專利名稱：一種降解木質(zhì)纖維素的微生物菌劑及利用其降解木質(zhì)纖維素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，特別涉及一種用于降解木質(zhì)纖維素的微生物菌劑及利用其降解木質(zhì)纖維素的方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)生物學(xué)家估算，地球上每年生長的生物能總量約1400-1800億噸(干重)，中國是個(gè)農(nóng)業(yè)大國，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生大量的農(nóng)作物廢棄物，這些廢棄物在中國能源歷史上，在農(nóng)村能源領(lǐng)域扮演了十分重要的角色。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2001年全國糧食產(chǎn)量為4.5264億噸，而農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量為7.074億噸，稻殼、玉米秸稈和麥秸占農(nóng)作物廢棄物總量的70.6％，其他生物質(zhì)廢棄物約占29.4％。
然而這些農(nóng)作物廢棄物的利用亦不相同，1998年，大約僅有800萬噸農(nóng)作物廢棄物(約占10％)用作牲畜飼料；1.5億噸(約占20％)用作工業(yè)原料；4億噸(約占52％)用作燃料，作為農(nóng)村地區(qū)的主要能源；1.4億噸(約占18％)在田里直接燒掉或廢棄。
造紙業(yè)也是工業(yè)固體生物質(zhì)廢棄物的一個(gè)較大的來源。2000年我國紙產(chǎn)量為2487萬噸，總量為320萬噸。其中，大約102萬噸產(chǎn)生于木紙漿的生產(chǎn)過程，而且，這部分資源幾乎沒有被作為能源利用。
中國是世界上最大的木材和木制品生產(chǎn)國和消耗國之一。但同其他發(fā)達(dá)國家相比，人均占有森林量卻很低。據(jù)專家估算，全國木材年需求量超過3億立方米，但是國內(nèi)供給量僅為1.5億立方米，這就意味著短缺50％。而且預(yù)計(jì)今后木材需求量還要增加。預(yù)計(jì)到2015年，廢棄物產(chǎn)量可達(dá)到1.4億立方米。
生物質(zhì)燃料中可燃部分主要是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素。按質(zhì)量計(jì)算，纖維素占生物質(zhì)的40-50％，半纖維素占生物質(zhì)的20-40％，木質(zhì)素占生物質(zhì)的10-25％。
木質(zhì)素的降解是陸地生態(tài)系統(tǒng)中碳素循環(huán)的關(guān)鍵步驟，以前的研究認(rèn)為在木質(zhì)素微生物中，只有白腐菌能徹底分解木質(zhì)素，降解成CO2和水。而其它的腐生細(xì)菌和放線菌一般只能部分改變木質(zhì)素分子結(jié)構(gòu)。20世紀(jì)50～60年代證實(shí)木材腐朽與細(xì)菌相關(guān)，到80～90年代的研究工作表明細(xì)菌可以代謝楊木二氧己烷木質(zhì)素、低分子量的磺化木質(zhì)素及Kraft木質(zhì)素片斷。細(xì)菌能在一定程度上使木質(zhì)素結(jié)構(gòu)發(fā)生改性，成為水溶性的聚合產(chǎn)物，很少礦化木質(zhì)素產(chǎn)生CO2。另外，細(xì)菌在木質(zhì)素降解過程中主要起著間接的作用，即細(xì)菌與軟腐真菌協(xié)作使木質(zhì)素易于受到真菌的攻擊，且可去除對(duì)腐朽真菌有毒性的物質(zhì)，通常非絲狀細(xì)菌木質(zhì)素降解率＜10％，只能降解木質(zhì)素低分子量部分和木質(zhì)素的降解產(chǎn)物。因此，它們可能在木質(zhì)素降解的最后階段起作用。
目前國內(nèi)外未見有利用細(xì)菌對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行直接降解的報(bào)道，研究主要集中在白腐真菌的木質(zhì)纖維素降解轉(zhuǎn)化方面，在木質(zhì)素的降解微生物中，研究得最為深入的白腐菌是黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)和Sporotrichumpulverulentum，在P.chrysosporium中，已發(fā)現(xiàn)多種胞外酶與木素降解有關(guān)木素過氧化物酶(lignin peroxidases，LiPs)，錳過氧化物酶(manganese peroxidases，MnPs)，多功能過氧化物酶(漆酶(laccase)，己二醛氧化酶(glyoxal oxidase，GLOX)和纖維二糖脫氫酶(cellobiose dehydrogenase，CDH)。