀察微系統(tǒng)如圖4所示。圖5為PIEC內(nèi)皮細(xì)胞在導(dǎo)入芯片4小時(shí)內(nèi)，利用視頻系統(tǒng)記 錄下來(lái)的細(xì)胞貼壁展開(kāi)圖。實(shí)施例3培養(yǎng)液采用DMEM (髙糖)培養(yǎng)基，將其與L-15培養(yǎng)基以1:1混合后，補(bǔ)充10%的胎 牛血清、100Unit/ml鏈霉素。用胰酶消化液(含0.25。/。胰蛋白酶和0.02%EDTA)消化常規(guī) 培養(yǎng)的3T3細(xì)胞、離心去上清、培養(yǎng)液分散重懸，將細(xì)胞懸濁液的濃度調(diào)整到4"05cdls/ mm3,，然后用注射器吸入細(xì)胞懸濁液，通過(guò)注射泵緩慢注入芯片內(nèi)。將此已導(dǎo)入細(xì)胞的 芯片和溫度控制裝置、培養(yǎng)液進(jìn)樣裝置相連進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)。溫度控制目標(biāo)設(shè)置在37±0.5 X:，培養(yǎng)液進(jìn)樣速度為8jiL/s。芯片置于倒置顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察的細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。細(xì)胞 培養(yǎng)和觀察微系統(tǒng)如圖4所示。圖6為3T3細(xì)胞在芯片培養(yǎng)過(guò)程中，利用視頻系統(tǒng)記錄下來(lái)的兩個(gè)細(xì)胞在2小時(shí)內(nèi)相 對(duì)移動(dòng)過(guò)程。
權(quán)利要求
1.一種基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法，包括步驟以氧化銦錫ITO玻璃為細(xì)胞培養(yǎng)芯片的基質(zhì)材料；以ITO玻璃未濺射ITO薄膜的一側(cè)甩涂AZ4620光刻膠作為玻璃腐蝕的掩模層，根據(jù)設(shè)計(jì)的掩膜版進(jìn)行曝光、顯影；將聚二甲基硅氧烷PDMS單體、固化劑按比例均勻混合，澆注在ITO薄膜一側(cè)，加熱固化；將ITO玻璃置于腐蝕液中，刻蝕得微管道和“壩型”結(jié)構(gòu)；剝離ITO薄膜上的PDMS；將PDMS單體、固化劑按比例均勻混合后，平鋪在載玻片上加熱固化得PDMS薄膜；將PDMS薄膜和已刻蝕微管道的ITO玻璃一側(cè)在氧等離子體作用下鍵合得到細(xì)胞培養(yǎng)芯片；再在ITO玻璃未鍵合PDMS薄膜的一側(cè)通過(guò)黏附金屬導(dǎo)線連入外部溫度控制系統(tǒng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在于-所述的微管道分兩個(gè)區(qū)域，其中一個(gè)區(qū)域?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)區(qū)域，另外一個(gè)區(qū)域?yàn)榕囵B(yǎng)液進(jìn)樣區(qū) 域，兩個(gè)區(qū)域通過(guò)"壩型"結(jié)構(gòu)連接。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在 于所述的"壩型"結(jié)構(gòu)高度小于微管道深度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在于 所述的腐蝕液是Buffered Oxide Eteh。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在于 所述的PDMS單體與固化劑的重量混合比為10:1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在于 所述的加熱固化是80'C加熱固化1小時(shí)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在于 所述的黏附金屬導(dǎo)線是通過(guò)導(dǎo)電膠將金屬導(dǎo)線黏附在ITO薄膜上。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法，其特征在于 所述的外部溫度控制系統(tǒng)，其溫度控制對(duì)象為芯片微管道內(nèi)液體的溫度，其溫度傳感器為 PtlOOO溫敏電阻，其加熱方法為ITO薄膜導(dǎo)電發(fā)熱的直接加熱方式，其控制中心為 ADnC812單片機(jī)。
9. 一種基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的應(yīng)用在細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞之間相互 作用研究。
10. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的應(yīng)用，其特征在于所 述的細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
11. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的應(yīng)用，其特征在于所述的細(xì)胞是正常體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求IO、 11或12所述的基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的應(yīng)用，其特征 在于所述細(xì)胞的培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)液添加Leibovitz's L-15培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于ITO玻璃基底的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的制備方法及其應(yīng)用，制備以ITO玻璃為基質(zhì)材料；在ITO玻璃未濺射ITO薄膜的一側(cè)甩涂AZ4620光刻膠，曝光、顯影；將PDMS單體、固化劑混合，澆注在ITO薄膜一側(cè)，加熱固化；將ITO玻璃置于腐蝕液中，刻蝕；剝離ITO薄膜上的PDMS；制備PDMS薄膜；PDMS薄膜和已刻蝕微管道的ITO玻璃在氧等離子體作用下鍵合得到細(xì)胞培養(yǎng)芯片；再在ITO玻璃未鍵合PDMS薄膜的一側(cè)連入外部溫度控制系統(tǒng)。該芯片克服PDMS芯片的疏水性問(wèn)題和玻璃材質(zhì)芯片的加工工藝復(fù)雜問(wèn)題，并且便于直接控制芯片溫度，可應(yīng)用于細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞之間相互作用研究。
文檔編號(hào)C03C15/00GK101148324SQ20071004599
公開(kāi)日2008年3月26日 申請(qǐng)日期2007年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月14日
發(fā)明者蕾 吳, 楊才表, 輝 趙, 趙建龍, 強(qiáng) 陳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所