利用本源原核微生物進(jìn)行木質(zhì)纖維素的降解及其木素過氧化物酶的生產(chǎn)具有微生物易于培養(yǎng)，產(chǎn)酶時(shí)間短，易于控制，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等一系列優(yōu)越性。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服目前白腐真菌降解木質(zhì)纖維素的不足之處，而提供一種新型的降解木質(zhì)纖維素的微生物菌劑以及利用上述菌劑降解木質(zhì)纖維素的方法。
本發(fā)明目的可以通過如下方式來實(shí)現(xiàn)一種降解木質(zhì)纖維素的微生物菌劑，是由Pseudomanas sp.(假單孢菌)、Bacillusamyloliquefaciens(解淀粉芽孢桿菌)、Bacillus subtilis(枯草芽孢桿菌)組成。
其中Pseudomanas sp.∶Bacillus amyloliquefaciens∶Bacillus subtilis＝4∶1∶1。
本申請(qǐng)還提供了一種利用微生物菌劑降解木質(zhì)纖維素的方法，包括以下步驟(1)將木材粉碎成木屑，在121℃下滅菌1h，冷卻后加入無菌的無機(jī)鹽營養(yǎng)液，使木屑充分濕潤；所述無機(jī)鹽營養(yǎng)液為每1L溶液中含有如下重量克數(shù)的無機(jī)鹽K2HPO41，NaH2PO41，(NH4)2SO40.5，MgSO40.2，CaCl20.1，F(xiàn)eSO40.05，MnSO40.02；(2)將微生物活化至斜面，28℃培養(yǎng)24h，將活化后的菌種轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基，28℃，300r/min培養(yǎng)24h，4000轉(zhuǎn)離心20min，冷卻干燥48h，得到各微生物干粉，然后按比例配比得微生物菌劑；
(3)接種，接種量為106個(gè)/g木屑，28℃恒溫培養(yǎng)，每隔6天定時(shí)定量補(bǔ)充無機(jī)鹽營養(yǎng)液，使其濕度維持在80％，培養(yǎng)60天后取出培養(yǎng)物，用無菌水充分洗滌后測(cè)定失重率。
本發(fā)明所述的細(xì)菌源微生物菌劑中的Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis均購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(購買證明見附件)。


圖1為微生物復(fù)合菌劑降解木質(zhì)纖維素的流程2為固體發(fā)酵條件下的木素過氧化物酶定性檢測(cè)結(jié)果圖3為三種常用造紙用木材巨尾桉(A)、加拿大楊(Y)和長白落葉松(S)降解前后的電鏡掃描4為巨尾桉、加拿大楊和長白落葉松降解前后紅外分析圖表1為巨尾桉、加拿大楊和長白落葉松降解前后元素分析結(jié)果表2為巨尾桉、加拿大楊和長白落葉松降解前后13C-NMR圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1將Pseudomanas sp.、Bacillus amyloliquefaciens與Bacillus subtilis活化至斜面，28℃培養(yǎng)24h，將活化后的各菌種轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基，28℃，200r/min培養(yǎng)24h，4000轉(zhuǎn)離心20min，冷凍干燥48h得到各微生物干粉，各種微生物之間的生物量(g/L)配比為Pseudomanas sp.∶Bacillus amyloliquefaciens∶Bacillus subtilis＝4∶1∶1；得微生物菌劑。
實(shí)施例2將微生物菌劑接種接種木屑，接種量為106個(gè)/g木屑，28℃恒溫培養(yǎng)，每隔6天定時(shí)定量補(bǔ)充無機(jī)鹽營養(yǎng)液(K2HPO41；NaH2PO41；(NH4)2SO40.5；MgSO40.2；CaCl20.1；FeSO40.05；MnSO40.02[g/L])，使其濕度維持在80％，培養(yǎng)60天后取出培養(yǎng)物，用無菌水充分洗滌。
實(shí)施例3方法同上，采用失重法測(cè)定巨尾桉、加拿大楊和長白落葉松三種常用造紙的降解率分別為7.58％、17.15％和26.75％。并進(jìn)一步采用掃描電鏡、元素分析、固相核磁掃描、紅外掃描等手段對(duì)降解前后的樣品進(jìn)行分析，證實(shí)了木質(zhì)纖維素的降解。
表1

表2

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)采用細(xì)菌源微生物菌劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的白腐真菌進(jìn)行固體發(fā)酵，微生物生長迅速，易于培養(yǎng)，產(chǎn)酶時(shí)間短，對(duì)軟木的降解效果由于目前已知的報(bào)道，易于擴(kuò)大化生產(chǎn)。具體如下1、微生物易于培養(yǎng)，液體發(fā)酵24h即可獲得大量的菌體，縮短了種子的發(fā)酵周期。
2、固體發(fā)酵過程中，對(duì)我國南北方常用造紙用木材都有一定的降解效果，尤其對(duì)軟木的降解率明顯優(yōu)于目前已知的報(bào)道，且對(duì)木質(zhì)素的降解效果由于對(duì)纖維素、半纖維素的降解效果。
3、發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，制得的細(xì)菌源微生物菌劑在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用過程中，操作方便，成本低廉。
權(quán)利要求
1.一種降解木質(zhì)纖維素的微生物菌劑，其特征在于是由Pseudomanas sp.、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解木質(zhì)纖維素的微生物菌劑，其特征在于Pseudomanas sp.∶Bacillus amyloliquefaciens∶Bacillus subtilis＝4∶1∶1。
3.一種利用權(quán)利要求1或2的微生物菌劑降解木質(zhì)纖維素的方法，其特征在于(1)將木材粉碎成木屑，在121℃下滅菌1h，冷卻后加入無菌的無機(jī)鹽營養(yǎng)液，使木屑充分濕潤；所述無機(jī)鹽營養(yǎng)液為每1L溶液中含有如下重量克數(shù)的無機(jī)鹽K2HPO41，NaH2PO41，(NH4)2SO40.5，MgSO40.2，CaCl20.1，F(xiàn)eSO40.05，MnSO40.02；(2)將微生物活化至斜面，28℃培養(yǎng)24h，將活化后的菌種轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基，28℃，300r/min培養(yǎng)24h，4000轉(zhuǎn)離心20min，冷卻干燥48h，得到各微生物干粉，然后按比例配比得微生物菌劑；(3)接種，接種量為106個(gè)/g木屑，28℃恒溫培養(yǎng)，每隔6天定時(shí)定量補(bǔ)充無機(jī)鹽營養(yǎng)液，使其濕度維持在80％，培養(yǎng)60天后取出培養(yǎng)物，用無菌水充分洗滌烘干后測(cè)定失重率。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降解木質(zhì)纖維素的微生物菌劑及利用其降解木質(zhì)纖維素的方法。它是由Pseudomanas sp.、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis組成。本發(fā)明的特點(diǎn)是對(duì)巨尾桉、加拿大楊和長白落葉松三種常用造紙用木材在28℃、固體發(fā)酵60天，其降解率分別為7.58％、17.15％和26.75％。對(duì)軟木的降解效果明顯優(yōu)于已知的木材腐朽菌。掃描電鏡、元素分析、固相核磁掃描、紅外掃描等手段對(duì)降解前后的樣品進(jìn)行分析，進(jìn)一步證實(shí)了木質(zhì)纖維素發(fā)生了明顯的降解。降解后樣品結(jié)構(gòu)變疏松，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素結(jié)構(gòu)都被不同程度的降解，且木質(zhì)素被降解的程度最高。PAGE活性染色結(jié)果顯示，固體發(fā)酵條件下，產(chǎn)生高的木素過氧化物酶活性。
文檔編號(hào)D21C5/00GK1928074SQ20061010941
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2006年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月14日
發(fā)明者楊金水, 倪晉仁 申請(qǐng)人:北京大學(xué)